Summary
Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.
Abstract
Nosso laboratório tem demonstrado recentemente que natural killer (NK) são capazes de erradicar GL26 rato ortotopicamente implantado e rato CNS-1 gliomas malignos logo após o enxerto intracraniana se as células cancerosas se tornam deficientes em sua expressão da galectina lectina β-galactoside de ligação -1 (Gal-1). Um trabalho mais recente mostra agora que uma população de células mielóides + / CD11b + GR-1 é essencial para este efeito. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais NK e células mielóides cooperam para conferir rejeição tumoral Gal-1 deficiente em temos desenvolvido um protocolo detalhado para o isolamento e análise de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma (PBMC). O método é demonstrado aqui pela comparação PBMC infiltração no microambiente tumoral de Gal-1 que expressam GL26 gliomas com aqueles preparados Gal-1-deficiente através shRNA knockdown. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura e preparar GL26 cells para inoculação no sing�ico C57BL / 6J cérebro do rato. Em seguida, explica as etapas envolvidas no isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMCs infiltrantes glioma do microambiente do tumor cerebral precoce. O método é adaptável a um número de modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. O método é sensível e altamente reprodutível, como PBMCs infiltrantes glioma pode ser isolado a partir de tumores intracranianos, logo que 24 hr pós-enxerto de tumor com contagens de células semelhantes observadas em tumores de pontos de tempo ao longo combinado experiências independentes. Uma única experimentalista pode executar o método de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. Modelos de glioma alternativos e / ou de detecção de anticorpos específicos de células também podem ser utilizados à discrição dos experimentalistas para avaliar a infiltração de vários outros Immune tipos de células de interesse, sem a necessidade de alterações no procedimento geral.
Introduction
Os gliomas são uma classe de cancros cerebrais gliais que derivam de células gliais transformadas dentro do sistema nervoso central (SNC). De todos os gliomas, Organização Mundial da Saúde (OMS) glioma grau IV ou glioblastoma (GBM), é o mais comum e letal 1. GBM é altamente refractário ao tratamento padrão-de-curso que consiste na ressecção do tumor na medida do possível, seguida por radiação, mais quimioterapia concomitante e adjuvante com temozolomida 2. Estes cancros mortais transportar um prognóstico sombrio de apenas 15-18 meses de sobrevivência a partir do momento do diagnóstico inicial com apenas 5% dos pacientes que sobrevivem a doença depois de 5 anos 3.
A presença da barreira hematoencefálica (BHE), a falta de células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs), e a existência de estruturas previamente não identificado linfáticos bona fide dentro do cérebro 4 conduziram à noção de GBM como imune privilegiada. No entanto, numerosos estudos agora shoW que estes cancros cerebrais, de facto geram o recrutamento de células imunitárias periféricas que são predominantemente de origem mielóide, que incluem monócitos, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) 5. GBM também influencia a atividade de microglia cérebro-residente para se tornar pró-tumorigenic 6,7. As células linfóides, tais como as células T CD8 + 8 e células CD56 + assassinas naturais 9 também estão presentes dentro do microambiente do tumor, mas em muito menor número, um facto provavelmente devido à função imunossupressora instigada por factores derivadas de glioma em macrófagos associados a tumores ( TAM) 10. Células T CD4 + também estão presentes no GBM, mas grande parte dessa população também expressa CD25 e FoxP3, fabricantes de imunossupressora T reguladoras (reg T) as células 11. O estado imunossupressora total do GBM culmina com a promoção da fuga imunológica e progressão tumoral 12.
13-19. O culminar deste trabalho tem levado a um ensaio clínico destinado a avaliar um citotóxico combinada e terapêutica imuno-estimulante para os pacientes com diagnóstico recente de GBM (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01811992).
O nosso trabalho mais recente mostra que o GL26 de ratinho e rato de CNS-1 células GBM bloquear antitumoral vigilância imunitária das células NK através da produção de grandes quantidades de a lectina de ligação a β-galactósido galectina-1 (Gal-1) 20. Isto foi demonstrado através da supressão da expressão de Gal-1 em células de glioma de knockdown utilizando shRNA gene mediada. In vitro experiments mostraram que as células de glioma Gal-1 deficiente proliferaram normalmente na cultura, no entanto, sofreu rejeição rápida logo após o enxerto intracraniana em sing�ico C57BL / 6J ou RAG1 - / - ratos, estabelecendo assim a independência do T ou células B sobre esta forma de rejeição de tumor. Imunodepleção de células NK com anticorpos anti-asialo GM-1 anti soro ou anticorpos monoclonais NK1.1 conduziram à recuperação completa do crescimento de glioma Gal-1-deficiente intracraniana, estabelecendo o papel das células NK em Gal-1-deficiente rejeição glioma. Mostramos agora que imunodepleção de células mielóides Gr-1 + / CD11b + é suficiente para impedir que o glioma rejeição Gal-1-deficiente apesar da presença de células NK, revelando assim um papel auxiliar indispensável para células mielóides no favorecimento de Gal NK mediada lise tumoral -1 com deficiência (dados não publicados). Este resultado inesperado nos levou a desenvolver um protocolo abrangente para o isolamento e análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), queinfiltrar no microambiente do tumor cerebral logo após o enxerto intracraniana para que possamos melhor caracterizar os eventos de infiltração do sistema imunológico que predicado glioma rejeição gal-1-deficiente.
O método é demonstrado aqui, usando células de glioma do rato GL26 que a proteína fluorescente mCitrine constitutivamente expresso, chamado GL26-Cit, que permitem a visualização de células tumorais direta por microscopia de fluorescência 21. Estas células são enxertados estereotacticamente no cérebro de singeneicos C57BL / 6J e são deixadas a crescer durante 24, 48, ou 72 horas antes do rato eutanásia. PBMC infiltrantes de glioma são então isolados e immunolabeled usando anti -CD45, -GR-1, -CD11b -NK1.1 e anticorpos de superfície da célula, juntamente com imunomarcação intracelular para a granzima B (GzmB). Esta combinação específica de anticorpos permite a identificação de Gr-1 + / + CD11b células mielóides infiltrantes tumorais e NK1.1 +, células NK, os tipos de células que temos been implicados na rejeição de tumor Gal-1-deficiente. O perfil imunológico infiltração de Gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, referido aqui como GL26-Cit-gal1i, é então comparada com a de gliomas que expressam níveis normais de Gal-1 chamado GL26-Cit-NT que contêm uma não- segmentação controle hairpin shRNA. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura de células de glioma GL26-Cit in vitro, que é seguido por uma explicação sobre como ortotopicamente enxertar essas células para o corpo estriado de sing�icos camundongos C57BL / 6J. Em seguida, prossegue para enumerar as etapas envolvidas no isolamento e imunomarcação de PBMCs infiltrantes de glioma para análise de citometria de fluxo. O protocolo termina com uma explicação de análise de dados padrão e representação gráfica.
A demonstração revela que tanto a Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 + preferencialmente se acumular dentro do microambiente do tumor cerebral Gal-1-deficiente dentro 48hr de implantação do tumor, um resultado que ajuda a explicar por que esses tumores rapidamente sofrer lise tumoral completa aproximadamente 1 semana enxerto pós-tumoral 20. O método é facilmente adaptável a um número de diferentes modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. Uma única experimentalista podem executar o protocolo de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. O método pode também ser combinado com experiências destinadas para caracterizar o perfil de PBMCs em circulação em ratinhos portadores de tumor em comparação com aqueles que se infiltrar no cérebro, de forma a identificar os fenótipos imunossupressão especificamente induzidas pelo microambiente do tumor. Aplicação desta e de semelhantes métodos deverá facilitar uma melhor compreensão dos fatores envolvidos no tráfico de células imunes periféricas no microambiente do tumor cerebral.
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Protocol
Nota: Por favor, leia todo o protocolo antes de realizar experimentos. Aprovação para o uso de animais vertebrados do comitê institucional adequado sobre o uso e bem-estar dos animais deve ser obtido antes de prosseguir.
1. Preparação de células tumorais para intracraniana Enxerto
- Trabalhando numa câmara de segurança biológica de classe II, começar por preparar GL26 Cit-NT-/ gal1i meios de cultura celular, completando um frasco de 500 ml de Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de bovino estéril-filtrada inactivado pelo calor (FBS ), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 600 ug / ml de sulfato de G418 (para selecção do vector de expressão mCitrine) e 3 ug / ml de dicloridrato de puromicina (para selecção do não- segmentação ou shRNAs-1 específicos-gal).
- Cultura células GL26-Cit-gal1i GL26-Cit-NT e / ou (Figura 1A e 1B 2 durante 1-2 dias antes do procedimento de enxerto do tumor, ou até os frascos atingir 50-80% de confluência.
- No dia da cirurgia, remover o meio de cultura celular a partir de células de glioma utilizando uma pipeta de 10 mL serológica e uma pistola de pipeta e descartar os meios para um copo de resíduos.
- Inverta o frasco top-side-down e adicione 10 ml de DPBS a parte de cima do frasco de 10 ml usando uma pipeta sorológica. Lentamente inverter o frasco para cobrir as células em DPBS, então ponta do frasco verticalmente e remover e descartar as DPBS para um copo de resíduos.
- Adicionar 3-4 ml de tripsina alternativa não-mamífero em DPBS com EDTA (ver lista de materiais para mais detalhes) a cada frasco de cultura de tecidos T75 e coloque de volta no tecido gabinete de cultura para 2-5 min. Usando um microscópio de campo brilhante, verifique se todas as células têm se soltou da superfície de fundo antes de prosseguir.
- Inibir furtheR actividade enzimática por diluição de tripsina a alternativa com 6 ml de DPBS. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml serológico para enxaguar a superfície de fundo do frasco e para dissociar quaisquer agregados celulares mecanicamente. Aspirar as células e coloque em rotulados respectivamente 15 ml tubos de centrífuga. Rodar as células a 550 xg para baixo (no máximo RCF) durante 5 min a 4 ° C (Figura 1C).
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células cuidadosamente com 1 ml de DMEM suplementado com un. Certifique-se de pipeta as células cima e para baixo cuidadosamente com uma micropipeta P-1000 para alcançar uma suspensão única célula.
- Fazer uma diluição da suspensão de células resultante em 1,6 01:10 gerado colocando 18 ul de DMEM suplementado com un num microtubo de polipropileno de 0,6 ml cónico seguido pela adição de 2 ul de suspensão de células de tumor. Pipeta cima e para baixo usando um P-10 micropipeta para homogeneizar as células completamente.
- Adicionar 10 ul &# 160; da diluição 1:10 de células de tumor gerados em 1,7 a 0,6 ml separados um microtubo de polipropileno cónico, em seguida, adicionam-se 10 ul de mancha azul de tripano no tubo. Misturar bem com um P-10 micropipeta e adicionar 10 uL da / de azul tripano de células de tumor resultante, sob uma lamela de cobertura de vidro colocada no topo de um hemocitómetro tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar (Figura 1D).
- Contar as células com um microscópio de campo brilhante com uma objectiva 10X de acordo com o protocolo específico associado com o dado hemocitómetro. Certifique-se de levar em consideração a diluição de 20 vezes da suspensão de células do tumor original feito durante a preparação das células para células estimativa exacta do original em aliquota de 1 ml. Utilize a seguinte fórmula para calcular o número total de células: células totais / ml = [((Σcells contadas por metro quadrado) / # de quadrados contados) x 20 (ou seja, factor de diluição) x 10.000 células / mL].
- Depois determining o número total de células para cada linha de células utilizada na experiência dada, colocá-los para baixo a 550 xg (RCF max) durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante (S) e ressuspender as células com um volume adequado de completada-un DMEM de modo a atingir uma concentração alvo de 3 x 10 4 células por 1 ul de cada linha celular de acordo com a seguinte fórmula: (# total de células / 30.000).
- Coloque um volume equivalente de cada linha celular em respectivamente rotulados 0,6 ml tubos de polipropileno cónicos e colocar no gelo (Figura 1E). Certifique-se de salvar algumas células para continuar propagando cada linha celular se T75s separadas não foram previamente semeados.
2. Procedimento para a estereotáxica enxerto de células de glioma no corpo estriado de ratos C57BL / 6J
- Preparar soluções de anestesia cirúrgica, a analgesia, a anestesia e a inversão de trabalho antes da cirurgia como se segue:
- Para cetamina / s dexmedetomidinaanestesia urgical: remover 1,4 ml a partir de um frasco de solução estéril a 0,9% de injecção de NaCl 10 mL e substituir com 600 ul de uma solução stock de 100 mg / ml de cloridrato de cetamina e 800 ul de uma solução de estoque de 0,5 mg / ml de cloridrato de dexmedetomidina para se obter um Solução de trabalho de mistura de cloridrato de cetamina (6 mg / ml) e cloridrato de dexmedetomidina (0,04 mg / mL).
- Para a buprenorfina analgesia: Remover 1 ml de um frasco de 10 ml de solução estéril de NaCl a 0,9% injecção e substituir com o volume total de 1 ml de uma única de 0,3 mg / ml de cloridrato de ampola da buprenorfina, para se obter um / ml de solução de trabalho de 0,03 mg.
- Para atipamezol reversão anestesia cirúrgica: Remover 1 ml de um frasco de 10 ml de solução estéril de NaCl a 0,9% injecção e substitua por 1 ml de uma solução estoque de 5 mg / ml de cloridrato de atipamezol, para se obter um / ml de solução de trabalho de 0,5 mg.
- Trabalhando em um local aprovado para a sobrevivência do mouse surgery, começar por criação de instrumentos cirúrgicos autoclavada ou grânulos esterilizados e outros reagentes como mostrado na (Figura 2A), em seguida, obter suficiente 8-10 semanas de idade, fêmea C57BL / 6J (singeneicos com GL26 glioma) necessária para o estudo; assegurar o seu contínuo acesso a comida e água.
- Anestesiar o primeiro rato com uma única injecção intraperitoneal (ip) a solução de injecção de anestesia de trabalho, fornecendo uma dose de 75 mg / kg de cetamina e 0,5 mg / kg de dexmedetomidina (aproximadamente 250 ul de um rato de 20 g). A seguir, dar um / kg por via subcutânea (sc) de injecção de 5 mg de carprofeno (aproximadamente 100 ul de um rato de 20 g). Certifique-se de que o mouse não responde aos pés e cauda pitadas antes de prosseguir.
- Usando cortadores cirúrgicos, raspar a pele do crânio. Aplicar solução antisséptica de iodo-povidona para a área raspada, esfregue com uma almofada prep álcool isopropílico 70%, em seguida, voltar a aplicar solução antisséptica de iodo-povidona. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de sterile petrolato pomada oftálmica a cada olho para evitar a secagem.
- Fixar o crânio no quadro estereotáxico de acordo com o protocolo seguinte:
- Abra cuidadosamente a boca, chegando com um par de fórceps de dissecação curvas para puxar delicadamente para fora a língua e ir para um lado da boca para evitar asfixia. Permitir a pinça para retirar enquanto na boca para espalhar a mandíbula aberta e orientar os dois incisivos superiores no buraco da fechadura do porta-dentes no quadro estereotáxico. Fixe a barra de dentes de rodar horizontalmente ou verticalmente, ajustando os respectivos parafusos. Certifique-se que o crânio do rato é o nível com o topo da bancada.
- Coloque as barras de ouvido de forma segura contra as postorbital ossos do crânio tomando cuidado para não aplicar demasiada pressão para dentro sobre o crânio, a fim de evitar o esmagamento.
- Coloque a barra de nariz sobre o focinho e aperte até confortável. Verifique se não há nenhum movimento vertical / lateral na cabeça, aplicando uma leve pressãocom um polegar eo dedo indicador. Um rato adequadamente colocado numa moldura estereotáxica é mostrado na (Figura 2B).
- Usando uma lâmina de bisturi, fazer uma incisão na linha média 1 centímetro ao longo do crânio do osso frontal até o osso occipital. Retrair a pele na incisão com afastadores Colibri.
- Diminuir a seringa microlitro equipada com uma agulha de 33 G ligada ao braço vertical da armação estereotáxica directamente por cima da posição da bregma (Figura 2C). A partir daí, ajustar a posição da agulha de 0,5 mm de AP, +2,5 mm ML para chegar ao local-alvo para a implantação do tumor. Use uma seringa de tuberculina 1 ml equipado com uma agulha G 26 para marcar este local por excoriating suavemente o periósteo.
- Faça um furo no crânio no local de destino até chegar a dura-máter subjacente usando uma furadeira sem fio de precisão equipado com uma "(0,8 mm) bit 1/32. Durante a perfuração, aplicar pressão intermitente seguido por remoção do DRILL pouco a partir da superfície do crânio para evitar excesso de calor e força que pode de outra forma conduzir à broca de perfuração perfurando o tecido do cérebro subjacente.
- Lave a seringa microlitro com NaCl a 0,9% em 1,7 ml de um microtubo de polipropileno cónico para assegurar que a agulha não se encontra obstruído. Agite suavemente o microtubo de polipropileno de 0,6 ml cónico contendo as células tumorais várias vezes para voltar a suspender as células.
- Retirar 2 ul de células para dentro da seringa microlitro assegurar que não há bolhas de ar são introduzidos para dentro da seringa. Dispensar 1 ml de células para uma preparação almofada álcool isopropílico a 70% deixando exactamente 1 mL de células tumorais remanescentes na seringa.
- Traga a agulha para baixo até que toque a dura-máter, em seguida, introduzir a agulha no cérebro -3.5 mm ventralmente e retrair por 0,5 milímetros. Lentamente e entregar as células suavemente, pressionando o êmbolo da seringa ao longo de 1-2 min.
- Permitir que as células Settle no local de injecção durante 5 min antes de retirar a agulha lentamente. Limpe todo o sangue coagulado ou matéria do cérebro a partir da ponta da agulha com 70% de álcool isopropílico prep pad limpo. Lavar a agulha e seringa cuidadosamente com NaCl a 0,9% a partir do passo 2.6 para assegurar que a agulha não está entupido para a próxima injecção.
- Remova os retratores Colibri e suturar o couro cabeludo usando três 3-0 suturas monofilamento de nylon. Remover o rato a partir da moldura estereotáxica e administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina cloridrato por via subcutânea (SC) (aproximadamente 67 ul da mL / solução de trabalho de 0,03 mg a cerca de 20 g de rato), seguido por 2,5 mg / kg de atipamezol cloridrato por via intramuscular (im) (aproximadamente 100 ul da / ml, solução de trabalho de 0,5 mg para um ratinho de 20 g) para alívio da dor pós-operatória e anestesia reversão. Coloque ratos pós-cirúrgicos de volta em suas gaiolas sob uma lâmpada de aquecimento para se recuperar.
3. Rato transcardial Perfusion e colheita do Cérebro
- Preparar a solução de Tyrode heparinizada de acordo com o protocolo seguinte:
- Coloque uma barra de agitação magnética em uma tampa de rosca garrafa de armazenamento 1 L de vidro e encher o volume com água deionizada ultrapura. Coloque a garrafa em uma placa de agitação.
- Pesar e adicionar os seguintes produtos químicos para o frasco de vidro, enquanto se agitava: cloreto de sódio 8 g (NaCl), cloreto de cálcio 0,264 g (CaCl2 • 2H 2 O), 0,05 g de fosfato monobásico de sódio (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 g de D-glucose (C 6 H 12 O 6), bicarbonato de 1,0 g de sódio (NaHCO3), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl). Permitir que os sais para dissolver e depois adicionar 100 ul de uma solução de estoque 1,000U / ml de heparina de sódio para a solução de Tyrode.
- Retirar o recipiente da placa de agitação e extrai-se a barra de agitação magnética utilizando uma varinha. Armazenar solução heparinizada de Tyrode a 4° C.
- Preparar uma solução de trabalho para a anestesia terminal como se segue:
- Para anestesia terminal de cetamina / xilazina: remover 1.360 uL a partir de um frasco de solução estéril a 0,9% de injecção de NaCl 10 mL e substituir com 1200 uL de uma solução stock de 100 mg / ml de cloridrato de cetamina e 160 ul de uma solução stock de 100 mg / ml de xilazina cloridrato, para se obter uma solução mista de trabalho de cloridrato de cetamina (12 mg / ml) e cloridrato de xilazina (1,6 mg / mL).
- Preparar a solução de mistura de meios de centrifugação de densidade através da colocação de 90 mL de PBS 10x em 264 ml de água ultrapura desionizada (3.93x) num recipiente de plástico estéril. Titula-se até pH 7,0-7,2 com HCl e filtra-se através de um filtro de esterilização de 0,22 um. Armazenar a 4 ° C.
- Preparar 70% de meio de centrifugação de densidade através da combinação de 18 ml de solução de mistura de meios de centrifugação de densidade com 30 ml de meio de centrifugação de densidade (ver lista de materiaispara mais detalhes) num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno. Armazenar a 4 ° C, mas trazer para RT antes do uso.
- Preparar 37% de meio de centrifugação de densidade através da combinação de 9,6 ml de DPBS com 10,4 ml de 70% de meio de centrifugação de densidade num tubo de centrifugação de 50 ml. Armazenar a 4 ° C, mas trazer para RT antes do uso.
- Preparar tampão de fluxo, colocando 500 mL de FBS em 50 ml de DPBS (~ 1% de FBS) em um tubo de centrífuga de 50 ml. Guarde-o em armazenar a 4 ° C
- Encha um balde de poliuretano 4,5 L de gelo de capacidade com lascas de gelo.
- Adicione uma solução combinada de 1 mg / ml de colagenase e de 1 mg / ml de DNase-I em quantidade suficiente para 1 ml para cada amostra de cérebro no estudo por diluição de um / ml de solução de estoque de 10 mg de ADNase I-01:10 e 50 mg / ml solução estoque colagenase 01:50 com DPBS estéril em uma única 15 ml tubo de centrífuga de polipropileno. Misture suavemente a solução pipetando cima e para baixo com uma micropipeta P-1000. Armazene no gelo no polyurethbalde ane a partir do passo 3.7.
- Obter duas 7 ml de vidro moedores de tecido Dounce. Rotular um "NT" eo outro "gal1i". Coloque os moedores de tecido no balde de gelo e adicionar 1 ml de DPBS a cada um.
- Obter o suficiente tubos de 15 ml de centrífuga para recolher matéria do cérebro de cada rato no estudo e coloque no balde de gelo.
- Coloque ~ 150 ml de DPBS entre três tubos de centrífuga de 50 ml para o balde de gelo.
- Obter o suficiente hexagonais poliestireno cápsulas (diâmetro interno superior (ID) 115 milímetros, ID base de 85 milímetros, 203 ml de volume) para cada rato no estudo. O set-up completo para dissecção e trituração de cérebro do rato é mostrado na (Figura 3A)
- Em pontos de tempo seleccionados, anestesiar o primeiro ratinho portador de tumor no estudo usando um única injecção IP de 150 mg / kg de cloridrato de cetamina e 20 mg / kg de cloridrato de xilazina (aproximadamente 250 ul de 12 mg / cetamina combinado ml / 1,6 mg / ml xilazina solução de trabalho para a 20 g mouse) para induzir a anestesia profunda. Certifique-se de que o mouse é a não-resposta aos pés e cauda pitadas antes de prosseguir.
- Recuperar a solução de Tyrode previamente preparado e coloque em uma câmara de fluxo laminar dedicada a procedimentos cirúrgicos em animais terminal. Coloque gás impermeável tubulação polimérica ligada a um tanque carbogénio em solução de Tyrode. Abrir a válvula do tanque para permitir que 95% de O2 / 5% de CO 2 carbogénio continuamente a bolha na solução.
- Coloque uma agulha romba 20 do cubo de alumínio G para o final do tubo de gás impermeável polimérica adicional ligado a uma bomba peristáltica. Colocar o tubo na outra extremidade da bomba peristáltica em solução de Tyrode e ligar a bomba para permitir que o tubo para encher com solução oxigenada de Tyrode e heparinizado. O setup para rato transcardial perfusão é mostrado na (Figura 3B).
- Usando quatro agulhas de 26 G, o pino para baixoo rato anestesiado lado ventral pela frente e patas traseiras em um bloco de espuma de poliestireno extrudido coberta com uma toalha absorvente disposição na capela de fluxo laminar.
- Agarrar a pele por cima da cavidade peritoneal usando um par de fórceps de dissecção romba, e utilizando uma grande par de tesouras de dissecação fazer uma incisão "Y", penetrando a parede peritoneal, cortando cefalicamente para perfurar o diafragma, em seguida, bifurcando no esterno para terminar a axila esquerda e direita.
- Use uma pinça hemostática para prender o esterno e refletem a caixa torácica sobre o ombro esquerdo do mouse. Remover o pericárdio com o par de fórceps de dissecção romba.
- Ligar a bomba peristáltica para iniciar um gotejamento constante de solução oxigenada de Tyrode e heparinizado (aproximadamente 2,3-2,5 ml / min).
- Inserir a agulha romba para o ventrículo esquerdo do coração. Use um pequeno par de tesouras de dissecação para cortar o átrio direito para permitir a sangria (Figura3C).
- Permitir que a solução de Tyrode para perfundir completamente o sistema circulatório do rato até que o fígado e os pulmões foram completamente branqueadas, devido à falta de sangue. Certifique-se de que não há quantias brutas de sangue continuam a sair do átrio direito antes de remover a agulha romba 20 hub de alumínio G do ventrículo esquerdo.
- Desafixar o rato do bloco de espuma de poliestireno extrudido e vire o lado ventral do rato para baixo. Usando um grande par de tesouras de dissecação, separar a cabeça do resto do corpo, ao nível do colo.
- Usando um pequeno par de tesouras de dissecação, cortados no couro cabeludo na linha média começando no osso occipital que trabalha para a frente para o focinho, a fim de expor o crânio.
- Retrair a pele de ambos os lados do crânio usando um dedo polegar e indicador e segurar firmemente o crânio. Use um par de Rongeurs osso para romper o crânio que começa no osso occipital e trabalhar para a frente para expor completamente a dorsal e lateralsuperfícies do cérebro. Tenha cuidado para minimizar os danos ao cérebro.
- Uma vez que os ossos cranianos foram removidos, virar a cabeça do rato lado ventral para cima e usar um pequeno par de tesouras de dissecação para cortar os nervos cranianos na base do cérebro, de modo a libertá-la do crânio.
4. Isolamento de PBMC infiltrantes Glioma
- Usando uma lâmina de barbear afiada único limpo, de isolar a área do cérebro contendo o tumor por meio de corte sagital para baixo do centro do cérebro para bissectar os dois hemisférios. Ligue o lado medial do hemisfério ipsilateral para baixo e fazer dois cortes coronais em nível do cerebelo e do bolbo olfactivo para isolar o tecido alvo contendo o implante do tumor (Figura 4A). Uma quantidade equivalente do hemisfério contralateral também pode ser isolado e utilizado como um controlo negativo.
- Coloque o tecido alvo para o triturador de tecidos respectivamente rotulados de vidro Dounce contendo 1 ml; de DPBS, empurre o êmbolo todo o caminho e torção 7 vezes a inicialmente comprometer o tecido. Levantar o êmbolo para permitir que o líquido de volta para assentar no fundo do moinho de tecidos. Repita este passo três vezes; no entanto, apenas torcer o êmbolo 4 vezes durante as próximas duas repetições e 3 vezes durante a última repetição para evitar o excesso triturando o tecido.
- Usando uma micropipeta, P-1000, aplicam-se sequencialmente três volumes de 1 mL de DPBS gelado (preparadas de 3,11) ao longo dos lados do êmbolo para enxaguar no triturador de tecidos.
- Ressuspender o assunto cérebro triturado por pipetagem cima e para baixo e coloque em um tubo de 15 ml de centrífuga rotulado no gelo. Lavar as paredes do moinho de tecidos Dounce com 1 ml adicionais de DPBS arrefecido com gelo e adicionar à mesma 15 ml tubo de centrífuga. Mantenha todos os tubos contendo matéria cerebral triturado em gelo até que todas as amostras foram processadas.
- Repita os passos 4,1-4,4 e 3,13-3,25 para cada ratinho em estudo.
- Uma vez que todas as amostras have sido processado, girar o assunto cérebro triturado em 15 ml tubos de centrifugação a 740 xg (max RCF) por 20 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante com uma pipeta e pipeta de arma 10 ml serológica e ressuspender a matéria do cérebro sedimentadas em 1 ml de colagenase / previamente preparada ADNase-I enzimas digestivas usando um P-1000. Colocar os tubos de centrífuga de 15 ml em um suporte para tubos de ensaio e colocar num banho de água a 37 C ° durante 15 min.
- Agitar suavemente as amostras duas vezes ao longo do período de incubação sacudindo os tubos para facilitar a desagregação de tecido.
- Adicionar 6 ml de DPBS gelado utilizando uma pipeta de 10 ml a cada tubo serológico para diluir as enzimas digestivas. Pipeta cima e para baixo para ressuspender, e filtrar os volumes totais através de filtros de 70 um de malha de nylon estéril para novos tubos etiquetados de 15 ml de centrífuga em gelo.
- Girar a suspensão de células do cérebro para baixo a 740 xg (RCF máx) durante 20 min a 4 ° C para se obter umpelete de célula única (Figura 4B). Depois de remover os tubos de 15 ml da centrífuga colocá-los em gelo e aumentar a definição na centrífuga a cerca de 21 ° C em preparação para o próximo passo da temperatura.
- Totalmente remover o sobrenadante de cada tubo contendo as células cerebrais e, inicialmente, ressuspender as peletes em 1 ml de 70% de meio de centrifugação de densidade usando uma micropipeta P-1000. Em seguida, adicione 4 ml adicionais de 70% mídia centrifugação de densidade para cada tubo utilizando uma pipeta 10 ml sorológico. Parafuso as tampas de forma segura e homogeneizar a suspensão de células invertendo suavemente aos tubos várias vezes.
- Retire os tubos de 15 ml de centrífuga contendo células cerebrais novamente suspensas em 70% mídia centrifugação de densidade de gelo, e coloque em um rack de tubo de ensaio à temperatura ambiente. Um de cada vez, sobrepor cuidadosamente 2 ml de 37% de solução de meios de centrifugação de densidade sobre os 5 ml de 70% de meio de centrifugação de densidade com uma micropipeta P-1000 para formar ACInterface magra entre as duas camadas dos meios de centrifugação de densidade (Figura 4C).
- Usar um marcador de ponta fina para indicar a posição da interface de modo que pode ser facilmente identificado, após centrifugação, quando a diferença torna-se menos evidente.
- Girar as 15 ml tubos de centrifugação a 740 xg (max RCF) por 20 min a RT sem pausa para evitar a ruptura do interface.
- Após a centrifugação, as PBMC recolher que se acumularam na interface entre as duas camadas dos meios de centrifugação de densidade (Figura 4D) através da introdução de um P-200 micropipeta para dentro do tubo ao longo do seu lado, cuidadosamente contornando a camada lipídica.
- Uma vez que ao nível da banda de PBMC, extrair lentamente 200 ul a partir da superfície da camada média 70% de centrifugação de densidade e colocar num tubo de FACS polipropileno respectivamente rotuladas em gelo. Repetir uma vez para um volume total de 400 ul por amostra.
- Adicionar 3 ml de tampão de fluxo para cada um dos tubos de FACS contendo 400 ul de PBMC para diluir de forma suficiente a meios de centrifugação de densidade, seguida girar as células a 660 xg para baixo (RCF máx) durante 20 min a 4 ° C.
5. imunomarcação de PBMCs infiltrantes Glioma
- Antes de analisar as amostras experimentais de PBMC, realizar uma única, independente, da superfície celular experiência de controlo do isotipo para estabelecer portas de linha de base para ser associado a um conjunto de voltagens de PMT fixos dentro de um modelo de análise de dados de citometria de fluxo dedicados à avaliação de PBMCs infiltrantes de glioma de acordo com o protocolo seguinte:
- Enxertar um C57BL / 6J rato com GL26-Cit-gal1i e outro com GL26-Cit-NT de acordo com o procedimento descrito na secção 2. Depois de 72 horas de crescimento do tumor, eutanásia ambos os ratos e isolar os PBMC-se infiltram no tumor de acordo com os procedimentos delineado ao longo seções 3 e 4.
- Combine as duas amostras de PBMC (NT umND gal1i) em um volume (isto é, 100 ul), em seguida, adicionalmente dividir a amostra uniformemente entre três tubos de FACS (ou seja, 33,3 uL por tubo) marcado "isotipo CD45", "Gr-1 / CD11b isotipo", e "NK1. 1 isotipo ". Adicionar os seguintes anticorpos (cada um a uma diluição 1: 100 e diluída para um volume total de 200 ul em tampão de fluxo) aos tubos de FACS respectivamente rotuladas: "CD45 isotipo": Alexa Fluor rato 700-conjugado IgG2b, κ (clone: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b isotipo": rato Alexa Fluor 700 conjugado anti-ratinho CD45 (clone: 30-F11), de rato conjugado com PE IgG2b, κ (clone: eB149 / 10H5), PerCP e / Cy5.5 IgG2b de rato conjugado a, κ (clone: RTK4530); "isotipo NK1.1": rato Alexa Fluor 700 conjugado anti-ratinho CD45 (clone: 30-F11), PE-conjugado de rato anti-Gr-1 (clone: RB6-8C5), PerCP / rato Cy5.5-conjugado anti-ratinho de CD11b (clone: M1 / 70), e actividade de APC-conjugated rato IgG2a, κ (clone: eBM2a).
- Permitir PBMC para immunolabel em gelo no escuro durante 20 min. Flick os tubos uma vez a meio do período de incubação para misture delicadamente. Lava-se com 1 ml de tampão de fluxo, girar a 660 xg (RCF máx) durante 10 min a 4 ° C e colocar cada tubo de FACS contendo as PBMCs com 200 ul de tampão de fluxo.
- Usando um citômetro de fluxo equipado com um 85 um bocal integrado, analisar a "CD45 isótipo" tubo primeiro a estabelecer uma base CD45 portão intervalo. Em seguida, execute o "Gr-1 / CD11b isótipo" tubo para estabelecer uma base Gr-1 / CD11b portão quadrante usando apenas as células CD45 + verdadeiros como entrada. Finalmente, execute o "NK1.1 isótipo" tubo para estabelecer uma NK1.1 portão intervalo de linha de base usando apenas verdadeiro CD45 + / Gr-1 células de baixa / CD11b +/- como entrada.
- Use o seguinte procedimento para todas as futuras experimentalANÁLISE:
- Adicione uma quantidade suficiente de uma diluição 1: 100 de anticorpos de superfície celular em tampão de fluxo para atingir um volume de 200 ul por amostra (mais 1 para o isotipo GzmB): Alexa Fluor rato 700-conjugado anti-ratinho CD45 (clone: 30-F11 ), de rato conjugado com PE anti-ratinho de Gr-1 (clone: RB6-8C5), PerCP rato / Cy5.5-conjugado anti-ratinho de CD11b (clone: M1 / 70), anti-ratinho de rato NK1.1 APC conjugada (clone: PK136).
- Cuidadosamente remover o sobrenadante das PBMC centrifugadas a partir de 4,15 até o menisco é um pouco acima da parte inferior de cada tubo de FACS (~ 50 ul), para evitar perdas de células. Ressuspender as PBMC em cada tubo de FACS utilizando o tampão residual com um fluxo de P-200 e remover micropipeta (1 / # de amostras) no valor do volume de cada tubo de FACS e combinar-se num novo tubo de FACS rotulado "isotipo reunidas".
- Adicionar 200 ul da mistura de anticorpos da superfície celular preparada no ponto 5.2.1, para cada amostra de PBMC. Permitir PBMC para immunolabel em gelo no escuro durante 20 min. Flick tele tubos uma vez a meio do período de incubação para misture delicadamente.
- Lava-se com 1 ml de tampão de fluxo; girar a 660 x g (max RCF) x 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender todos os tubos de FACS contendo PBMC em 200 ul de um fixador formalina-base comercialmente disponível (ver lista de materiais para detalhes) durante 15 min em gelo no escuro. Flick os tubos uma vez a meio do período de incubação para misture delicadamente.
- Lava-se com 1 ml de um tampão 1x permeabilização / lavagem comercialmente disponível (ver lista de materiais para detalhes) e girar a 660 xg (RCF máx) durante 10 min a 4 ° C.
- Enquanto PBMC estão girando para baixo, preparar uma quantidade suficiente de uma diluição 1: 100 de anti-ratinho de rato GzmB Pacífico azul-conjugado (clone: GB11) anticorpos intracelulares em tampão de permeabilização / 1x lavagem para atingir um volume de 200 ul por amostra.
- Num tubo separado, preparar um único volume de 200? L de uma diluição de 1: 100 do Pacific Blue-conjugated IgG1, κ (clone: MOPC-21) anticorpo de controlo de isotipo.
- Ressuspender cada uma das amostras experimentais de PBMC com 200 ul da diluição de 1: 100 de anticorpos anti-ratinho GzmB e ressuspender o único tubo de FACS rotulado "isotipo reunidas" com o volume de 200 ul da diluição de 1: 100 de anticorpos do isotipo.
- Permitir que todas as amostras de PBMC para immunolabel em gelo no escuro durante 20 min. Flick os tubos uma vez a meio do período de incubação para misture delicadamente.
- Lava-se com 1 ml de tampão de fluxo; girar a 660 xg (RCF máx) durante 10 min a 4 ° C e colocar PBMC com 200 ul de tampão de fluxo para análise.
- Fluxo cytometrically analisar PBMC infiltrantes glioma usando uma tubeira integrada de 85 mm e as portas e voltagens PMT previamente estabelecidos na secção 5.1 22. Certifique-se de executar todo o volume de cada amostra no citômetro de fluxo para garantir uma comparação equitativa entre o número total de glioma-infiltPBMC de classificação em cada amostra.
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Representative Results
A estratégia de gating seguinte é usada para uma experiência típica: FSC vs. SSC-A-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. contagem → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. contagem. Gates, colocado em Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 +, em seguida, são estratificados com base na expressão GzmB (Figura 5A). Backgating células identificadas como células NK NK1.1 + e Gr-1 + / + CD11b células mielóides em nossas experiências Onto FSC vs SSC-A-Um confirma o menor tamanho linfóide das células NK e o tamanho relativamente grande de células mielóides ( Figura 5B). Arquivos de dados brutos (ie., Arquivos FCS) são analisados por citometria de fluxo comercialmente disponível software de análise de dados, tais como FlowJo.
Um total de 18 murganhos da estirpe C57BL / 6J foram utilizados para demonstrar este método. 9 (nove) foram enxertados com GL26-Cit-NT e 9 foram enxertados com GL26-Cit-gal1i no mesmo day usando número equivalente de células (3x10 4). Três ratos de cada grupo foram sacrificados aos 24, 48, e 72 horas após o enxerto de tumor. Os dados mostram que o enxerto de células de glioma de GL26-Cit-gal1i no cérebro de singeneicos C57BL / 6J rapidamente induz o recrutamento de CD45 + PBMC (Figura 6A). Com base na mistura de anticorpos específicos utilizados na demonstração de que ainda pode ser mostrado que Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 + entrar especificamente o microambiente do tumor Gal-1 deficiente no prazo 48 horas de enxerto do tumor (Figura 6B e 6C); Contudo, o número total de células mielóides infiltrantes glioma do que compensa as células NK.
Figura 1: Preparação de Células GL26-CIT para intracraniana enxerto (A.) Representante 10X de campo brilhante e micrografias de epifluorescência de GL26-Cit-NT (imagens esquerda) e células cultivadas em cultura GL26-Cit-gal1i (imagens à direita). (B) Western blot de GL26-Cit-NT (pista esquerda) e GL26-Cit-gal1i (pista da direita) ligado de células todo. Gama tubulina (γ-banheira.) É apresentado como um controlo de carga. (C) GL26-Cit pelete de células a partir de um frasco T75 confluente de cultura de tecidos de aproximadamente 50% depois da centrifugação a 550 xg (RCF max) durante 5 min a 4 ° C. (D) vista de campo claro de um hemocitómetro contendo células GL26-Cit (pontos brancos) diluída 1: 1 com azul de tripano para avaliar o número de células e viabilidade. As células devem ser> 90% viáveis para assegurar o crescimento do tumor reprodutível. Deve ser tomada a média das contagens de células das praças rotulados de 1 a 5 para aumentar a precisão da estimativa de contagem de células. Células (E) GL26-Cit ressuspensas a 3 x 10 4 células / ml em DMEM suplementado-un para impla intracranianantation. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Enxerto estereotáxica de células de glioma no estriado de camundongos C57BL / 6J (A) Disposição conjunto cirúrgico mostrando os instrumentos cirúrgicos e os reagentes necessários.. (B) Feche acima da vista de um rato C57BL / 6J aproveitado em um quadro estereotáxico com a colocação correta de agulha a 0,5 milímetros AP, 2,5 milímetros ML, e -3,0 mm DV em relação ao bregma. View (C) dorsal do crânio do rato mostrando a posição do bregma e do local de destino para o enxerto de células tumorais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Mouse transcardial Perfusão (A) reagentes necessários para dissecção, trituração, e digestão enzimática do tecido cerebral do rato. (B) Esquema dos instrumentos e reagentes requeridos para a perfusão transcardial rato com solução oxigenada de Tyrode e heparinizado de mostrados numa câmara de fluxo laminar dedicado a procedimentos cirúrgicos rato terminal. (C) Representação esquemática do coração demonstrando instrumentos adequados e posicionamentos necessários para perfusão transcardial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Isolamento de glioma infiltrantesPBMC. (A) Estratégia para a dissecação de tecido de cérebro de ratinho contendo fase inicial implantes de glioma orthotopic. O painel superior demonstra o bisection sagital do hemisfério ipsilateral longe do hemisfério contralateral. O painel inferior mostra os dois cortes coronais adicionais necessárias para isolar o tecido alvo contendo o implante do tumor (em destaque na roxo). Pelete (B) de tecido cerebral de célula única (seta branca) após a digestão enzimática, filtração através de uma malha de nylon de 70 ^ m e centrifugação. (C) devidamente derramado gradiente mídia centrifugação de densidade antes da centrifugação. A seta branca indica o interface limpa formado entre as camadas de mídia centrifugação duas densidade. (D) meios de centrifugação em gradiente de densidade após centrifugação demonstrando a camada lipídica, que se forma no topo da seta branca 37% da camada média centrifugação de densidade) e a banda de PBMC (descrito por The as linhas tracejadas pretas) na interface entre as duas camadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fluxo de Estratégia gating citométrico usado para identificar infiltrantes Glioma Gr-1 + / CD11b + células mielóides e células NK (A) Passo 1:. Células immunolabeled total isolado a partir da banda de PBMC de um gradiente de meios de centrifugação de densidade está fechado sobre a excluir detritos celulares (FSC-A menos de ~ 50 K). Passos 2 e 3: Doublet discriminação gating para filtrar os agregados celulares. Passo 4: portão CD45 para identificar as células imunológicas infiltrantes de glioma. Controle Isotype é mostrado como a silhueta cinza. Passo 5: CD45 + células estratificados com base em Gr-1 e CD11b. Controle Isotype tanto para Gr-1 e CD 11b é sobreposto sobre a trama e delimitada pelo círculo do ouro. O círculo vermelho indica células mielóides Gr-1 + / CD11b +. Passo 5 ': Gr-1 + / + CD11b células mielóides estratificados com base na expressão GzmB. Como predicado, estas células não rotular com anticorpos anti-GzmB mais de controlo de isotipo (cinza silhueta). Passo 6: Gr-1 células de baixa traçados pelo retângulo preto no Passo 5 estratificados com base na expressão NK1.1. Controle Isotype é mostrado como a silhueta cinza. Passo 6 ': células NK1.1 alta estratificados com base na expressão GzmB. Estas células de fato rotular com anticorpos anti-GzmB acima de controlo de isotipo (cinza silhueta). (B) Backgating de Gr-1 + células mielóides / CD11b + para FSC vs SSC-A-A demonstração de que as células NK têm um tamanho menor linfóide, em comparação com as Gr-1 + / + CD11b células mielóides de maiores dimensões."_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Comparação de PBMC infiltração no GL26-Cit-NT vs. microambiente do tumor GL26-Cit-gal1i ao longo dos primeiros três dias de crescimento tumor intracraniano (A) CD45 + Total de células do sistema imunológico.. (B) células mielóides CD45 + / Gr-1 + / + CD11b. (C) + CD45 + /NK1.1 células NK. Os pontos de dados a partir de PBMC isoladas de gliomas GL26-Cit-gal1i são conectados por linhas suaves, whiles as isoladas de gliomas GL26-Cit-NT são ligados por linhas tracejadas. PBMC infiltrantes de glioma de três ratinhos foram analisadas em cada tipo de tumor em cada ponto de tempo. Números associados a cada ponto de dados nas curvas de GL26-Cit-gal1i representar o fold-indução de que determinado tipo PBMC sobre GL26-Cit-NT no pós-implantação do tumor hora especificada (HPI). Os dados representam o número médio de células imunitárias contados ± o erro padrão da média (SEM). A análise estatística foi realizada por análise de 2 vias de variância. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método robusto e reprodutível para o isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMC que se infiltraram no rato precoce microambiente do tumor cerebral. As suspensões de células de glioma são gerados a uma concentração especificada pelo experimentalista que são enxertados estereotaxicamente no corpo estriado do cérebro do rato. Os ratos são então sacrificados a pontos de tempo pré-determinados especificados pelo desenho experimental e os seus cérebros são colhidas e transformadas para isolar as PBMC infiltrantes de glioma que são imunomarcadas com combinações de anticorpos primários conjugados com fluorocromo; As células são depois imunomarcadas quantificada por citometria de fluxo. Embora a manifestação aqui apresentado centra-se em pontos de tempo iniciais, PBMC infiltrantes glioma pode ser avaliada em qualquer ponto do tempo pós-tumor enxerto até rato estado moribundo. O método é altamente modular como qualquer número de combinações diferentes de anticorpos podem ser usados para examinar as células imunes de interesse including células T, células B, células NK, monócitos e macrófagos. Note-se que o protocolo foi optimizado para utilização com fêmeas C57BL / 6J com 8-10 semanas de idade. Ratos fora deste intervalo de idade pode ter alterado percentagens de PBMC circulantes, os quais podem levar a contagem de células em pontos de tempo equivalentes que não são representativos dos dados aqui apresentados. Caracterização experiências também podem ser necessários se os modelos tumorais alternativos são utilizados ou se outros do que aqueles no fundo ratos B6 são utilizados devido ao facto de que as estirpes podem diferir nos seus perfis de PBMC (Jaxpheno6; Rato Phenome base de dados; Jackson Laboratory). Condições de gênero e ambientais também podem ser fontes de disparidade entre as frequências e porcentagens PBMC.
Este método tem sido demonstrada utilizando uma combinação de anticorpos na superfície de células de quatro que permitem a detecção de Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 +, tipos de células implicados na rejeição de gal-1 deficiente em glioma. A inclusão de anticorpos intracelulares GzmB permite ainda a detecção de potencial citotóxico no subconjunto de células NK. Os resultados representativos são fornecidos para a infiltração de células imunes no início dos gliomas GL26-CIT em sing�icos C57BL / 6J que ou expressam os níveis normais de Gal-1 ou que têm níveis reduzidos devido a knockdown gene shRNA mediada. A demonstração apresenta a sensibilidade e a reprodutibilidade da técnica, mostrando que PBMC infiltrantes glioma pode ser reprodutivelmente isolado e quantificado, logo que 24 hr pós-enxerto de tumor. Além de revelar uma população de GR-1 CD11b + células infiltrantes tumorais altas / mielóides, a demonstração também revela uma população de Gr-1 int células / CD11b + cuja identidade é atualmente indefinida.; experimentos adicionais são necessários para decifrar ainda mais o caráter desta população de células. Observamos também que nós não observamos uma população facilmente distinguíveis de CD45
Os anticorpos anti-Gr-1 reconhecem ambas as proteínas de superfície celular e Ly6C Ly6G que são específicos para polimorfonucleares e mononucleares, células mielóides, respectivamente 25. O uso de anti-Gr-1 Antibods assim afastados distinção entre essas duas populações de células. Resultados preliminares em nosso laboratório estão começando agora a lançar luz sobre uma descrição mais precisa das células Gr-1 + / CD11b + precoces que se infiltram no glioma microambiente gal-1-deficiente. As experiências que incorporam anti-Ly6G (clone: 1A8) e anti-Ly6C (clone: AL-21) anticorpos em conjunto com anticorpos anti-CCR2 agora indicam que o gr-1 de células de alta / CD11b + infiltrantes do microambiente tumoral Gal-1 deficiente no início são consistentes com Ly6C alta / CCR2 elevados monócitos inflamatórios, embora experiências adicionais são necessários para confirmar este resultado (dados não mostrados).
Devido a célula perde que pode ocorrer durante os passos de centrifugação e ressuspensão repetição envolvidas no isolamento de PBMC infiltrantes glioma, é provável que as contagens de células são observadas na verdade menor que o que está realmente presente no cérebro intacto. Contudo, as diferenças entre egrupos Xperimental deve segurar se volumes equivalentes de interface meios centrifugação 37/70 densidade são extraídos e se todo o volume de cada amostra é analisada pelo citómetro de fluxo. O não cumprimento dessas medidas irão resultar em comparações injustas entre amostras e excluem a análise imparcial. A impossibilidade de quantificar o número exato de PBMC que entram no microambiente do tumor cerebral não é uma limitação específica para esse protocolo. Métodos alternativos, tais como estratégias de contagem de células imuno-histológicos também estão sujeitas a erro devido à extrapolação do número total de células com base em contagens estereológicos ea exigência de thresholding imagem equivalente em micrografias secção de tecido, que podem diferir em seu nível de coloração de fundo, levando potencialmente a falsa sinais -negative ou falso-positivos. No entanto, uma comparação da análise de curso de tempo entre os diferentes métodos de análise deve revelar-imune curvas influxo dependentes do tempo com a forma geral semelhante. Umdesvantagem adicional de métodos imuno-histoquímicos é a incapacidade de alguns anticorpos validados para citometria de fluxo para se ligar ao epitopo antigénico equivalente no contexto de secções de tecido do cérebro fixadas com formalina.
Existem algumas etapas fundamentais neste protocolo que pode servir como limitações para aqueles não familiarizados com a sua metodologia. Uma dessas medidas é a colheita do cérebro do crânio sem danificá-lo. Sugerimos praticar a técnica várias vezes antes de executar experimentos adequados. No entanto, uma vez que o cérebro acabará por ser triturado, pequenos danos às camadas superficiais do cérebro são provavelmente irrelevante para a quantificação precisa de PBMC infiltrantes de glioma. Um segundo passo que os investigadores inexperientes podem, inicialmente, encontrar difícil é o derramamento do gradiente de centrifugação de densidade media. A capacidade dos experimentalistas para formar uma interface limpa, enquanto que recobre a 2 ml de 37% de mídia de centrifugação de densidade em cima dea camada de 70% é crucial para o isolamento de PBMC reprodutível. Embora este passo pode, inicialmente, ser um desafio, enriquece vastamente para PBMCs e diminui drasticamente o período de tempo de outra forma exigido para a análise da amostra se o tecido do cérebro inteiro, onde a ser analisado fluxo cytometrically. PBMC de enriquecimento, também reduz o número total de acontecimentos captados pelo citómetro de fluxo, reduzindo, assim, os tamanhos dos arquivos .fcs e ajudar a resolver as populações de células imunitárias raras infiltrantes cerebrais. Para obter melhores resultados na criação de uma interface de centrifugação de densidade limpo recomendamos que derrama a densidade media centrifugação de 37% utilizando uma micropipeta P-1000 com ação êmbolo suave. Ângulo a 15 ml tubo de centrífuga de aproximadamente 20-30 ° acima da bancada. Colocar a ponta da micropipeta, no lado das marcações 3-5 ml tubo acima da superfície da camada média 70% de centrifugação de densidade. Derrame de forma constante e lentamente, de modo a minimizar o impulso para fora ostensiva da media 37% centrifugação de densidade, pois EXTRUdes da ponta da micropipeta, a fim de evitar a perturbação do 70% de meio de centrifugação de densidade subjacente. Por fim, o facto de que a arquitectura do tecido cerebral é necessariamente destruídos no processo de isolamento de PBMC infiltrantes glioma significa que os ratos adicionais serão necessários para obter os dados histológicos ponto de tempo correspondentes.
Mais recentes modelos de glioma gerados através da injecção do ADN de plasmídeo oncogénico para o cérebro normal de roedores têm sido desenvolvidos nos últimos anos 26-32. Estes "endógenos" modelos de tumor contornar potenciais artefatos causados por estereotaxicamente enxertando ex vivo células cancerosas e imitar mais de perto as características histológicas de glioma clínica. O método aqui descrito é bem adequado para o estudo da infiltração eventos imunitários que caracterizam estes clinicamente mais relevante sistemas modelo. Estudos sobre o influxo imune em ratinhos neonatais, também pode ser realizada utilizando este método, embora a densidade do compu neonatale cérebro é menor do que a de adultos, que podem requerer uma optimização do passo de digestão enzimática, a fim de impedir que sobre a digestão do tecido cerebral. Outras aplicações da técnica incluem investigações sobre as classes alternativas de doença inflamatória do cérebro, além de tumores malignos, tais como encefalomielite alérgica experimental (EAE) e respostas imunes a infecção viral.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 para MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01 e R21-NS082311-NS084275 a PRL; subvenções de corações felizes de Leah, da Universidade de Michigan Comprehensive Cancer Center atribuído a MGC e PRL; o Departamento de Neurocirurgia da Universidade de Michigan School of Medicine; do Instituto Michigan de Pesquisa Clínica e da Saúde, financiado pelo NIH concessão 2UL1-TR000433; a bolsa de formação Biologia da Universidade de Michigan Cancer financiado pelo NIH / NCI (National Cancer Institute) concessão T32-CA009676; da Universidade de Michigan Treinamento em clínica e básica Neuroscience suportado pelo NIH / NINDS conceder T32-NS007222; e da Universidade de Programa de Formação Médica Cientista Michigan financiado pelo NIH / NIGMS (Instituto Nacional de Medicina Ciências Gerais) conceder T32-GM007863. Os autores de umre grato pela liderança acadêmica e apoio recebido do Dr. Karin Muraszko e do Departamento de Neurocirurgia; a M. Dahlgren, D. tomford, e S. Napolitan para apoio administrativo soberba; a M. Dzaman para a assistência técnica excelente; e Phil F. Jenkins para apoio generoso para a compra de um Microscópio Eletrônico de Varredura Zeiss 3D. Reconhecemos também o laboratório Kuchroo na Harvard Medical School a partir do qual uma versão modificada da estratégia mediada por meios centrifugação de densidade para isolamento de células mononucleares do cérebro foi desenhado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
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