Summary
Le cil primaire est fondamentalement important dans la prolifération des cellules progénitrices de neurones, la différenciation neuronale et la fonction neuronale adulte. Nous décrivons ici une méthode pour étudier ciliogenèse et la traite des protéines de signalisation dans les cellules à cilia souches / progénitrices de neurones et les neurones différenciés en utilisant des cultures de neurosphères primaires.
Introduction
Le cil primaire est un compartiment subcellulaire dynamique basée microtubules qui fonctionne comme une antenne sensorielle dans la coordination des voies de signalisation cellulaires, y compris la voie Hedgehog Sonic (Shh) au cours du développement des neurones embryonnaires 1, 2, et compartimentée signalisation intracellulaire dans la fonction neuronale adulte 3, 4 . Les composants de signalisation de ces voies, telles que le récepteur de Shh Patched 5; l'activateur de la voie Smoothened (Smo) 6; et Gpr161 7, un récepteur (de GPCR) orphelin couplé à la protéine G qui régule négativement la voie Shh, à localiser les franges de façon dynamique. RCPG multiples ont été signalés à localiser au cil dans les neurones dans le cerveau 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Des défauts dans les voies de signalisation et les franges générées ciliées affectent de multiples tissus et sont collectivement connus sous le nom ciliopathies 17, 18, 19. Le spectre de la maladie de ciliopathie comprend souvent des défauts du développement neurologique, tels que des anomalies craniofaciales 20, 21, 22. En outre, les cils primaires dans les neurones hypothalamiques réguler voies centrales de satiété, et les défauts résultent de l'obésité centrale 23, ce qui reflète l' obésité chez ciliopathies syndromiques telles que le syndrome de Bardet Biedel 24. De plus, la signalisation du récepteur de neuropeptide dans cilia régule CENTRal satiété pathways 11, 14. Localisation ciliaire de l' adénylyl cyclase III (ACIII) et GPCR comme récepteur de la somatostatine 3 dans les neurones hippocampiques entraîner de nouveaux défauts de reconnaissance d'objets et des déficits de la mémoire 25, 26 et parallèle à un manque d'intégrité ciliaire 27. Les aspects relatifs au développement de la signalisation générés ciliées sont étroitement liés à l'homéostasie tissulaire; en particulier, les cils sont importants pour la progression des médulloblastomes Shh sous-type provenant de progéniteurs de granulés dans le cervelet 28, 29. Ainsi, cilia primaires jouent un rôle important au cours de l'embryon, post-natale, et le développement des neurones adultes et la fonction.
Les cellules souches neurales (NSC) se trouvent dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) du ventricule latéral, la zone sous-granulaire du gyrus denté de l'hippocampe, et lezone ventriculaire du troisième ventricule dans l'hypothalamus chez les mammifères , 30, 31, 32. Sont multipotentes NNC, possèdent la capacité d'auto-renouvellement, et sont importants pour le développement du cerveau et de la médecine régénérative 30. La plupart NNC dans le SVZ sont au repos et possèdent un cil primaire solitaire qui, dans de nombreux cas, s'étend vers le ventricule latéral 33. Les signaux de cil primaire par l' intermédiaire de la localisation des différents récepteurs, induisant des réponses cellulaires en aval, en particulier dans le cadre de Shh, TGFß, et les voies de la tyrosine kinase du récepteur 2, 34, 35, 36. Étant donné que les cils primaires pénètrent dans le ventricule latéral, on suppose que les cils primaires détecter des cytokines dans le liquide céphalorachidien (LCR) pour activer NSCs 37 38, 39, 40, 41. Cependant, les mécanismes par lesquels CSF communique avec NNC et si les cils primaires sont impliqués ne sont pas connus. NNC en culture sont adhérentes ciliés; localiser les composants de voie Shh, tels que Smo et Gpr161 dans les cils; et sont Shh sensible 42. Ainsi, NNC peut servir de système de modèle important pour étudier la voie Shh, le trafic ciliaire, et les voies de différenciation neuronale. De plus, les neurones différenciés de NNC peuvent également être utilisés pour les analyses de trafic ciliaire.
Neurosphères sont constitués par des amas de cellules flottantes provenant de la prolifération des NEURAL souches / cellules progénitrices qui se développent en présence de facteurs de croissance spécifiques et des surfaces non adhésives 43, 44. Neurosphères servent aussi important in vitro des modèles de culture pour étudier souches neurales / cellules souches dans le développement normal et la maladie 31, 45, 46, 47. Nous décrivons ici un dosage à base Neurosphère-pour la culture de souches neurales / cellules souches et de différenciation en neurones / glie. Nous soulignons en particulier la traite des composants de signalisation à cil de souches neurales / cellules souches et les neurones différenciés (figure 1). Par opposition à la culture de neurones primaires, neurosphères primaires sont relativement faciles à la culture, se prêtent à de multiples passages et cycles gel-dégel, et peuvent se différencier en neurones / glie. Il est important, nous avons déterminé que de neurones dérivés Neurosphère-les cellules souches / progénitrices et les neurones différenciés sont ciliés en culture et localiser des molécules de signalisation pertinentes pour la fonction ciliaire dans ces compartiments. méthodes de culture à base de neurosphères peuvent servir de système de modèle idéal pour étudier le trafic de ciliogenèse et ciliaire dans NNC et les neurones différenciés.
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Protocol
1. Isolement de Neurosphères de la souris adultes du cerveau
- Euthanasier une souris adulte (environ 2 mois) par une surdose de isoflurane. Double-vérifier que la souris a cessé de respirer et de disséquer immédiatement après la mort.
- Avec des ciseaux, faire une incision médiane pour ouvrir le crâne. Retirez le cerveau.
- Placez le cerveau dans du PBS froid dans un plat de 10 cm sur la glace. Suivre toute la méthode de montage dissection pour obtenir la SVZ du ventricule latéral 48.
- Placer le ventricule latéral dans un tube de 1,5 ml, ajouter 500 ul de 0,05% de trypsine-EDTA dans du PBS, et laisser incuber le tube pendant 15 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Après 15 min, ajouter 500 ul de milieu et d'arrêt en douceur pipeter 20 - 30 fois avec une pointe de 1 mL. Éviter la formation de bulles d'air pendant le pipetage.
REMARQUE: Cette étape est essentielle pour la survie des cellules. - Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 8 min. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de PBS, et remettre en suspension til les cellules par pipetage 5x avec une pointe de 1 ml.
- Centrifuger à 500 g pendant 8 min. Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 1 ml de milieu de base.
- (Facultatif) Si les débris cellulaires sont observés, passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um.
- Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre; en général, environ 30 000 - 60 000 cellules / SVZ sont obtenues.
- Plaque les cellules provenant de l' un SVZ dans une boîte de 10 cm avec 10 ml de milieu NSC et la culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- (Facultatif) Pour éviter la fusion entre les sphères 49, mettre 1000 cellules dans un seul puits d'une très faible liaison de plaque à 6 puits qui est pré - remplie avec 1,5 ml de milieu NSC et la culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
NOTE: Après 5-7 jours, neurosphères peuvent être observés (figure 2A). La période de culture peut varier avec l'âge de la souris ou l'arrière-plan génétique. - Ajouter 2 ml de milieu NSC tous les 3-4 jours pour maintenir la culture(Ne retirez pas le support existant).
2. Analyse de la différenciation des capacités des tests neurosphères et Ciliogenèse
- Pour analyser la capacité de différenciation, d'analyser les neurosphères dans des conditions adhérentes dans un milieu de différenciation.
- Stériliser 12 mm lamelles rondes par autoclavage ou par exposition aux rayons UV avant l'utilisation. Pour une culture de cellules adhérentes, mettre un couvercle en verre stérilisé ronde de 12 mm dans un puits d'une plaque à 24 puits dans des conditions aseptiques.
- Enduire le cache de verre pour 10 s avec 500 ul de 0,002% de poly-L-lysine (PLL). Aspirer la solution et la sécher pendant 10 à 15 min.
- Ajouter 500 ul de solution de laminine (5 pg / pl). Incuber le cache de verre pendant 1 h à 37 ° C.
- Aspirer la laminine et ajouter 500 ul de milieu de différenciation ou de milieu NSC (témoin non différencié).
- Pour le dosage de la différenciation, ramasser 100 - sphère de 200 um avec une pointe de 200 pi au microscope. Ajouter5-10 neurosphères dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et la culture pendant 7-10 jours dans un milieu de différenciation.
- Pour analyser neurosphères indifférenciées, ajouter 5-10 neurosphères à chaque puits d'une plaque de 24 puits et de la culture pendant 1-2 jours dans un milieu NSC. Neurosphères attachés se propagent et se développent en monocouche (figure 2B).
- Après avoir retiré soigneusement le support, fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante, puis on lave avec du PBS deux fois pendant 5 min à température ambiante. La plaque peut être stockée à 4 ° C pendant 1-2 mois.
NOTE: Pour visualiser les cellules souches / progénitrices neurales dans un milieu NSC et des cellules différenciées dans un milieu de différenciation, effectuer une immunocoloration contre la nestine (souche neurale / marqueur de cellules progénitrices), β-tubuline III (monoclonal TUJ1, marqueur neuronal), GFAP (gliale fibrillaire acide Protein , un marqueur des astrocytes) et O4 (marqueur des oligodendrocytes) (Figure 2B-E). Pour analyser le cil, effectuer immunomarquage contre Arl13b (ci primairemarqueur lia) et Gpr161 (GPCR de ciliaire) (Figure 3). - Monter le couvercle en verre avec une solution de montage sur une lame de verre. Incliner la lame de verre pour éliminer l'excès de solution.
3. Analyse des Ciliogenèse dans Neurosphères
- Pour analyser les cellules de neurosphères intactes par immunocoloration, le transfert de 1 ml de culture un milieu contenant de multiples neurosphères à un tube de 1,5 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min. Fixer les sphères avec 4% (PFA), après élimination du milieu pendant 15 minutes et on lave avec du PBS. Isoler sphères à 500 g pendant 8 min, retirer le surnageant, et incuber les sphères O / N à 30% de saccharose à 4 ° C.
- Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 500 pi de solution à l'aide d'un coupe octobre bout 1 ml. Couper le bord de la pointe pour élargir l'ouverture, en octobre est visqueux.
- Transférer la solution contenant les neurosphères octobre dans un moule de congélation en plastique jetable (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Geler le mvieux sur la glace sèche pendant au moins 15 min.
- (Facultatif) Arrêtez l'expérience et de stocker le moule dans un congélateur -80 ° C pendant 1 an.
- Couper les sections avec un cryostat; l'épaisseur des sections doit être de 15 à 30 um.
- Pour visualiser les cils primaire dans un neurosphères, effectuer une immunocoloration contre Arl13b (Figure 4).
4. Culture et Passage de Neurosphères et NSCs Adhérent
- Passage neurosphères alors que la taille de la sphère se situe entre 100-200 um; lorsque les neurosphères sont trop gros (300 um ou plus), ils ne sont pas idéales pour les expériences.
- Transférer les neurosphères dans un tube de 50 ml en utilisant une pointe de 1 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min.
- Jeter le surnageant à l'aide d'un aspirateur, ajouter 500 ul de 0,05% de trypsine-EDTA dans du PBS, et laisser incuber pendant 5 minutes à 37 ° C. La quantité de trypsine varie en fonction du nombre de sphères.
- Ajouter 500 ul de milieu sérique et doucement tuyaut 20 fois avec une pointe de 1 ml.
- Centrifuger à 500 g pendant 8 min. Jeter le surnageant en utilisant une pointe de 1 mL et ajouter 1 ml de milieu de base.
- (Facultatif) Si neurosphères de débris cellulaires ou non dissociées sont vus, passer les cellules à travers une cellule de tamis de 70 um.
- Passage des cellules dans une boîte de 10 cm à une densité de 10.000 cellules / cm2 dans du milieu NSC; les cellules seront prêtes pour le passage suivant après une semaine.
- (Facultatif) Pour geler les cellules, ajouter le milieu de congélation pour générer 500 000 à 1.000.000 cellules / ml suspension. Geler les cellules en utilisant des conteneurs de cryo-gel; neurosphères peuvent non dissociées également gelée.
- Pour la culture adhérente, dillute les cellules à 50.000 cellules / cm 2 sur des lamelles revêtues de laminine-PLL- et avec le milieu NSC et culture pendant 1-2 jours.
5. Famine et analyse des Cilia
- Préparer milieu de privation (tableau 1).
- 1-2 jours après la pl initialeCLASSEMENT des cellules adhérentes après dissociation, le changement de milieu NSC dans un puits (témoin) et du milieu de privation dans un autre puits (expérience).
- Culture des cellules adhérentes à 24 h.
- Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pendant 15 min à température ambiante et laver deux fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois à la température ambiante.
- (Facultatif) arrêter le test et stocker les plaques à 24 puits avec des lamelles dans du PBS à 4 ° C pendant 1-2 mois.
- Exécuter un protocole d'immunofluorescence pour la coloration 7, 50.
- Monter les lamelles en utilisant une solution de montage. Sécher la lame de verre O / N à la température ambiante dans l'obscurité.
- Acquérir des images sur un microscope composé au grossissement nécessaire. Utilisez un microscope, un appareil photo et objectifs (huile 40X / 1.3 et de l'huile 63X / 1.4), contrôlé en utilisant le logiciel accompagné. Prendre z sections suffisantes à 0,5-0,8 um intervalles (figure 5).
- Pour l'analyse quantitative de la localisation ciliaire dansles cellules adhérentes, acquièrent des piles d'images à partir de 3-8 trames consécutives avec des cellules confluentes en regardant dans le canal DAPI. Quantifier le nombre de cil primaire en utilisant ImageJ / Fidji. Typiquement, en utilisant l'outil « compteur de cellules » dans le plug-ins ImageJ> Analyse boîte de dialogue pour compter les cellules avec des cils GPCR-positive; projections maximales de piles d'images peuvent également être exportés à partir ImageJ / Fiji.Use intensité d'image similaire et les paramètres de contraste pour toutes les images de la même expérience pour le comptage et à des fins d'exportation.
6. Transfection de Neurosphères
- Adhérez dissocie les cellules à 24 h pour des lamelles. Utiliser une densité de cellules généralement entre 75.000 et 150.000 cellules dans 500 ul de milieu NSC dans un seul puits d'une plaque à 24 puits.
- Mélanger 25 ul de milieu de sérum réduit et 1,5 ul de réactif de transfection dans un microtube de 0,5 mL par tourbillonnement pendant 5 s.
- Ajouter 2,5 pg d'ADN de plasmide exempt d'endotoxine à 0,5 mL Microtub séparée contenant 25 ul de milieu de sérum réduit et vortexer pendant 5 s.
- Ajouter 1 pi de réactif de transfection au second microtube contenant de l'ADN et vortexer pendant 5 s.
- Ajouter le mélange dans le tube contenant l'ADN du premier microtube et mélanger par pipetage.
- Incuber le mélange pendant 10-15 minutes à température ambiante. Après incubation, on ajoute doucement goutte à goutte le mélange de transfection dans les puits au-dessus du milieu NSC (500 pl / puits).
- Changer le milieu après la transfection 24 h à contrôler milieu (milieu NSC) ou du milieu de privation (500 pl / puits).
- Fixer les cellules en changeant le milieu à 4% PFA après 24 h et effectuer une immunocoloration; typiquement, jusqu'à une efficacité de transfection de 10% est obtenue en utilisant ce protocole.
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Representative Results
Après étalement des cellules de la SVZ dans un milieu NSC pendant une semaine, neurosphères flottants ont été observés (figure 2A). Les dimensions des sphères varient entre 50 et 200 um. Examiner si les sphères ont été dérivées de cellules souches / progénitrices neurales, les neurosphères ont été étalées sur PLL- et laminine revêtement en milieu NSC lamelles pendant 2 jours. Ils ont ensuite été immunocoloration contre le marqueur souches / cellules progénitrices neurales, Nestin. Il a fallu deux jours pour permettre aux sphères d'attacher aux lamelles et à se développer comme une monocouche de cellules. La monocouche de cellules a été positive pour Nestin (figure 2B). Examiner la capacité de différenciation des neurosphères, nous les étapes suivantes décrites PLAQUÉ à l'article 2 sur PLL- et laminine enduit en milieu de lamelles différenciation sans dissociation pendant 7-10 jours. Il faut au moins une semaine pour la différenciation. Les neurosphères fixés aux lamelles et à élargired croître comme une monocouche de cellules. Nous avons fixé les cellules et immunocolorée contre neurones, astrocytes et oligodendrocytes marqueurs. Nous avons observé que neurosphères adhérentes différenciées en neurones β-tubuline III-positives, les astrocytes GFAP-positifs et oligodendrocytes O4-positifs (figure 2C-E). Ainsi, neurosphères multipotentes peuvent provenir de SVZ de souris adulte.
Pour déterminer si neurosphères adhérentes et les neurones différenciés ont cilia primaire, nous immunocolorée contre Arl13b (marqueur primaire cil) 51 et Gpr161 (de GPCR-localisé ciliaire) 7. Dans notre expérience, dans les modèles de souris disponibles exprimant ARL13B-mCherry, et dans les études avec le développement du cortex de la souris, la plupart (sinon tous) cilia neuronale dans le cerveau expriment Arl13b, alors que tous les neurones ne sont pas ACIII positifs 52, 53, 54. Jeus, nous nous appuyons principalement sur Arl13b pour détecter cilia neuronale. Nous avons détecté cils primaires et la localisation de Gpr161 pour les cils des cellules progénitrices de neurosphères adhèrent (Figure 3A) et dans les neurones différenciés (figure 3B). Ainsi, neurosphères adhérentes et lignées différenciées sont ciliés dans la culture et localisent des molécules de signalisation.
Pour déterminer si neurosphères flottantes ont cil primaire, nous cryosectioned neurosphères flottant après fixation, conformément à la section 3. Nous avons observé primaire dans cilia souches neurales / cellules progénitrices dans les neurosphères sectionnés (figure 4A-B). Il est important d'acquérir des sections z à travers les neurosphères pour visualiser entièrement cil primaire, car il est difficile d'examiner le primaire dans un cil seul plan z. En résumé, neurosphères non différenciés ont des populations hétérogènes de cellules ciliées et non ciliées.
(figure 5A-B). De plus, nous avons constaté un nombre accru de cil Gpr161 positif sur la famine (% cilia de Gpr161 positif / positif cilia Arl13b) (figure 5A-B). Fait intéressant, une étude précédente en utilisant des lignées de cellules souches embryonnaires humaines non différenciées démontré que les cellules souches embryonnaires humaines en culture possèdent également primaire 55 cil. Le nombre et la longueur de l'augmentation de la famine sur cilia de sérum dans ces lignées cellulaires, et ces cilia possèdent également des composants de la machine Shh.
Nous avons également transfecté souches neurales adhérentes / progenitor cellules, tel que décrit dans la section 6. On typiquement détecté une efficacité de transfection allant jusqu'à 10%, similaire à des cultures de neurones primaires dans le laboratoire (figure 6).
| Solution | Composant |
| PBS 1x | Diluer 10x PBS avec de l'eau autoclavée |
| moyen NSC | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 mL de 200 mM de L-glutamine | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF basique (bFGF humain) (solution de stock de 25 ng / mL dans du milieu Neurobasal): 20 ng / ml ou 2 mg au total pour 100 ml de milieu | |
| EGF (solution de stock de 25 ng / mL dans du milieu Neurobasal): 20 ng / ml ou 2 mg au total pour les supports 100 ml | |
| 95 ml milieu de base | |
| FGF-basique humain (bFGF humain) | 1 ml milieu de base à la bouteille bFGF humaine commerciale 25 pg |
| Stocker dans microtubes stériles à -20 ° C ou moins. Utiliser une partie aliquote unique de 80 ul ou 2 ug / 100 ml de milieu NSC. | |
| FEM | Ajouter 8 ml milieu de base à la bouteille EGF commerciale 20 pg |
| Stocker microtubes stériles à -20 ° C ou moins. Utiliser un seul 80 ug aliquote / 100 ml de milieu. | |
| Arrêt moyen | 1 ml FBS |
| 75 U de DNase I (75 U / uL dans du PBS) | |
| 9 ml de PBS | |
| sérum moyen | 1 ml FBS |
| 9 ml de milieu basal | |
| Le milieu de congélation | 4 ml de DMSO |
| 24 ml milieu de base | |
| 12 ml 30% de FBS | |
| moyen de différenciation | 90 ml milieu de base |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 mL de 200 mM de L-glutamine | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF basique (bFGF humain) (solution de stock de 25 ng / mL dans du milieu Neurobasal): 10 ng / ml ou un total de 1 mg pour 100 ml | |
| moyen Famine | 95 ml milieu de base |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 mL de 200 mM de L-glutamine | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tableau 1: Recette de solutions.
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Figure 1: Schéma de la culture et Neurosphère Protocoles Différenciation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Neurosphères exposition Capacité de différenciation. (A) sont présentés neurosphères représentatifs. (B) neurosphères ont été étalées sur des lamelles revêtues de laminine dans du milieu PLL- et NSC pendant 2 jours et ont été immunocolorées contre la nestine (marqueur des cellules souches / progénitrices neurales). (CE) neurosphères ont été étalées en suivant les étapes décrites dans la section 2 sur PLL- et Laminin revêtu des lamelles dans du milieu de différenciation pendant 7 jours - haut dissociation; fixé; et immunocolorées contre β-tubuline III (marqueur neuronal), GFAP (marqueur des astrocytes) et O4 (marqueur des oligodendrocytes). Les noyaux ont été colorés par DAPI. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Neurosphères et Neurones dans Neurosphères sont Adhérente Différenciation ciliées. (A) neurosphères non dissociées ont été étalées sur des lamelles revêtues dans un milieu NSC pendant 2 jours; fixé; et immunocolorées contre Gpr161 (vert), Arl13b (rouge), et de l'ADN (bleu). (B) des neurones dissociés ont été immunocolorées contre Gpr161 (vert), Arl13b (rouge, A) ou β-tubuline III (rouge, B), et de l' ADN (bleu). Les flèches blanches indiquent la localisation Gpr161 dans cil.Les panneaux de droite dans (A) sont des vues agrandies du cil primaire indiquée par la flèche blanche. Le cil de Gpr161 positif dans le neurone blanc-boîte est montrée sur la droite dans (B). Échelle = 10 pm (A); 50 um (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: flottant indifférencié Neurosphères Possédez cellules ciliées. neurosphères flottantes ont été fixées, noyées dans de l'OCT, cryosectioned, et traitées pour immunofluorescence contre Arl13b (rouge) et de l'ADN. primaire Arl13b-cil positif dans un neurosphères sont affichés. Le panneau (A) est une projection d'intensité maximale de 14 sections z à intervalles de 0,8 pm à partir d' un neurosphères. Les panneaux en (B) montrent la vue agrandie de ciliated cellules dans la région blanche encadrée dans (A). L'image de projection maximale de toutes les sections z est représentée comme une pile, tandis que les numéros 1 à 14 indiquent z sections individuelles. Les flèches blanches indiquent cil primaire. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Famine Induit Ciliogenèse dans dissociées Adhérente souches neurales / cellules progénitrices. (A) Les cellules dissociées ont été étalées sur des lamelles revêtues dans un milieu NSC ou milieu de privation pendant 24 h; fixé; et immunocolorées contre Gpr161 (vert), Arl13b (rouge), et de l'ADN (bleu). cilia de Gpr161 positives sont observées dans le contrôle (à gauche) et cellules privées (à droite). Les panneaux inférieurs sont des vues agrandies des boîtes blanches indiquées dans la respectivepanneaux supérieurs. Les flèches blanches et pointes de flèches indiquent cilia Gpr161 positives et négatives, respectivement. Barre d'échelle = 100 um. (B) Quantification des cellules ciliées Arl13b-positifs (graphique de gauche) et Gpr161 localisant dans les cils Arl13b-positive (graphique de droite) dans le contrôle et les cellules affamées. Les pourcentages des deux cellules ciliées Arl13b positives et Gpr161 localisant dans cilia Arl13b positif ont augmenté sur la famine. La quantification a été réalisée à partir de deux champs de vision chacun de deux répétitions techniques d'une expérience unique. Les données sont représentées comme la moyenne de tous les champs de vision 4 ± l'écart type. *, P <0,05; **, P <0,01. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Transfection dansDissociées Adhérente souches neurales / cellules progénitrices. Les cellules dissociées étalées sur des lamelles revêtues ont été transfectées avec une construction LAP-TULP3 N-terminale (1-183 aa) mut12 qui ne se lie pas à l'IFT-A noyau 56 complexe. Le milieu a été changé en milieu de privation 24 h post-transfection. Les cellules ont été fixées au bout de 24 h et immunocolorées contre la GFP (vert), Gpr161 (rouge), Arl13b (magenta), et de l'ADN (bleu). Une cellule transfectée avec Gpr161- et cil Arl13b-positif est marqué par une flèche blanche, tandis qu'une cellule transfectée sans cils est représenté avec une tête de flèche blanche. Les flèches jaunes et pointes de flèches pointent vers les cellules non transfectées avec ou sans Gpr161 / Arl13b, respectivement. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour générer et maintenir des cultures de neurosphères de SVZ de souris adulte. Quelques points pertinents en ce qui concerne les cultures sont les suivantes. Tout d'abord, les dimensions des sphères sont généralement entre 50-200 um. Dans notre expérience, quand un Neurosphère obtient plus de 300 m de diamètre, a été manqué le meilleur moment pour repiquage. Ces grandes sphères contiennent des cellules mortes dans le noyau. En second lieu, comme neurosphères sont couramment utilisés pour étudier les cellules souches / progénitrices neurales, il est important d'utiliser pour maintenir la stemness de ces cellules EGF et FGF basique (bFGF). Par conséquent, les facteurs qui induisent la différenciation, tels que FBS, doivent être évités lors de l'entretien des neurosphères. Il a été démontré que 10% de FBS peut différencier en astrocytes neurosphères 47. En troisième lieu, le degré de différenciation neuronale peut dépendre de l'âge de la souris. Si l'on désire une plus grande différenciation neuronale de neurosphères, les souris plus jeunes (da post-nataley 0) peut être utilisé. Quatrièmement, si à partir de nouvelles cultures, il est toujours bon d'examiner la capacité de différenciation des neurosphères. Cinquièmement, notre méthode permet également le gel et le dégel des cultures de neurosphères établies pour une utilisation expérimentale future. Après décongélation, les cellules se développent typiquement sous la forme de cellules adhérentes en forme de fuseau, sans poly-L-lysine ou de la laminine. Cela peut être causé par des dommages au gel-dégel aux cellules. Il est important de maintenir les cellules en croissance jusqu'à ce qu'ils deviennent 60-80% confluentes avant passage. Après le passage, les cellules se développent généralement comme neurosphères et peuvent généralement être repiquées jusqu'à 5 - 10 fois.
méthodes de culture à base de Neurosphère nous permettent d'étudier le trafic ciliaire et des voies de signalisation dans souches neurales / cellules souches et les neurones différenciés. Nous avons examiné dans cilia primaire flottantes / neurosphères adhérentes et différenciées. Il est important d'acquérir plusieurs sections z pour visualiser toute l'étendue cilia complète des neurosphères. En outre, à l'arrièreer générer des cultures adhérentes de ces neurosphères, et les affamés pendant 24 h, la plupart des cellules sont ciliées (Figure 5) et enrichi en GPCR orphelin, Gpr161. Cependant, la famine prolongée des cultures adhérentes résultats dans les structures subcellulaires vacuolaires. Ainsi, il est important d'optimiser soigneusement les périodes de famine à des fins expérimentales particulières.
À l' heure actuelle, les études sur ciliogenèse sont principalement réalisées dans quelques ciliées, lignées cellulaires immortalisées 57. Ces lignées cellulaires ne récapitulent pas toujours fidèlement les neurones et les cellules souches / progénitrices neurales dans l'expression de composants de signalisation, tels que RCPG ou machines de voie Shh, il est donc impératif de développer des méthodes nouvelles pour étudier le rôle de cil dans les processus biologiques. Les méthodes basées sur neurosphères décrits ici permettent d'étudier les voies cellulaires ciliées réglementées, y compris GPCR et signalisation de Shh dans le contexte des souches neurales / cellules progénitrices et diffneurones erentiated.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
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