Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l'innervazione del tratto bipolare in Suncus murinus

Summary

Un approccio immunoistochimico a tutto tondo, per visualizzare l'espressione di proteine ​​del neurofilamento nel tratto biliare extraepatico in Suncus murinus. È qui presentato. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali di S. murinus o di altre specie.

Abstract

Questo lavoro descrive dettagliatamente il metodo di colorazione immunohistochemica a tutto campo, utilizzando l'anticorpo proteico neurofilamento per etichettare l'innervazione del tratto biliare in Suncus murinus ( S. murinus   ). In primo luogo, il campione è stato disciolto da S. murinus e fissato in 4% di paraformaldeide (PFA). In secondo luogo, sono stati eseguiti un trattamento enzimatico e una potenziale inattivazione endogena della perossidasi. Il campione è stato poi esposto all'anticorpo primario, anticorpo anti-neurofilamento proteico, per 3-6 giorni. Fu quindi incubato con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. La reazione a colori è stata rivelata reagendo il campione con un substrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Questo metodo può essere applicato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali. Inoltre, questo protocollo può anche essere adattato per testare altri anticorpi neuronali, ma l'ottimizzazione degli antibodiDovrebbe essere fatto prima. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Kuratani e Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

Introduction

Il muschio della casa, Suncus murinus , appartiene all'ordine Insectivora e alla famiglia Soricidae. Questo piccolo mammifero è distribuito in tutto il Sud-Est asiatico e abita case e aree erbose che si trovano vicino a abitazioni umane o penne di bestiame ⁴ . Questa specie presenta caratteristiche morfologiche generali più simili agli esseri umani rispetto ad altri animali da laboratorio, come il topo, il topo e il coniglio ⁵ . In precedenza, l'immunostaining con un marker di neurone periferico per la proteina del neurofilamento di S. murinus (NFP) è stato usato per etichettare i nervi periferici nel pancreas ⁶ , maggiore papilla duodenale ⁷ , pylorus ⁸ , cistifellea ⁵ e tratto biliare extraepatico ⁹ .

NFP è un complesso macromolecolare che fa parte del citoscheletro neuronale maturo. Proteina legata al neurofilamentoLe interazioni mediate tra NFP e zigosoma. La funzione enzimatica e la struttura delle proteine ​​di collegamento sono regolate da NFP ¹⁰ . Il complesso NFP è costituito da tre polipeptidi: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) e NF-H (200 kDa). NFP può essere trovato in assoni neuronali sia nel sistema nervoso centrale che nei periferici. È stato dimostrato che l'anticorpo anti-umano del NFP ha etichettato assoni del sistema nervoso centrale e periferico. Le indagini anatomiche ed elettrofisiologiche hanno dimostrato che lo sfintere, la cistifellea e il tratto gastrointestinale prossimale sono collegati ^{11 , 12 , 13 , 14} . Tuttavia, le caratteristiche morfologiche delle loro connessioni neuronali non sono ancora state definite.

Questo lavoro dimostra l'utilizzo di un metodo di colorazione immunohistochemico a tutto campo per etichettare l'innervazione del S. murinus bilCon un anticorpo NFP.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Tokyo Metropolitan University (IACUC). Gli animali sono stati alloggiati e trattati secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la Guida per la cura e l'uso degli animali sperimentali del Consiglio canadese sulla cura degli animali. Abbiamo usato animali allevati e mantenuti presso il Laboratorio Morfologico Funzionale, Dipartimento di Scienze della Salute Frontiere, Tokyo Metropolitan University, Giappone.

1. Cura degli animali e alloggi

1. Ottenere 7 S. murinus (3 femmine e 4 maschi che pesano 70-90 g) da una colonia di riproduzione chiusa.
2. Gabbia il S. murinus individualmente dopo lo svezzamento (20 d dopo la nascita) in gabbie di plastica dotate di una scatola di nido di legno contenente strisce di carta. Tenerli in un ambiente animale convenzionalmente condizionato: 23-27 ° C, nessun controllo dell'umidità e 12:12 h luce: ciclo scuro. Fornitura commercPellicole di trota e acqua ad libitum.

2. Preparazione del tessuto

1. Per preparare 4% (w / v) paraformaldeide (PFA), sciogliere 40 g di PFA in 1.000 ml di salinio fosfato-bufferizzato da 0,01 M (PBS, pH 7,4). In un armadio di fumo, mescolare usando un vortice fino a quando la soluzione è chiara. Conservare il 4% PFA O / N a 4 ° C.
   Attenzione: indossare adeguate apparecchiature protettive personali (PPE) durante la manipolazione del PFA.
2. Per perfezionare e fissare l'animale, anestetizzarlo con l'etere e poi darle un'iniezione intraperitoneale di somnopentil (pentobarbital sodio, 0,6 ml / kg di peso corporeo).
3. Dopo che l'animale è completamente narcotizzato, aprire la cavità addominale con un bisturi, creando un'incisione addominale mediana di 3 cm di lunghezza. Mentre incide la vena cava inferiore per exsanguining, inserire un catetere retrogradamente nell'aorta addominale al livello immediatamente superiore alla biforcazione di questa arteria nelle arterie ilieche comuni.
4. Iniettare somnopentil (pentobarbital cosìDium, 1,0 mL / kg di peso corporeo). Dopo la completa eutanasia, perfezionare con 0,01 M PBS (pH 7,4) e poi con 4% PFA in un armadio di fumo.
5. Dopo la perfusione, iniettare 2-3 mL di lattice in neoprene bianco (diluire il lattice di neoprene bianco 3: 2 con acqua distillata (DW)) per etichettare i vasi sanguigni.
6. Estrarre gli organi addominali, compresi il fegato, la cistifellea, il canale biliare comune, il duodeno e il pancreas in blocco, con i nervi e le patologie correlate.
7. Iniettare circa 0,1 ml di lattice blu in neoprene (aggiungere una goccia di inchiostro blu a 10 ml del lattice in neoprene bianco diluito) alla cistifellea per etichettare il sistema biliare.
8. Post-fix durante la notte con il 4% di PFA a 4 ° C per l'immunostaining completo.
   Attenzione: il PFA è tossico. Evitare di gestire direttamente PFA. PFA dovrebbe essere utilizzato in un armadio di fumo.

3. Immunohistochemistry intero-mount

Nota: Durante il protocollo, incluso durante il lavaggio, l'incubazione degli anticorpi e la colorazione, thIl campione deve rimanere sul nocciolatore, scivolando delicatamente a RT oa 4 ° C.

1. Giorno 1: trattamento enzimatico e inattivazione di potenziali perossidasi endogena
   1. Lavare il campione preparato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT in un flaconcino di vetro adeguatamente dimensionato. Far scivolare il campione delicatamente sul nocciolatore per rimuovere il PFA. Evitare di danneggiare il campione quando si scambiano soluzioni.
   2. Per preparare l'acido ortoperiodico al 1% (v / v), sciogliere 1 g di acido orthoperiodic in 100 mL di DW.
   3. Incubare il campione in 1% di acido orthoperiodic per 20 minuti a RT per evitare qualsiasi reazione perossidasi intrinseca.
   4. Preparare il papaino 0,004% (w / v) sciogliendo 0,004 g di papava in 100 ml di tampone Tris-HCl 0,025 mol / l (pH 7,6).
   5. Lavare il campione con DW per 10 minuti a RT.
   6. Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo.
   7. Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT.
   8. Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N.
2. 2 ° giorno: trattamento enzimatico
   1. Lavare il campione memorizzato con DW 4 volte per 1 h ciascuno a RT.
   2. Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo.
   3. Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT. Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N.
3. Giorno 3: trattamento congelante
   1. Lavare il campione memorizzato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT, come sopra.
   2. Preparare rispettivamente 2,5 g, 5 g e 10 g di saccarosio in 100 ml di PBS di 0,01 M (si raccomanda il 2,5% (w / v), il 5% (w / v) e il 10% PH 7,4).
   3. Immergere il campione in 2,5% (w / v), 5% (w / v) e 10% (w / v) di saccarosio per 30 minuti ciascuno.
   4. Fermare il campione a -20 ° C per 30-60 minuti e poi scollegarlo completamente a RT; Ripetere il ciclo 3x.
   5. SuperioreRicaricare il 2% di Triton X-100 (v / v), aggiungere 2 mL di Triton X-100 a 100 mL di 0,01 M PBS (pH 7,4).
   6. Conservare il campione in 2% di Triton X-100 a 4 ° CO / N.
4. 4 ° giorno: Incubazione primaria dell'anticorpo
   1. Preparare la soluzione di diluizione dell'anticorpo primario sciogliendo 0,2 g di albumina Bovine Serum (BSA), 0,3 ml di Triton X-100 e 0,1 g di sodio azide in 100 ml di PBS da 0,01 M (pH 7,4).
      Attenzione: l'azido di sodio è acutamente tossico. Inalazione e tocco devono essere evitati. Indossare un adeguato DPI.
   2. Diluire l'anticorpo primario (NFP) 1: 600 nel precedente tampone di diluizione (punto 3.4.1). Incubare il campione con l'anticorpo NFP a 4 ° C per 3-6 giorni, mantenendo il campione delicatamente dondolando sul nutatore. I campioni più grandi richiedono tempi di incubazione aumentati.
5. Incubazione secondaria anticorpale
   1. Lavare il campione in PBS 4x per 1 h ciascuno a RT per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
   2. Preparare la soluzione di diluizione per l'anticorpo secondario sciogliendo 0,2 g di BSA e 0,3 ml di Triton X-100 in 100 ml di PBS di pH 0,01 (pH 7,4).
   3. Diluire l'anticorpo secondario (perossidasi-coniugato, affinità-pecore anti-mouse IgG-HRP) 1: 600 nel tampone di diluizione (punto 3.5.2). Incubare il campione con l'anticorpo secondario a 4 ° C per 3 d, e mantenere il campione dondolando delicatamente sul nocciolo.
6. Colorazione
   1. Preparare la soluzione di colorazione DAB con l'aggiunta di 0,002 g di 3,3'-diaminobenzidin-tetraidloruro (DAB) a 100 ml di tampone Tris-HCl (pH 7,6) di 0,05 mol / l sotto un armadio di fumo mantenendo la soluzione al buio.
   2. Lavare gli esemplari a RT in PBS 4x per 1 h ciascuno.
   3. Aggiungere 10 μl di 30% di H ₂ O ₂ in soluzione di colorazione DAB preparata di fresco e incubare con la soluzione a 4 ° CO / N o per 3 giorni mentre dondolando delicatamente sul nutatore.
   4. Arrestare la reazione con plaIl campione in PBS con azoto sodico al 0,04% quando viene raggiunta l'intensità di colorazione ottimale.
      NOTA: Evitare l'uso di sodio azide fino a questo passaggio, in quanto inibisce la perossidasi di rafano.
7. Imaging del tessuto macchiato
   1. Trasferire con cura il campione su un piatto di vetro di Petri (5 cm di altezza, 10 cm di diametro) contenente PBS. Cattura immagini integrali utilizzando una fotocamera montata su uno stereomicroscopio.
      NOTA: Il tessuto macchiato interamente montato dovrebbe essere imaged mentre è immerso completamente in PBS su un piatto di vetro trasparente.

Results

Le figure da 1 a 4 mostrano risultati tipici per le fibre nervose NFP-positive nel tratto biliare extraepatico di S. murinus . L'anticorpo contro NFP riproduce etichettato l'innervazione nell'intera immagine del tratto biliare extraepatico ( Figura 1 ), della cistifellea ( Figura 2 ), del canale biliare superiore ( Figura 3 ) e dell'area della papilla duode...

Discussion

Questo lavoro descrive la procedura sperimentale per la visualizzazione dell'innervazione del tratto biliare extraepatico usando un anticorpo contro la proteina del neurofilamento. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo descritto da Kuratani e Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

Per questo esperimento, pianificare la timeline per ciascuno degli esperimenti, in quanto l'approccio di colorazione a t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
acido ortoperiodico	Wako	162-00732
papaina	Wako	164-00172
albumina sierica bovina (BSA)	Wako	010-15131
sodio azide	Nacalai Tesque	312-33
proteina del neurofilamento (NFP) anticorpo	Dako	M0762, lotto 089, clone: 2F11
perossidasi-coniugato anti-topo IgG-HRP MBL purificato per affinità		330
3,3'-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)	Wako	349-00903
imidazolo	Sigma	I-0125