Summary
Универсальный иммуногистохимический подход для визуализации экспрессии белка нейрофиламента в внепеченочном желчном тракте у Suncus murinus. Представлен здесь. Этот протокол может быть использован для анализа иннервации всех висцеральных органов у S. murinus или других видов.
Abstract
В этой работе подробно описывается метод полного окрашивания иммуногистохимическим методом, с использованием антител против нейрофиламентного белка для обозначения иннервации желчного тракта у Suncus murinus ( S. murinus ). Во-первых, образец рассекали из S. murinus и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA). Во-вторых, проводилась ферментативная обработка и потенциальная эндогенная инактивация пероксидазы. Затем образец подвергали воздействию первичного антитела, антитела против нейрофиламентного белка, в течение 3-6 дней. Затем его инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. Цветовая реакция была обнаружена путем взаимодействия образца с субстратом 3,3'-диаминобензидина (DAB). Этот метод может быть применен для анализа иннервации всех висцеральных органов. Кроме того, этот протокол также может быть адаптирован для тестирования других нейронных антител, но оптимизация антителДолжны быть выполнены в первую очередь. Этот метод был первоначально представлен Куратани и Танакой 1 , 2 , 3 .
Introduction
Домашний мускусник , Suncus murinus , принадлежит к ордену Insectivora и семье Soricidae. Это крошечное млекопитающее распространяется по всей Юго-Восточной Азии и обитает в домах и травянистых районах, которые расположены вблизи человеческих обитателей или скотков 4 . Этот вид имеет общие морфологические характеристики, более похожие на человека, чем у других лабораторных животных, таких как мышь, крыса и кролик 5 . Ранее для выявления периферических нервов в поджелудочной железе 6 , крупном дуоденальном сосочке 7 , пилорусе 8 , желчном пузыре 5 и экстрапекальном билиарном тракте 9 использовалось иммуноокрашивание с полным расположением с маркером периферических нейронов для белка нейрофиламента S. murinus (NFP).
NFP представляет собой макромолекулярный комплекс, который является частью зрелого нейронового цитоскелета. Нейрофиламент-связанный белокS посреднические взаимодействия между NFP и zygosome. Как ферментная функция, так и структура линкерных белков регулируются NFP 10 . Комплекс NFP состоит из трех полипептидов: NF-L (70 кДа), NF-M (150-160 кДа) и NF-H (200 кДа). NFP можно найти в нейронных аксонах как в центральной, так и в периферической нервной системе. Было показано, что анти-человеческое антитело NFP обозначает аксоны центральной и периферической нервной системы. Анатомические и электрофизиологические исследования показали, что сфинктер, желчный пузырь и проксимальный желудочно-кишечный тракт связаны с 11 , 12 , 13 , 14 . Однако морфологические особенности их нейронных соединений еще не определены.
Эта работа демонстрирует использование метода иммуногистохимического окрашивания с полным креплением для маркировки иннервации S. murinus bilIary с NFP-антителом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Токийском столичном университете (IACUC). Животных размещали и обрабатывали в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и Руководством по уходу и использованию экспериментальных животных Канадского совета по уходу за животными . Мы использовали животных, разведенных и поддерживаемых в Лаборатории функциональной морфологии, Департамент пограничных медицинских наук, Токийский столичный университет, Япония.
1. Уход за животными и жилье
- Получите 7 S. murinus (3 самки и 4 самца весом 70-90 г) из закрытой колонии размножения.
- Клетка S. murinus индивидуально после отлучения (20 дней после рождения) в пластиковых клетках, оборудованных деревянным ящиком с бумажными полосками. Храните их в условно кондиционированной комнате для животных: 23-27 ° C, без контроля влажности и 12:12 ч свет: темный цикл. ПоставкаЛом форели и воды ad libitum.
2. Подготовка ткани
- Для получения 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) растворяют 40 г PFA в 1000 мл 0,01 М фосфат-буферного солевого раствора (PBS, pH 7,4). В вытяжном шкафу смешайте, используя вихрь, до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Хранить 4% PFA O / N при 4 ° C.
Внимание! При обращении с PFA используйте соответствующее индивидуальное защитное оборудование (СИЗ). - Для перфузии и фиксации животного анестезируйте его эфиром, а затем дайте ему внутрибрюшинную инъекцию сонопентила (пентобарбитал натрия, 0,6 мл / кг веса тела).
- После того, как животное полностью наркотизировано, откройте брюшную полость скальпелем, создав срединный разрез брюшной полости длиной 3 см. Показывая нижнюю полость вены для обескровливания, вставьте катетер ретроградно в брюшную аорту на уровне, непосредственно выше бифуркации этой артерии, в общие подвздошные артерии.
- Инъектный соннопентил (пентобарбиталDium, 1,0 мл / кг массы тела). После полной эвтаназии, перфузии с 0,01 М PBS (рН 7,4), а затем с 4% PFA в дымовом шкафу.
- После перфузии вылейте 2-3 мл белого неопренового латекса (разбавленный белый неопреновый латекс 3: 2 с дистиллированной водой (DW)), чтобы маркировать кровеносные сосуды.
- Извлеките органы брюшной полости, включая печень, желчный пузырь, общий желчный проток, двенадцатиперстную кишку и поджелудочную железу, с соответствующими нервами и сосудами.
- Внесите приблизительно 0,1 мл синего неопренового латекса (добавьте каплю синих чернил в 10 мл разбавленного белого неопренового латекса) в желчный пузырь, чтобы наметить желчную систему.
- Постобработка в течение ночи с 4% PFA при 4 ° C для иммунного окрашивания всего растения.
Осторожно: PFA токсичен. Избегайте обращения с PFA напрямую. PFA следует использовать в вытяжном шкафу.
3. Иммуногистохимия цельного крепления
Примечание: В течение всего протокола, в том числе во время промывки, инкубации антител и окраски,Образец должен оставаться на нутаторе, осторожно качаться при комнатной температуре или при температуре 4 ° C.
- День 1: Ферментативное лечение и инактивация потенциальной эндогенной пероксидазы
- Промойте готовый образец DW 4x в течение 1 часа каждый при комнатной температуре в стеклянном флаконе соответствующего размера. Нанесите образец осторожно на нутатор, чтобы удалить PFA. Избегайте повреждения образца при обмене растворами.
- Для приготовления ортопериодической кислоты 1% (мас. / Об.) Растворяют 1 г ортопериодической кислоты в 100 мл DW.
- Инкубируйте образец в 1% ортепериодической кислоте в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы предотвратить любую внутреннюю реакцию пероксидазы.
- Подготовьте 0,004% (мас. / Об.) Папаина путем растворения 0,004 г папаина в 100 мл 0,025 моль / л буфера Tris-HCl (рН 7,6).
- Промойте образец DW в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Инкубируйте образец в свежеприготовленном 0.004% папаине в течение 2 ч при 37 ° С в ванне с постоянной температурой с нежным качанием.
- Промойте образец с помощью DВт в течение 50-60 мин при комнатной температуре.
- Храните образец в 4% PFA при 4 ° СО / Н.
- День 2: Ферментативное лечение
- Промойте хранящийся образец DW 4 раза в течение 1 часа каждый при комнатной температуре.
- Инкубируйте образец в свежеприготовленном 0.004% папаине в течение 2 ч при 37 ° С в ванне с постоянной температурой с нежным качанием.
- Промойте образец DW в течение 50-60 мин при комнатной температуре. Храните образец в 4% PFA при 4 ° СО / Н.
- День 3: Лечение замораживания
- Вымойте хранящийся образец DW 4x в течение 1 часа каждый при комнатной температуре, как указано выше.
- Приготовление 2,5% (мас. / Об.), 5% (мас. / Об.) И 10% (мас. / Об.) Сахарозы путем растворения 2,5 г, 5 г и 10 г сахарозы соответственно в 100 мл 0,01 М PBS ( РН 7,4).
- Погрузите образец в 2,5% (мас. / Об.), 5% (мас. / Об.) И 10% (мас. / Об.) Сахарозы в течение 30 мин каждый.
- Заморозьте образец при -20 ° C в течение 30-60 минут, а затем полностью оттаивайте его при комнатной температуре; Повторите цикл 3x.
- ВерхнийПовторить 2% Triton X-100 (об. / Об.), Добавить 2 мл Triton X-100 до 100 мл 0,01 М PBS (pH 7,4).
- Храните образец в 2% Triton X-100 при 4 ° CO / N.
- День 4: Инкубация первичных антител
- Подготовьте раствор для разбавления первичного антитела путем растворения 0,2 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,3 мл Triton X-100 и 0,1 г азида натрия в 100 мл 0,01 М PBS (рН 7,4).
Осторожно: азид натрия очень токсичен. Следует избегать вдыхания и прикосновения. Носите соответствующие СИЗ. - Разбавляют первичное антитело (NFP) 1: 600 в вышеупомянутом буфере для разведения (шаг 3.4.1). Инкубируйте образец с помощью NFP-антитела при 4 ° C в течение 3-6 дней, удерживая образец осторожно качающимся на нутаторе. Большие образцы потребуют увеличения времени инкубации.
- Подготовьте раствор для разбавления первичного антитела путем растворения 0,2 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,3 мл Triton X-100 и 0,1 г азида натрия в 100 мл 0,01 М PBS (рН 7,4).
- Инкубация вторичных антител
- Промойте образец в PBS 4x в течение 1 часа каждый при RT для удаления несвязанного первичного антитела. Подготовьте раствор для разбавления вторичного антитела путем растворения 0,2 г BSA и 0,3 мл Triton X-100 в 100 мл 0,01 М PBS (рН 7,4).
- Разбавляют вторичное антитело (пероксидаза-конъюгированное, очищенное аффинностью овечье антитело против мышиного IgG-HRP) 1: 600 в буфере для разведения (этап 3.5.2). Инкубируйте образец с помощью вторичного антитела при 4 ° C в течение 3 дней и держите образец слегка качающимся на нутаторе.
- расцветка
- Приготовить раствор для окрашивания DAB путем добавления 0,002 г тетрагидрохлорида 3,3'-диаминобензидина (DAB) до 100 мл 0,05 моль / л буфера Tris-HCl (pH 7,6) в вытяжном шкафу, поддерживая раствор в темноте.
- Промойте образцы при комнатной температуре в PBS 4x в течение 1 часа каждый.
- Добавьте 10 мкл 30% H 2 O 2 в свежеприготовленный раствор для окрашивания DAB и инкубируйте с раствором при 4 ° СО / N или в течение 3 дней, слегка покачиваясь на нутаторе.
- Остановите реакцию plaПробивая образец в PBS с 0,04% азидом натрия, когда достигается оптимальная интенсивность окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте использования азида натрия до этой стадии, поскольку он ингибирует пероксидазу хрена.
- Изображения окрашенных тканей
- Осторожно перенесите образец в чашку Петри-стекла (5 см в высоту, 10 см в диаметре), содержащую PBS. Захват изображений целиком с помощью камеры, установленной на стереомикроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ. Цельнозернистую окрашенную ткань следует визуализировать, полностью погружая в PBS на прозрачную стеклянную тарелку.
- Осторожно перенесите образец в чашку Петри-стекла (5 см в высоту, 10 см в диаметре), содержащую PBS. Захват изображений целиком с помощью камеры, установленной на стереомикроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунках 1 - 4 показаны типичные результаты для NFP-положительных нервных волокон в внепеченочном желчном тракте у S. murinus . Антитело против NFP воспроизводимо помечено иннервацией во всем изображении внепеченочного желчного тракта ( рис. 1 ), желчного пузыря ( рис. 2 ), верхнего желчного протока ( рис. 3 ) и области дуоденального сосочка ( рис. 4 ) с высокой специфичностью и минимальной задний план.
Для всех тканей образца, независимо от формы и размера, тегментарные нервы могут быть окрашены одновременно. Помимо иннервации внепеченочного желчного тракта, плотность бега и распределения блуждающего нерва пищевода и желудка проявлялась недвусмысленно ( рис. 1 ).
рис. 2 ).
В верхнем желчном протоке были помечены два типа пучков нервов. Мелкие нервные пучки образовывали нерегулярную и плотную сеть нервов, проходили адгезивно и располагались на / в желчном тракте; Более толстые нейронные пучки были распределены параллельно поверхности желчного тракта ( рис. 3 ).
Обычный желчный проток был помечен синим неопреновым латексом и сосудами с белым неопреновым латексом. Тонкие нервные волокна в конце общего желчного протока и область дуоденального сосочка были четко продемонстрированы с высоким c Ontrast ( рисунок 4 ).
Рисунок 1: НФП-положительные нервные волокна в желчном тракте, пищеводе и желудке. Стрелки показывают, что блуждающий бег по пищеводу в желудок. CBD, Common Bile Duct; Es, пищевод; Ст., Желудок. Шкала шкалы = 1300 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: НФП-положительные нервные волокна в желчном пузыре. Кровеносные сосуды желчного пузыря были помечены белым латексом. Обильная иннервация произошла в горлышке желчного пузыря (стрелки). Шкала шкалы = 1000 мкм.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: НФП-положительные нервные волокна в верхнем желчном канале. Наблюдались два типа нервных пучков. Одним типом были тонкие нервные пучки, которые склеивались и находились на / в внепеченочном желчном тракте (стрелки); Другим типом были более толстые нервные пучки, которые были распределены параллельно поверхности внепеченочного желчного тракта и проходили между желчным пузырем и двенадцатиперстной кишкой (треугольники). PV, Portal Vein. Шкала шкалы = 650 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: НФП-положительные нервные волокна в области дуоденальной папиллы. Обычный желчный проток был помечен голубым латексом и сосудами с белым латексом (*). Стрелки показывают иннервацию конца общего желчного протока, а треугольники показывают иннервацию области дуоденального сосочка (P), которая исходит из общего желчного протока и сосудов. Шкала шкалы = 1000 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе описывается экспериментальная процедура визуализации иннервации внепеченочного желчного тракта с использованием антитела против нейрофиламентного белка. Этот протокол был адаптирован из протокола, описанного Куратани и Танакой 1 , 2 , 3 .
Для этого эксперимента планируйте временные рамки для каждого из экспериментов, так как подход к окрашиванию всего растения продолжается в течение 2-3 недель. Судно, содержащее ткань, должно постоянно вращаться на нутаторе, за исключением процесса замораживания / оттаивания. В частности, во время инкубации с первичными и вторичными антителами образец устанавливали в холодильную камеру при вращении на нутаторе для обеспечения равномерного воздействия образца на реакционные растворы. Несколько растворов - 1% (масса / объем) ортопериодической кислоты, 0,004% (мас. / Об.) Папаина и буфер для разбавления первичного / вторичного антителаШтампы - должны быть сделаны свежими для каждого эксперимента. В течение всего протокола, чтобы избежать прикосновения и повреждения образца при смене решений, растворы следует выливать, а не удалять с помощью щипцов 15 .
После фиксации с помощью PFA образцы следует тщательно промыть DW или PBS. Кроме того, важно ферментативное лечение с инкубацией папаина. Тепло и фермент, используемые для извлечения антигена, помогают подготовить ткань для проникновения антител. Для усиления проникновения растворов наружная мембрана ткани должна быть нарушена при замораживании при -20 ° C в течение 30 минут или -80 ° CO / N 15 .
Важно полностью погружать экспериментальный образец в достаточные объемы буферного раствора, чтобы гарантировать, что раствор может инкубировать весь образец. Время инкубации первичного антитела должно быть эмпирически определеноГ для разных тканей и размеров образцов. Как правило, это должно быть 3 дня для образца 2-3 см. Оптимальное разведение должно быть эмпирически определено для каждого антитела. Разведение при 1: 600 рекомендуется для первичного и вторичного антител при использовании соответствующего буфера для антител.
В этой работе подробно описывается протокол универсального иммуногистохимического подхода с полным ходом для выявления экспрессии нейрофиламентного белка в желчном тракте S. murinus . Этот метод может быть использован для анализа иннервации всех висцеральных органов у многих видов. Кроме того, этот протокол также может быть адаптирован для тестирования других нейронных антител, но должна быть выполнена оптимизация антител.
Однако эта методика была ограничена при маркировке мелкой нервной ткани и в построении трехмерной модели иннервации. Кроме того, он не мог идентифицировать характеристики нервных волокон ( то есть симпатических или парциальныхАсимптотический, моторный или сенсорный и т . Д.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
У авторов нет подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
