Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utilisation d'une méthode immunohistochimique intégrale pour étudier l'inervation du tractus biliaire dans Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55483
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Frontier Health Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Anatomy, Tokyo Medical University, 3Area of Regulatory Biology, Division of Life Science, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

Summary

Une approche immunohistochimique intégrale, pour visualiser l'expression de la protéine de neurofilament dans le tractus biliaire extrahépatique chez Suncus murinus. Est présenté ici. Ce protocole peut être utilisé pour analyser l'innervation de tous les organes viscéraux dans S. murinus ou d'autres espèces.

Abstract

Ce travail décrit en détail la méthode de coloration de l'immunohistochimie à l'aide d'anticorps protéiniques de neurofilaments pour étiqueter l'innervation du tractus biliaire chez Suncus murinus ( S. murinus   ). Tout d'abord, l'échantillon a été disséqué à partir de S. murinus et fixé dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA). Deuxièmement, un traitement enzymatique et une inactivation potentielle de la peroxydase endogène ont été effectués. L'échantillon a ensuite été exposé à l'anticorps primaire, anticorps anti-protéines anti-neurofilament, pendant 3 à 6 jours. Il a ensuite été incubé avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort. La réaction de couleur a été révélée en faisant réagir l'échantillon avec un substrat de 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Cette méthode peut être appliquée pour analyser l'innervation de tous les organes viscéraux. En outre, ce protocole peut également être adapté pour tester d'autres anticorps neuronaux, mais l'optimisation de l'anticorpsEs devrait être fait en premier. Cette méthode a été initialement introduite par Kuratani et Tanaka 1 , 2 , 3 .

Introduction

La maison muske shrew, Suncus murinus , appartient à l'ordre Insectivora et à la famille Soricidae. Ce petit mammifère est distribué dans tout le sud-est asiatique et habite des maisons et des zones herbeuses situées à proximité d'habitations humaines ou de enclos pour bétail 4 . Cette espèce présente des caractéristiques morphologiques générales plus semblables aux humains que les autres animaux de laboratoire, comme la souris, le rat et le lapin 5 . Auparavant, on utilisait l'immunocoloration totale avec un marqueur de neurone périphérique pour la protéine de neurofilament de S. murinus (NFP) pour étiqueter les nerfs périphériques dans le pancréas 6 , la papille duodénale majeure 7 , le pylore 8 , la vésicule biliaire 5 et les voies biliaires extrahépatiques 9 .

Le PFN est un complexe macromoléculaire qui fait partie du cytosquelette neuronal mature. Protéine liée au neurofilamentS intermédiaires les interactions entre le NFP et le zygosome. La fonction enzymatique et la structure des protéines de liaison sont régulées par NFP 10 . Le complexe NFP est constitué de trois polypeptides: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) et NF-H (200 kDa). Les PFN peuvent être trouvés dans les axones neuronaux dans le système nerveux central et périphérique. L'anticorps anti-NFP humain a été montré pour étiqueter les axones du système nerveux central et périphérique. Des études anatomiques et électrophysiologiques ont démontré que le sphincter, la vésicule biliaire et le tractus gastro-intestinal proximal sont reliés 11 , 12 , 13 , 14 . Cependant, les caractéristiques morphologiques de leurs connexions neuronales n'ont pas encore été définies.

Ce travail démontre l'utilisation d'une méthode de coloration immunohistochimique à l'ensemble de la matière pour étiqueter l'innervation des S. murinus bilAvec un anticorps NFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université métropolitaine de Tokyo (IACUC). Les animaux ont été logés et manipulés conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et le Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux expérimentaux du Conseil canadien sur les soins des animaux. Nous avons utilisé des animaux élevés et entretenus au Laboratoire de morphologie fonctionnelle, Département de sciences de la santé de la frontière, Université métropolitaine de Tokyo, au Japon.

1. Soins des animaux et logement

  1. Obtenir 7 S. murinus (3 femelles et 4 mâles pesant 70-90 g) d'une colonie d'élevage fermée.
  2. Calez le S. murinus individuellement après le sevrage (20 jours après la naissance) dans des cages en plastique équipées d'un nid de bois contenant des bandes de papier. Gardez-les dans une salle d'animaux classiquement conditionnée: 23-27 ° C, pas de contrôle de l'humidité, et une lumière 12:12 h: cycle sombre. Supply commercGranulés de truite et eau ad libitum.

2. Préparation des tissus

  1. Pour préparer du paraformaldéhyde (PFA) à 4% (p / v), dissoudre 40 g de PFA dans 1000 ml de solution salée tamponnée au phosphate 0,01 M (PBS, pH 7,4). Dans une hotte aspirante, mélanger en utilisant un vortex jusqu'à ce que la solution soit claire. Conservez le 4% de PFA O / N à 4 ° C.
    Attention: Portez un équipement de protection individuelle approprié (PPE) lors de la manipulation de PFA.
  2. Pour perfuser et réparer l'animal, l'anesthésier avec de l'éther et ensuite lui donner une injection intrapéritonéale de somnopentyle (pentobarbital sodium, 0,6 mL / kg de poids corporel).
  3. Après que l'animal est complètement narcotisé, ouvrez la cavité abdominale avec un scalpel, ce qui crée une incision abdominale de la ligne médiane de 3 cm de long. En incitant la veine cave inférieure à exsanguiner, insérez un cathéter rétrogradé dans l'aorte abdominale au niveau immédiatement supérieur à la bifurcation de cette artère dans les artères iliaques communes.
  4. Injecter du somnopentyle (pentobarbital soDium, 1,0 mL / kg de poids corporel). Après l'euthanasie complète, perfuser avec du PBS 0,01 M (pH 7,4) puis avec 4% de PFA dans une hotte aspirante.
  5. Après perfusion, injecter 2-3 ml de latex blanc de néoprène (diluer le latex blanc 3: 2 avec de l'eau distillée (DW)) pour étiqueter les vaisseaux sanguins.
  6. Extraire les organes abdominaux, y compris le foie, la vésicule biliaire, la voie biliaire, le duodénum et le pancréas en bloc, avec les nerfs et les vaisseaux associés.
  7. Injecter environ 0,1 ml de latex bleu de néoprène (ajouter une goutte d'encre bleue à 10 ml du latex blanc néoprène dilué) à la vésicule biliaire pour étiqueter le système biliaire.
  8. Post-fixer pendant une nuit avec 4% de PFA à 4 ° C pour l'immunocoloration intégrale.
    Attention: le PFA est toxique. Évitez de manipuler PFA directement. Les PFA doivent être utilisés dans une hotte aspirante.

3. Immunohistochimie intégrale

Remarque: Tout au long du protocole, y compris pendant le lavage, l'incubation d'anticorps et la coloration, thLe spécimen doit rester sur le mouchoir, basculer doucement à la température ambiante ou à 4 ° C.

  1. Jour 1: traitement enzymatique et inactivation de la peroxydase endogène potentielle
    1. Laver l'échantillon préparé avec DW 4x pendant 1 h à la RT dans un flacon en verre de taille appropriée. Faites pivoter le spécimen délicatement sur le mouchoir pour enlever le PFA. Évitez d'endommager l'échantillon lors de l'échange de solutions.
    2. Pour préparer 1% (p / v) d'acide orthopériodique, dissolvez 1 g d'acide orthopériodique dans 100 mL de DW.
    3. Incuber l'échantillon dans 1% d'acide orthopériodique pendant 20 min à la RT pour éviter toute réaction intrinsèque de peroxydase.
    4. Préparer 0,004% (p / v) de papaïne en dissolvant 0,004 g de papaïne dans 100 ml de tampon Tris-HCl 0,025 mol / L (pH 7,6).
    5. Laver l'échantillon avec du DW pendant 10 min à la température ambiante.
    6. Incuber l'échantillon dans 0,004% de papaïne fraîchement préparée pendant 2 h à 37 ° C dans un bain à température constante avec un basculement doux.
    7. Laver l'échantillon avec DW pendant 50-60 min à la RT.
    8. Conservez l'échantillon dans 4% de PFA à 4 ° CO / N.
  2. Jour 2: traitement enzymatique
    1. Laver l'échantillon stocké avec DW 4 fois pendant 1 h à la RT.
    2. Incuber l'échantillon dans 0,004% de papaïne fraîchement préparée pendant 2 h à 37 ° C dans un bain à température constante avec un basculement doux.
    3. Laver l'échantillon avec du DW pendant 50 à 60 minutes à la température ambiante. Conservez l'échantillon dans 4% de PFA à 4 ° CO / N.
  3. Jour 3: traitement de congélation
    1. Laver l'échantillon stocké avec DW 4x pendant 1 h à la RT, comme ci-dessus.
    2. Préparer 2,5% (p / v), 5% (p / v) et 10% (p / v) de saccharose en dissolvant respectivement 2,5 g, 5 g et 10 g de saccharose dans 100 ml de PBS 0,01 M ( PH 7,4).
    3. Immergez le spécimen dans 2,5% (p / v), 5% (p / v) et 10% (p / v) de saccharose pendant 30 minutes chacun.
    4. Geler l'échantillon à -20 ° C pendant 30 à 60 min, puis dégraisser complètement à la RT; Répétez le cycle 3x.
    5. HautRépare 2% de Triton X-100 (v / v), ajoutez 2 ml de Triton X-100 à 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
    6. Conserver l'échantillon dans 2% de Triton X-100 à 4 ° CO / N.
  4. Jour 4: incubation primaire d'anticorps
    1. Préparer la solution de dilution de l'anticorps primaire en dissolvant 0,2 g d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,3 ml de Triton X-100 et 0,1 g d'azoture de sodium dans 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
      Attention: L'azide de sodium est extrêmement toxique. L'inhalation et le contact doivent être évités. Portez un EPI approprié.
    2. Diluer l'anticorps primaire (NFP) 1: 600 dans le tampon de dilution ci-dessus (étape 3.4.1). Incuber l'échantillon avec un anticorps NFP à 4 ° C pendant 3 à 6 jours, en gardant le spécimen doucement basculant sur le mouchoir. Des échantillons plus importants nécessiteront des temps d'incubation accrus.
  5. Incubation secondaire d'anticorps
    1. Laver l'échantillon dans PBS 4x pendant 1 h à la RT pour éliminer l'anticorps primaire non lié. Préparer la solution de dilution pour l'anticorps secondaire en dissolvant 0,2 g de BSA et 0,3 ml de Triton X-100 dans 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4).
    2. Diluer l'anticorps secondaire (IgG-HRP anti-souris anti-souris purifié par épidémie par conjugaison de peroxydase) 1: 600 dans le tampon de dilution (étape 3.5.2). Incuber l'échantillon avec l'anticorps secondaire à 4 ° C pendant 3 jours et garder l'échantillon bascule doucement sur le mouchoir.
  6. Coloration
    1. Préparer une solution de coloration DAB en ajoutant 0,002 g de tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) à 100 ml de tampon Tris-HCl 0,05 mol / L (pH 7,6) sous une hotte, en maintenant la solution dans l'obscurité.
    2. Laver les spécimens à la RT dans PBS 4x pendant 1 h chacun.
    3. Ajouter 10 μL de 30% de H 2 O 2 dans une solution de coloration DAB fraîchement préparée et incuber avec la solution à 4 ° CO / N ou pendant 3 jours tout en basculant doucement sur le nutator.
    4. Arrêtez la réaction par plaCing l'échantillon dans PBS avec 0,04% d'azide de sodium lorsque l'intensité de coloration optimale est atteinte.
      REMARQUE: Évitez l'utilisation d'azoture de sodium jusqu'à cette étape, car elle inhibe la peroxydase de raifort.
  7. Imagerie au tissu coloré
    1. Transférer soigneusement le spécimen dans un plat de verre Petri (5 cm de haut, 10 cm de diamètre) contenant du PBS. Capturez des images intégrales à l'aide d'une caméra montée sur un stéréomicroscope.
      REMARQUE: Des tissus colorés entièrement montés doivent être imagés tout en immergés complètement dans du PBS sur un plat en verre transparent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les figures 1 à 4 montrent des résultats typiques pour les fibres nerveuses NFP positives dans le tractus biliaire extra-hépatique de S. murinus . L'anticorps contre le NFP a reproduit de façon reproductible l'innervation dans l'image entière du tractus biliaire extra-hépatique ( Figure 1 ), de la vésicule biliaire ( Figure 2 ), de la voie biliaire supérieure ( Figure 3 ) et de la surface de la papille duodénale ( Figure 4 ), avec une spécificité élevée et minimale Contexte.

Pour tous les tissus de l'échantillon, quelle que soit la forme et la taille, les nerfs tegmentaux peuvent être teints en même temps. En plus de l'innervation du tractus biliaire extra-hépatique, la densité de course et de distribution du vague de l'œsophage et de l'estomac a été montrée sans ambiguïté ( figure 1 ).

figure 2 ).

Dans la voie biliaire supérieure, deux types de faisceaux de nerf ont été étiquetés. Les fines grappes nerveuses forment un réseau irrégulier et dense de nerfs, se sont collées et résidaient dans les voies biliaires; Les faisceaux neuronaux plus épais ont été répartis parallèlement à la surface du tractus biliaire ( figure 3 ).

La voie biliaire commune a été marquée avec du latex de néoprène bleu et les vaisseaux avec du latex blanc de néoprène. Les fibres nerveuses minces à la fin de la voie biliaire commune et la surface de la papille duodénale ont été clairement démontrées avec une forte c Ontrast ( Figure 4 ).

Figure 1
Figure 1: Fibres nerveuses NFP positives dans le tractus biliaire, l'œsophage et l'estomac. Les flèches montrent le vague qui court le long de l'œsophage jusqu'à l'estomac. CBD, Common Bile Duct; Es, œsophage; St, l'estomac. Barre d'échelle = 1 300 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Fibres nerveuses NFP positives dans la vésicule biliaire. Les vaisseaux sanguins de la vésicule biliaire ont été étiquetés avec du latex blanc. Une innervation abondante s'est produite dans le cou de la vésicule biliaire (flèches). Barre d'échelle = 1 000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: Fibres nerveuses positives au NFP dans le conduit supérieur de la bile. Deux types de faisceaux de nerf ont été observés. Un type était le faisceau de nerf fin qui a été collé et résidait sur / dans le tractus biliaire extra-hépatique (flèches); L'autre type était des faisceaux neuronaux plus épais qui étaient répartis parallèlement à la surface du tractus biliaire extra-hépatique et couraient entre la vésicule biliaire et le duodénum (triangles). PV, Portal Vein. Barre d'échelle = 650 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 Figure 4: Fibres nerveuses NFP positives dans la zone papillaire Duodénale. La voie biliaire commune a été marquée avec du latex bleu et les vaisseaux à latex blanc (*). Les flèches montrent l'innervation de la fin de la voie biliaire, et les triangles montrent l'innervation de la zone papilienne duodénale (P), qui provient de la voie biliaire commune et des vaisseaux. Barre d'échelle = 1 000 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce travail décrit la procédure expérimentale pour la visualisation de l'innervation du tractus biliaire extra-hépatique en utilisant un anticorps contre la protéine neurofilamentaire. Ce protocole a été adapté du protocole décrit par Kuratani et Tanaka 1 , 2 , 3 .

Pour cette expérience, planifiez le calendrier pour chacune des expériences, car l'approche de coloration intégrale se poursuit pendant 2-3 semaines. Le récipient contenant le tissu doit être tourné sur un nutator en tout temps, sauf pendant le processus de congélation / décongélation. En particulier lors de l'incubation avec les anticorps primaires et secondaires, l'échantillon a été placé dans une chambre de stockage frigorifique tout en tournant sur un nutator pour assurer l'exposition uniforme de l'échantillon aux solutions de réaction. Plusieurs solutions - acide orthopériodique à 1% (p / v), papaïne à 0,004% (p / v) et tampon de dilution pour l'antibiotique primaire / secondaireMeurt - doit être rendu frais pour chaque expérience. Tout au long du protocole, pour éviter de toucher et d'endommager l'échantillon lors du changement de solutions, les solutions doivent être répandues au lieu d'être enlevées avec une pince 15 .

Après la fixation avec PFA, les échantillons doivent être suffisamment lavés avec DW ou PBS. En outre, le traitement enzymatique avec l'incubation de papaïne est important. La chaleur et l'enzyme utilisées pour la récupération des antigènes aident à préparer le tissu pour la pénétration des anticorps. Pour améliorer la pénétration des solutions, la membrane extérieure du tissu doit être perturbée par un traitement de congélation à -20 ° C pendant 30 min ou -80 ° CO / N 15 .

Il est important de submerger complètement l'échantillon expérimental dans des volumes adéquats de solution tampon pour s'assurer que la solution peut incuber l'échantillon entier. Le temps d'incubation de l'anticorps primaire doit être déterminé empiriquementD pour différents tissus et tailles d'échantillon. Habituellement, il doit être de 3 jours pour un échantillon de 2-3 cm. La dilution optimale doit être déterminée de manière empirique pour chaque anticorps. Une dilution à 1: 600 est recommandée pour les anticorps primaires et secondaires lorsqu'on utilise le tampon d'anticorps approprié.

Ce travail décrit en détail le protocole d'une approche immunohistochimique polyvalente complète pour révéler l'expression de protéines de neurofilaments dans le tractus biliaire de S. murinus . Cette méthode peut être utilisée pour analyser l'innervation de tous les organes viscéraux dans de nombreuses espèces. En outre, ce protocole peut également être adapté pour tester d'autres anticorps neuronaux, mais l'optimisation des anticorps devrait être effectuée.

Cependant, la technique était limitée dans l'étiquetage du tissu nerveux peu profond et dans la construction d'un modèle tridimensionnel d'innervation. En outre, il ne pouvait pas identifier les caractéristiques des fibres nerveuses ( c.-à-d. Sympathique ou parAsympathique, moteur ou sensoriel, etc. ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
orthoperiodic acid Wako 162-00732
papain Wako 164-00172
bovine serum albumin (BSA) Wako 010-15131
sodium azide Nacalai Tesque 312-33
neurofilament protein (NFP) antibody Dako M0762, lot 089, clone: 2F11
peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP MBL Code 330
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Wako 349-00903
imidazole Sigma I-0125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
  2. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
  3. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
  4. Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
  5. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
  6. Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
  7. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
  8. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
  9. Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
  10. Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
  11. Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
  12. Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
  13. Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
  14. Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
  15. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).

Tags

Physiologie Problème 124 tractus biliaire extrahépatique nerf autonome innervation immunohistochimie intégrale protéine de neurofilament,
Utilisation d&#39;une méthode immunohistochimique intégrale pour étudier l&#39;inervation du tractus biliaire dans<em&gt; Suncus murinus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, K., Dai, Y., Yi, K., Kinoshita, … More

Ren, K., Dai, Y., Yi, K., Kinoshita, M., Itoh, M., Sakata, I., Sakai, T., Yi, S. Q. Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus. J. Vis. Exp. (124), e55483, doi:10.3791/55483 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter