Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55483
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Frontier Health Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Anatomy, Tokyo Medical University, 3Area of Regulatory Biology, Division of Life Science, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

Summary

Een gehele-mount immunohistochemische aanpak, om de neurofilament eiwit expressie in het extrahepatische galweg in Suncus murinus te visualiseren. Wordt hier gepresenteerd. Dit protocol kan gebruikt worden om de innervering van alle viscerale organen in S. murinus of andere soorten te analyseren.

Abstract

Dit werk beschrijft de gehele berg immunohistochemie kleuring methode in detail, met behulp van neurofilament eiwit antilichaam voor het labelen van de innervatie van het galweg in Suncus murinus ( S. murinus   ). Ten eerste werd het monster van S. murinus gescheiden en in 4% paraformaldehyde (PFA) gefixeerd. Ten tweede werd een enzymatische behandeling en potentiële endogene peroxidase-inactivering uitgevoerd. Het monster werd vervolgens blootgesteld aan het primaire antilichaam, anti-neurofilament eiwit antilichaam, gedurende 3-6 dagen. Het werd vervolgens geïncubeerd met het secundaire antilichaam dat is geconjugeerd met mierikswortelperoxidase. De kleurreactie werd geopenbaard door het monster te laten reageren met een 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substraat. Deze methode kan worden toegepast om de innervering van alle viscerale organen te analyseren. Bovendien kan dit protocol ook worden aangepast om andere neuronale antilichamen te testen, maar optimalisatie van de antibodiesHet moet eerst gedaan worden. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Kuratani en Tanaka 1 , 2 , 3 .

Introduction

De huismussklok , Suncus murinus , behoort tot de orde Insectivora en de familie Soricidae. Dit kleine zoogdier is verspreid over heel Zuidoost-Azië en woont in huizen en grasgebieden die zich bevinden in de buurt van menselijke woningen of veestokken 4 . Deze soort vertoont algemene morfologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met mensen dan andere laboratoriumdieren, zoals de muis, de rat en het konijn 5 . Vroeger werd immunostaining met een perifere neuronmarkering voor S. murinus neurofilament eiwit (NFP) gebruikt om perifere zenuwen in de alvleesklier 6 , hoofdduodenale papilla 7 , pylorus 8 , galblaas 5 en extrahepatische galwegen 9 te markeren.

NFP is een macromoleculaire complex die deel uitmaakt van het volwassen neuronale cytoskelet. Neurofilament-gerelateerd eiwitS bemiddelen interacties tussen NFP en de zygosoom. Zowel de enzymfunctie als de structuur van linkerproteïnen worden gereguleerd door NFP 10 . Het NFP-complex is gemaakt van drie polypeptiden: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) en NF-H (200 kDa). NFP kan worden gevonden in neuronale axonen in zowel het centrale als perifere zenuwstelsel. Anti-menselijk NFP antilichaam is aangetoond om axonen van het centrale en perifere zenuwstelsel te vermelden. Anatomische en elektrofysiologische onderzoeken hebben aangetoond dat de sfincter, galblaas en proximale maagdarmkanaal 11 , 12 , 13 , 14 verbonden zijn. Echter, de morfologische kenmerken van hun neuronale verbindingen zijn nog niet gedefinieerd.

Dit werk demonstreert het gebruik van een volledig-mount immunohistochemische kleuring methode om de innervation van de S. murinus bilIary kanaal met een NFP antilichaam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van Tokyo (IACUC). De dieren werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en de gids voor de verzorging en het gebruik van experimentele dieren van de Canadese Raad voor Dierenverzorging . We gebruikten dieren die gefokt en gehandhaafd zijn in het Functional Morphology Laboratory, Departement van Grenzen Gezondheidswetenschappen, Tokyo Metropolitan University, Japan.

1. Dierenzorg en huisvesting

  1. Verkrijg 7 S. murinus (3 vrouwtjes en 4 mannen met een gewicht van 70-90 g) uit een gesloten fokcolonie.
  2. Kooi de S. murinus individueel na speen (20 d na de geboorte) in plastic kooien uitgerust met een houten nestkastje met papierstrips. Bewaar ze in een conventioneel geconditioneerde dierkamer: 23-27 ° C, geen vochtigheidscontrole en een 12:12 uur licht: donkere cyclus. Commercieel leverenIal forelpellets en water ad libitum.

2. Weefselbereiding

  1. Om 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) voor te bereiden, loste 40 g PFA in 1000 ml 0,01 M fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) op. Meng in een dampkast een vortex tot de oplossing helder is. Bewaar de 4% PFA O / N bij 4 ° C.
    Voorzichtigheid: Draag geschikte persoonlijke beschermende uitrusting (PPE) bij het hanteren van PFA.
  2. Om het dier te perfectioneren en te repareren, verdovende het met ether en geef het dan een intraperitoneale injectie van somnopentyl (pentobarbitalnatrium, 0,6 ml / kg lichaamsgewicht).
  3. Nadat het dier volledig verdikkeld is, open de buikholte met een scalpel, waardoor een middelste abdominale incisie 3 cm lang wordt. Terwijl u de inferieure vena cava inslaat voor het uitsteken, plaatst u een katheter retrogradely in de abdominale aorta op het niveau onmiddellijk boven de bifurcatie van deze slagader in de gemeenschappelijke iliac arteries.
  4. Injecteer somnopentyl (pentobarbital dusDium, 1,0 ml / kg lichaamsgewicht). Na volledige euthanasie, perfuse met 0,01 M PBS (pH 7,4) en dan met 4% PFA in een dampkast.
  5. Na perfusie injecteer 2-3 ml witte neopreen latex (verdunde witte neopreen latex 3: 2 met gedistilleerd water (DW)) om de bloedvaten te markeren.
  6. Uittrekken van de buikorganen, inclusief de lever, galblaas, gemene galweg, duodenum, en pancreas en blok, met de bijbehorende zenuwen en vaten.
  7. Inject ongeveer 0,1 ml blauwe neopreen latex (voeg een druppel blauwe inkt toe aan 10 mL van de verdunde witte neopreen latex) naar de galblaas om het galgsysteem te labelen.
  8. Post-fix overnacht met 4% PFA bij 4 ° C voor volledige-mount immunostaining.
    Let op: PFA is giftig. Vermijd direct PFA te behandelen. PFA moet in een dampkast worden gebruikt.

3. Whole-Mount Immunohistochemistry

Opmerking: gedurende het protocol, inclusief tijdens het wassen, antilichaam incubatie, en kleur, thHet exemplaar moet op de nutator blijven, schudden bij RT of bij 4 ° C.

  1. Dag 1: Enzymatische behandeling en inactivatie van potentiële endogene peroxidase
    1. Was het voorbereide exemplaar met DW 4x gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur in een op maat gemaakte glazen flesje. Rip het specimen zachtjes op de nutator om de PFA te verwijderen. Vermijd beschadiging van het monster bij het uitwisselen van oplossingen.
    2. Om 1% (w / v) orthoperiodinezuur op te bereiden, lost 1 g orthoperiodinezuur op in 100 ml DW.
    3. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij 1 ° C in 1% orthoperiodinezuur om eventuele intrinsieke peroxidase-reactie te voorkomen.
    4. Bereid 0,004% (w / v) papain door 0,004 g papain in 100 ml 0,025 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7,6) op te lossen.
    5. Was het monster met DW gedurende 10 minuten bij RT.
    6. Incubeer het monster in vers bereide 0,004% papain gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bad met constante temperatuur met zachte schommeling.
    7. Was het monster met DW voor 50-60 minuten bij RT.
    8. Bewaar het monster in 4% PFA bij 4 ° C / N.
  2. Dag 2: Enzymatische behandeling
    1. Was het opgeslagen monster met DW 4 keer per 1 uur bij RT.
    2. Incubeer het monster in vers bereide 0,004% papain gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bad met constante temperatuur met zachte schommeling.
    3. Was het monster met DW gedurende 50-60 minuten bij RT. Bewaar het monster in 4% PFA bij 4 ° C / N.
  3. Dag 3: Bevriezing
    1. Was het opgeslagen monster met DW 4x gedurende 1 uur elk bij RT, zoals hierboven.
    2. Bereid 2,5% (w / v), 5% (w / v) en 10% (w / v) sucrose door respectievelijk 2,5 g, 5 g en 10 g saccharose op te lossen in 100 ml 0,01 M PBS PH 7,4).
    3. Dompel het monster in 30 minuten voor 2,5 minuten (w / v), 5% (w / v) en 10% (w / v) sucrose.
    4. Bevroren het monster bij -20 ° C gedurende 30 - 60 minuten en ontdooit het dan bij RT; Herhaal de cyclus 3x.
    5. Naar pRepareer 2% Triton X-100 (v / v), voeg 2 ml Triton X-100 toe aan 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
    6. Bewaar het monster in 2% Triton X-100 bij 4 ° C / N.
  4. Dag 4: Incubatie van primaire antilichamen
    1. Bereid de verdunningsoplossing van het primaire antilichaam door 0,2 g Bovine Serum Albumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 en 0,1 g Natriumazide in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) op te lossen.
      Let op: Natriumazide is acuut giftig. Inademing en aanraken moeten vermeden worden. Draag geschikte PPE.
    2. Verdun het primaire antilichaam (NFP) 1: 600 in de bovenstaande verdunningsbuffer (stap 3.4.1). Incubeer het monster met NFP antilichaam bij 4 ° C gedurende 3-6 dagen, waarbij het monster zachtjes op de noot schudt. Grotere monsters vereisen verhoogde incubatietijden.
  5. Secundaire antilichaam incubatie
    1. Was het monster in PBS 4x gedurende 1 uur bij RT om het ongebonden primair antilichaam te verwijderen. Bereid de verdunningsoplossing voor het secundaire antilichaam door 0,2 g BSA en 0,3 ml Triton X-100 in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) op te lossen.
    2. Verdun het secundaire antilichaam (peroxidase-geconjugeerde, affiniteits-gezuiverde schapen-anti-muis IgG-HRP) 1: 600 in de verdunningsbuffer (stap 3.5.2). Incubeer het monster met het secundaire antilichaam bij 4 ° C gedurende 3 d, en houd het monster zachtjes aan de nutator grijpen.
  6. Kleur
    1. Bereid DAB kleuroplossing door 0,002 g 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) op 100 ml 0,05 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7,6) onder een dampkast toe te voegen, waarbij de oplossing in het donker blijft.
    2. Was de specimen bij RT in PBS 4x voor 1 uur elk.
    3. Voeg 10 μl 30% H 2 O 2 in vers bereide DAB kleuroplossing toe en incubeer met de oplossing bij 4 ° C / N of 3 d terwijl u zachtjes op de nutator schuift.
    4. Stop de reactie door plaCing het monster in PBS met 0,04% natriumazide wanneer de optimale kleurintensiteit is bereikt.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van natriumazide tot deze stap, aangezien het peperwortelperoxidase remt.
  7. Beeldvorming van het gekleurde weefsel
    1. Zet het monster zorgvuldig over op een petri glazen schotel (5 cm hoog, 10 cm in diameter) met PBS. Vastgehouden beelden met behulp van een camera op een stereomicroscoop vastleggen.
      OPMERKING: Gefocusterd gebrandschilderd weefsel moet worden afgebeeld terwijl het volledig in PBS wordt gedompeld op een transparante glazen schotel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuren 1 - 4 tonen typische resultaten voor NFP-positieve zenuwvezels in het extrahepatische galweg in S. murinus . Het antilichaam tegen NFP genereerbaar de innervation in het gehele beeld van het extrahepatische galwegen ( Figuur 1 ), galblaas ( Figuur 2 ), bovenste galweg ( Figuur 3 ) en duodenale papilla gebied ( Figuur 4 ) met hoge specificiteit en minimale achtergrond.

Voor alle weefsels van het monster, ongeacht de vorm en de grootte, kunnen tegmentale zenuwen tegelijk worden geverfd. Naast de innervatie van het extrahepatische galwegen, werden de loop- en distributiedichtheid van de slokdarm van de slokdarm en de maag ondubbelzinnig getoond ( figuur 1 ).

Figuur 2 ).

In de bovenste galweg werden twee soorten zenuwbundels gelabeld. De fijne zenuwbundels hebben een onregelmatig en dicht netwerk van zenuwen gevormd, lijmig gelopen en woonde op / in het galweggebied; De dikkerere neurale bundels werden parallel verdeeld aan het oppervlak van de galwegen ( Figuur 3 ).

De gemeenschappelijke galbuis was gemarkeerd met blauwe neopreen latex en de vaten met witte neopreen latex. De dunne zenuwvezels aan het einde van de gemeenschappelijke galweg en het duodenale papilla gebied werden duidelijk aangetoond met hoge c Ontrast ( figuur 4 ).

Figuur 1
Figuur 1: NFP-positieve zenuwvezels in de galwegen, de slokdarm en de maag. Pijlen laten de vagus lopen langs de slokdarm naar de maag. CBD, Common Galaxy; Es, slokdarm; St, maag. Schaalbalk = 1.300 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: NFP-positieve zenuwvezels in de galblaas. De bloedvaten van de galblaas werden gemerkt met witte latex. Overvloedige innervatie vond plaats in de nek van de galblaas (pijlen). Schaalbalk = 1000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 3
Figuur 3: NFP-positieve zenuwvezels in de bovenste galweg. Twee soorten zenuwbundels werden waargenomen. Eén type was de fijne zenuwbundels die lijmig hielden en op / in het extrahepatische galwegen (pijlen) wonen; Het andere type was dikkerere neurale bundels die parallel aan het oppervlak van het extrahepatische galwegen verspreid werden en tussen de galblaas en het duodenum (driehoeken) renden. PV, Portal Vein. Schaalbalk = 650 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4 Figuur 4: NFP-positieve zenuwvezels in het Duodenale Papilla-gebied. De gemeenschappelijke galbuis was gemarkeerd met blauwe latex en de vaten met witte latex (*). Pijlen tonen de innervatie van het einde van de gemeenschappelijke galwegen, en driehoeken tonen de innervatie van het duodenale papilla gebied (P), dat afkomstig is uit de gemeenschappelijke galweg en vaten. Schaalbalk = 1000 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit werk beschrijft de experimentele procedure voor het visualiseren van de innervatie van het extrahepatische galwegstelsel met behulp van een antilichaam tegen neurofilament eiwit. Dit protocol werd aangepast uit het protocol beschreven door Kuratani en Tanaka 1 , 2 , 3 .

Bepaal voor dit experiment de tijdlijn voor elk van de experimenten, aangezien de full-mount staining-aanpak 2-3 weken blijft. Het vaartuig dat het weefsel bevat moet te allen tijde op een nutator worden gedraaid, behalve tijdens het vries- / ontdooiproces. In het bijzonder tijdens incubatie met de primaire en secundaire antilichamen werd het monster in een koelkamer opgeslagen tijdens het roteren op een nutator om de uniforme blootstelling van het monster aan de reactieoplossingen te waarborgen. Verscheidene oplossingen - 1% (w / v) orthoperiodinezuur, 0,004% (w / v) papain, en de verdunningsbuffer voor het primaire / secundaire antiboSterft - moet voor elk experiment vers worden gemaakt. Door het protocol te voorkomen dat het monster wordt geraakt en beschadigd bij het oplossen van oplossingen, moeten de oplossingen uitgegoten worden in plaats van met pincet 15 verwijderd te worden.

Na bevestiging met PFA dienen de monsters voldoende te worden gewassen met DW of PBS. Daarnaast is de enzymatische behandeling met de papain incubatie belangrijk. De hitte en het enzym dat wordt gebruikt voor het ophalen van antigeen, helpt het weefsel voor antilichaampenetratie te bereiden. Om de penetratie van de oplossingen te verbeteren, moet het buitenmembraan van het weefsel worden verstoord door een bevriezing bij -20 ° C gedurende 30 min of -80 ° C / N 15 .

Het is belangrijk om het experimentele monster volledig te onderdompelen in voldoende volumes bufferoplossing om ervoor te zorgen dat de oplossing het gehele monster kan incuberen. De incubatietijd van het primaire antilichaam moet empirisch worden bepaaldD voor verschillende weefsels en steekproefgroottes. Meestal moet het 3 dagen zijn voor een 2-3 cm monster. De optimale verdunning moet empirisch bepaald worden voor elk antilichaam. Een verdunning van 1: 600 wordt aanbevolen voor zowel de primaire als secundaire antilichamen bij gebruik van de juiste antilichaambuffer.

Dit werk beschrijft in detail het protocol van een veelzijdige immunogistochemische immunogistochemische methode om neurofilamentproteïne expressie in het galweg van S. murinus te onthullen. Deze methode kan worden gebruikt om de innervering van alle viscerale organen in veel soorten te analyseren. Bovendien kan dit protocol ook aangepast worden om andere neuronale antilichamen te testen, maar optimalisatie van de antilichamen dient te worden uitgevoerd.

De techniek was echter beperkt in het labelen van ondiep zenuwweefsel en bij het opbouwen van een driedimensionaal model van innervatie. Ook kon het niet de kenmerken van de zenuwvezels identificeren ( dwz sympathiek of parAsympathisch, motorisch of sensorisch, enz. ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs hebben geen erkenningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
orthoperiodic acid Wako 162-00732
papain Wako 164-00172
bovine serum albumin (BSA) Wako 010-15131
sodium azide Nacalai Tesque 312-33
neurofilament protein (NFP) antibody Dako M0762, lot 089, clone: 2F11
peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP MBL Code 330
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Wako 349-00903
imidazole Sigma I-0125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
  2. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
  3. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
  4. Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
  5. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
  6. Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
  7. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
  8. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
  9. Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
  10. Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
  11. Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
  12. Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
  13. Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
  14. Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
  15. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).

Tags

Physiology Extrahepatic biliary tract autonome zenuw innervatie full-mount immunohistochemie neurofilament eiwit,
Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren<em&gt; Suncus murinus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, K., Dai, Y., Yi, K., Kinoshita, … More

Ren, K., Dai, Y., Yi, K., Kinoshita, M., Itoh, M., Sakata, I., Sakai, T., Yi, S. Q. Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus. J. Vis. Exp. (124), e55483, doi:10.3791/55483 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter