Summary
גישה הר שלמה אימונוהיסטוכימי, כדי לחזות ביטוי חלבון neurofilament במערכת מרה מרהיב סונקוס murinus. מוצג כאן. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים בס מורינוס או מינים אחרים.
Abstract
עבודה זו מתארת את שיטת הרמוניה של המערכת החיסונית בכללותה, תוך שימוש בנוגדן נוירופילמנט לחלבון כדי לתייג את העצבון של דרכי המרה במעי הגס של סונקוס ( S. Murinus ). ראשית, הדגימה גזור מ מ 'מנוס ו קבוע ב paraformaldehyde 4% (PFA). שנית, טיפול אנזימטי ואקטיביזם peroxidase אנדוגני פוטנציאלי בוצעו. הדגימה נחשפה אז נוגדן ראשוני, נוגדן נוגדנים נוירופילמנט, במשך 3-6 ימים. זה היה מודגרות אז עם נוגדנים משני מצומדות עם חזרת peroxidase. התגובה הצבעונית התגלה על ידי תגובה הדגימה עם המצע של 3,3 '-diaminobenzidine (DAB). שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של antibodiEs צריך להיעשות הראשון. שיטה זו הוצגה במקור על ידי Kuratani ו Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
הבית מושק זועק , סונקוס murinus , שייך סדר Insectivora ואת Soricidae המשפחה. יונק זעיר זה מופץ ברחבי דרום מזרח אסיה ומתגורר בתים ואזורי עשב הממוקמים ליד היישוב האנושי או עטים בקר 4 . מין זה מציג מאפיינים מורפולוגיים כלליים דומים יותר לבני אדם מאשר לבעלי מעבדה אחרים, כגון עכבר, חולדה ושפן. בעבר, כל ההר immunostaining עם סמן נוירון היקפי עבור חלבון ne Murphus neurofilament (NFP) שימש התווית העצבים ההיקפיים בלבלב 6 , הפודילה המרכזית של התריסריון 7 , pylorus 8 , gallbladder 5 , ו exthepatic דרכי השתן 9 .
NFP הוא קומפלקס macromolecular כי הוא חלק cytoskeleton העצבית בוגרת. נוירופילמנט הקשורות חלבוןאינטראקציה בין NFP לבין הזיגוזום. הן פונקציה האנזים ואת המבנה של חלבונים מקשר מוסדרים על ידי NFP 10 . מתחם NFP מורכב משלושה פוליפפטידים: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) ו- NF-H (200 kDa). NFP ניתן למצוא אקסונים נוירונים הן במערכת העצבים המרכזית והפריפריה. נוגדן NFP אנטי אנושי הוכח לתווית אקסונים של מערכת העצבים המרכזית והפריפלית. מחקרים אנטומיים ואלקטרופיזיולוגיים הוכיחו כי הסוגר, כיס המרה, ודרכי העיכול הפרוקסימלי מחוברים 11 , 12 , 13 , 14 . עם זאת, התכונות המורפולוגיות של חיבורים העצבית שלהם עדיין לא הוגדרו.
עבודה זו מדגימה את השימוש של שיטת הר שלמה immunohistochemical מכתים את התווית של העצבנות של ס מורינוס bilIary עם נוגדנים NFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת טוקיו מטרופולין מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC). החיות שוכנו ומטופלות בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ובמדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים ניסיוניים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. השתמשנו בבעלי חיים וגידלנו במעבדה למורפולוגיה תפקודית, המחלקה למדעי הבריאות של הגבול, אוניברסיטת מטרופולין של טוקיו, יפן.
1. טיפול בבעלי חיים ודיור
- השג 7 ס מורינוס (3 נקבות ו 4 זכרים במשקל 70-90 גרם) ממושבה ריבוי סגורה.
- לכלוב את ס מורינוס בנפרד לאחר הגמילה (20 ד לאחר הלידה) בכלובי פלסטיק מצוידים תיבת קינון עץ המכילים רצועות נייר. שמור אותם בחדר חיות מותנה באופן קונבנציונלי: 23-27 ° C, ללא בקרת לחות, ו 12:12 שעה אור: מחזור כהה. ספק אספקהIal pellets ו מים המודעה libitum.
2. הכנת רקמות
- כדי להכין 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA), להמיס 40 גרם של PFA ב 1000 מ"ל של 0.01 M זרחן שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4). בתוך ארון אדים, מערבבים באמצעות מערבולת עד הפתרון ברור. חנות 4% PFA O / N ב 4 ° C.
זהירות: ללבוש המתאים מגן אישי ציוד (PPE) בעת הטיפול PFA. - כדי perfuse ולתקן את החיה, להרדים אותו עם אתר ולאחר מכן לתת לו זריקה intraperitoneal של somnopentyl (pentobarbital נתרן, 0.6 מ"ל / ק"ג bodyweight).
- לאחר החיה מסומנת לחלוטין, לפתוח את חלל הבטן עם אזמל, יצירת חתך הבטן קו האמצע 3 ס"מ. בעוד incising נחות הווריד הנבוב עבור exsanguinating, להכניס קטטר retrogradely לתוך אבי העורקים הבטן ברמה מיד מעל ההתפצלות של עורק זה לתוך העורקים השכיח המשותף.
- להזריק somnopentyl (pentobarbital כךDium, 1.0 מ"ל / ק"ג bodyweight). לאחר המתת חסד מלאה, perfuse עם 0.01 M PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם PFA 4% בארון קטר.
- לאחר זלוף, להזריק 2-3 מ"ל של לטקס נייטרן לבן (לדלל לטקס נייטרן לבן 3: 2 עם מים מזוקקים (DW)) לתייג את כלי הדם.
- לחלץ את איברי הבטן, כולל הכבד, כיס המרה, צינור המרה משותף, תריסריון, לבלב וגוש, עם עצבים הקשורים וכלי.
- להזריק כ 0.1 מ"ל של לטקס נייטרן כחול (להוסיף טיפה של דיו כחול ל 10 מ"ל של דיאטן לטקס נייטרן לבן מדולל) כדי כיס המרה כדי התווית מערכת המרינה.
- לאחר תיקון לילה עם PFA 4% ב 4 ° C עבור immunostaining הר כולו.
זהירות: PFA הוא רעיל. הימנע טיפול PFA ישירות. PFA יש להשתמש בארון קטר.
3. שלמה הר אימונוהיסטוכימיה
הערה: לאורך הפרוטוקול, כולל במהלך כביסה, הדגירה נוגדנים, צבע, thE specimen חייב להישאר על nutator, בעדינות נדנדה ב RT או 4 ° C.
- יום 1: טיפול אנזימטי ו inactivation פוטנציאל peroxidase אנדוגני
- שטפו את הדגימה מוכנה עם DW 4x עבור 1 שעות כל ב RT ב בקבוקון בגודל מתאים. רוק את הדגימה בעדינות על nutator כדי להסיר את PFA. הימנע נזק הדגימה בעת החלפת פתרונות.
- כדי להכין 1% (w / v) חומצה אורתופריאודית, להמיס 1 גרם של חומצה אורתופריאודלית ב 100 מ"ל של DW.
- דגירה הדגימה של 1% אורטופרידיום חומצה במשך 20 דקות ב RT כדי למנוע כל תגובה peroxidase מהותי.
- הכן 0.004% (w / v) papain על ידי המסת 0.004 גרם של papain ב 100 מ"ל של 0.025 mol / L Tris-HCl חיץ (pH 7.6).
- שטפו את הדגימה עם DW במשך 10 דקות ב RT.
- דגירה הדגימה של פאפאין 0.004% מוכן טרי עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט טמפרטורה קבוע עם נדנדה עדינה.
- לשטוף את הדגימה עם DW עבור 50-60 דקות ב RT.
- חנות הדגימה 4% PFA ב 4 ° CO / N.
- יום 2: טיפול אנזימטי
- שטפו את הדגימה המאוחסנת עם DW 4 פעמים במשך שעה 1 ב RT.
- דגירה הדגימה של פאפאין 0.004% מוכן טרי עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט טמפרטורה קבוע עם נדנדה עדינה.
- שטפו את הדגימה עם DW עבור 50-60 דקות ב RT. חנות הדגימה 4% PFA ב 4 ° CO / N.
- יום 3: הקפאת הטיפול
- שטפו את הדגימה המאוחסנת עם DW 4x עבור 1 שעות כל ב RT, כאמור.
- הכינו 2.5% (w / v), 5% (w / v) ו -10% (w / v) סוכרוז על ידי המסת 2.5 גרם, 5 גרם, 10 גרם סוכרוז, בהתאמה, ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS ( PH 7.4).
- לטבול את הדגימה ב 2.5% (w / v), 5% (w / v), ו 10% (w / v) סוכרוז במשך 30 דקות כל אחד.
- להקפיא את הדגימה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 - 60 דקות ולאחר מכן להפשיר לחלוטין אותו RT; לחזור על מחזור 3x.
- חלק עליוןReare 2% Triton X-100 (v / v), להוסיף 2 מ"ל של טריטון X-100 ל 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
- חנות הדגימה 2% Triton X-100 ב 4 ° CO / N.
- יום 4: הדגירה נוגדן ראשוני
- הכן את הפתרון דילול של הנוגדן העיקרי על ידי המסת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA), 0.3 מ"ל של טריטון X-100, ו 0.1 גרם של אזיד נתרן ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד. שאיפה ונוגע יש להימנע. ללבוש PPE המתאים. - לדלל את הנוגדן העיקרי (NFP) 1: 600 במאגר דילול לעיל (שלב 3.4.1). דגירה הדגימה עם נוגדן NFP ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-6 ימים, שמירה על הדגימה בעדינות נדנדה על nutator. דגימות גדולות יותר ידרשו פעמים הדגירה גדל.
- הכן את הפתרון דילול של הנוגדן העיקרי על ידי המסת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA), 0.3 מ"ל של טריטון X-100, ו 0.1 גרם של אזיד נתרן ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
- הדגירה נוגדן משני
- לשטוף את הדגימה PBS 4x עבור 1 שעות כל ב RT כדי להסיר נוגדן העיקרי מאוגד. הכן את פתרון דילול הנוגדנים משני על ידי המסת 0.2 גרם של BSA ו 0.3 מ"ל של טריטון X-100 ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
- לדלל את הנוגדנים המשניים (peroxidase- מצומדות, זיקה מטוהרים כבשים אנטי עכבר IgG-HRP) 1: 600 במאגר דילול (שלב 3.5.2). דגירה הדגימה עם נוגדנים משני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ד, ולשמור על הדגימה נדנדה בעדינות על nutator.
- הכן DAB פתרון צבע על ידי הוספת 0.002 גרם של 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ל 100 מ"ל של 0.05 מ"ל / L Tris-HCl חיץ (pH 7.6) תחת ארון אדים, שמירה על הפתרון בחושך.
- שטפו את הדגימות ב RT ב PBS 4x עבור 1 שעות כל אחד.
- הוסף 10 μL של 30% H 2 O 2 ב טריים מוכן DAB פתרון צבע ו דגירה עם הפתרון ב 4 ° CO / N או במשך 3 ד בעוד נדנדה בעדינות על הנוטאטור.
- עצור את התגובה על ידי פלהCing הדגימה PBS עם 0.04% Azide נתרן כאשר עוצמת מכתים אופטימלי הוא הגיע.
הערה: הימנע משימוש של אזיד הנתרן עד שלב זה, כפי שהוא מעכב peroxidase חזרת.
- בזהירות להעביר את הדגימה לצלחת זכוכית פטרי (5 ס"מ גבוה, 10 ס"מ קוטר) המכיל PBS. לכידת שלם הר תמונות באמצעות מצלמה רכוב על stereomicroscope.
הערה: כל הר רקמת מוכתם צריך להיות צילמו בעוד שקוע לחלוטין PBS על צלחת זכוכית שקופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איורים 1 - 4 מראים תוצאות טיפוסיות עבור סיבי עצב NFP חיובי במערכת המעי הרגיז ב S. Murinus . נוגדן נגד NFP שכותרתו את העצבון בתמונה כולה של דרכי מרה מרהיב ( איור 1 ), כיס המרה ( איור 2 ), צינור המרה העליונה ( איור 3 ), ואת אזור האפיפיור התריסריון ( איור 4 ), עם סגוליות גבוהה מינימלי רקע כללי.
עבור כל הרקמות של הדגימה, ללא קשר לצורה וגודל, עצבים teegalal יכול להיות צבוע בו זמנית. בנוסף העצבנות של דרכי מרה מרהיב, הריצה ואת צפיפות ההפצה של הווגוס של הוושט ואת הבטן הוצגו חד משמעית ( איור 1 ).
תחת כלי הדם של כיס המרה היו מסומנים עם לטקס נייטרן לבן, fibroses העצבים הדקים הוכיחו בבירור עם ניגודיות גבוהה. הצפיפות של העצבון היה גבוה יותר בצוואר מאשר בפונדוס של כיס המרה ( איור 2 ).
בצינור המרה העליון, שני סוגים של צרורות עצבים היו מסומנים. צרורות העצבים היפים יצרו רשת עצבים לא סדירה ונדבקה, דוהרת באדיקות, והתגוררה על / בדרכי המרה; צרורות עצביים עבים הופצו במקביל על פני השטח של דרכי המרה ( איור 3 ).
צינור המרה המשותף היה מסומן עם לטקס נייטרן כחול ואת כלי עם לטקס נייטרן לבן. סיבי העצבים הדקים בסוף צינור המרה המשותף ואזור הפפיליה התריסריון הוכחו בבירור עם C גבוה Ontrast ( איור 4 ).
איור 1: NFP חיובי עצב סיבים בדרכי המרה, הוושט, ואת הבטן. החצים מראים את הוואגוס המתמשך לאורך הוושט אל הבטן. CBD, צינור המרה המשותף; Es, הוושט; רחוב, בטן. קנה מידה בר = 1,300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: NFP חיובי סיבי עצב בכיס המרה. כלי הדם של כיס המרה היו מסומנים בטקס לבן. עיצום שופע התרחש בצוואר כיס המרה (חיצים). סולם בר = 1000 מיקרומטר.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: NFP חיובי סיבי עצב של צינור המרה העליונה. שני סוגים של צרורות עצבים נצפו. סוג אחד היה צרורות עצבים עדינים אשר רץ adhesively ו התגוררו על / בתוך דרכי המרה מרהיב (חיצים); הסוג האחר היה צרורות עצביים עבים יותר, שהופצו במקביל לפני השטח של דרכי המרה המיותרות ורצו בין כיס המרה והתריסריון (משולשים). PV, פורטל הווריד. סולם בר = 650 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: NFP חיובי סיבי עצב באזור פופילה התריסריון. צינור המרה המשותף היה מסומן עם לטקס כחול וכלי עם לטקס לבן (*). החצים מראים את העצבון של קצה צינור המרה המשותף, ומשולשים מראים את העצבון של אזור האפיפיור התריסרי (P), שמקורו בצינור המרה וכלי הדם הנפוצים. סולם בר = 1000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת את הליך הניסוי להדמיה של העצבון של דרכי המרה המרגיעה באמצעות נוגדנים נגד חלבון neurofilament. פרוטוקול זה הותאם מן הפרוטוקול המתואר על ידי Kuratani ו Tanaka 1 , 2 , 3 .
עבור ניסוי זה, לתכנן את ציר הזמן עבור כל אחד הניסויים, כמו כל גישת מכתים הר נמשך 2-3 שבועות. כלי המכיל את הרקמה חייב להיות מסובב על nutator בכל עת, למעט במהלך תהליך הקפאה / להפשיר. במיוחד במהלך הדגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, הדגימה נקבע בחדר אחסון קר בעת סיבוב על nutator כדי להבטיח את החשיפה אחידה של הדגימה לפתרונות התגובה. מספר פתרונות - 1% (w / v) חומצה אורתופריאודית, 0.004% (w / v) papain, ואת חיץ דילול עבור הראשוני / משני antiboמת - חייב להיות טרי עבור כל ניסוי. לאורך הפרוטוקול, כדי למנוע נגיעה ופגיעה הדגימה בעת שינוי פתרונות, הפתרונות צריכים להיות שפכו החוצה במקום להיות מוסר עם מלקחיים 15 .
לאחר תיקון עם PFA, דגימות צריך להישטף מספיק עם DW או PBS. בנוסף, הטיפול האנזימטי עם הדגירה papain חשוב. החום והאנזים המשמשים לאחזור אנטיגן מסייעים בהכנת הרקמה לחדירת נוגדנים. כדי לשפר את החדירה של הפתרונות, הממברנה החיצונית של הרקמה צריכה להיות משבשת על ידי טיפול מקפיא ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או -80 ° CO / N 15 .
חשוב לחלוטין להטביע את הדגימה הניסויית בכרכים נאותים של פתרון חיץ על מנת להבטיח כי הפתרון יכול לדגור את הדגימה כולה. זמן הדגירה של הנוגדן העיקרי חייב להיות אמפירי לקבועD עבור רקמות שונות וגדלים מדגם. בדרך כלל, זה חייב להיות 3 ימים עבור מדגם 2-3 ס"מ. הדילול האופטימלי חייב להיות נקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדנים. דילול ב 1: 600 מומלץ הן נוגדנים ראשוניים ומשניים בעת שימוש במאגר נוגדנים המתאים.
עבודה זו מתארת, בפרוטרוט, את הפרוטוקול של גישת צד גישות רב-תכליתי רב-תכליתי לחשוף ביטוי חלבון נוירופילמנט בדרכי המרה של ס 'מורינוס . שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים במינים רבים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של נוגדנים צריך להתבצע.
עם זאת, הטכניקה הייתה מוגבלת בתווית רקמת עצבים רדודה ובבניית מודל תלת מימדי של העצבנות. כמו כן, הוא לא יכול לזהות את המאפיינים של סיבי העצבים ( כלומר סימפתטי או נקובאסימפתטית, מוטורית או חושית, וכו ' ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
למחברים אין תודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
