Summary
Suncus murinus 의 외 간성 담도계에서 neurofilament 단백질 발현을 시각화하기위한 whole-mount immunohistochemical 접근법 . 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 S. murinus 또는 다른 종의 모든 내장 기관의 innervation을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 작품은 전체 마운트 immunohistochemistry 얼룩 방법을 자세하게 설명합니다, 신경 섬유 단백질 항체를 사용하여 Suncus murinus ( S. murinus 의 담즙 기관의 innervation을 표시하기 위해 ). 먼저 표본을 S. murinus 에서 해부시키고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정시켰다. 둘째, 효소 처리 및 잠재적 인 내재적 퍼 옥시 다제 불 활성화가 수행되었다. 그 다음, 시험편을 1 차 항체, 항 - 신경 필라멘트 단백질 항체에 3-6 일 동안 노출시켰다. 이어서, 양 고추 냉이 과산화 효소가 접합 된 2 차 항체와 함께 항온 배양 하였다. 표적을 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질과 반응시켜 발색 반응을 나타내었다. 이 방법은 모든 내장 기관의 신경 분포 분석에 적용 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 다른 뉴런 항체를 테스트하기 위해 적응할 수 있지만, 항체의 최적화es가 먼저 수행되어야합니다. 이 방법은 원래 Kuratani와 Tanaka 1 , 2 , 3 에 의해 도입되었습니다.
Introduction
집 사향 갈기 , Suncus murinus , 주문 Insectivora과 가족 Soricidae에 속한다. 이 작은 포유 동물은 동남 아시아 전역에 분포하며 인간의 거주지 또는 소 펜 4 근처에 위치한 잔디와 풀밭에 서식합니다. 이 종은 마우스, 쥐 및 토끼와 같은 다른 실험 동물보다 인간과 더 유사한 일반적인 형태학적인 특성을 나타낸다. 이전에, S. murinus neurofilament protein (NFP)에 대한 말초 신경 마커를 이용한 whole-mount immunostaining은 췌장 6 , 주요 십이지장 유두 7 , 유두 8 , 담낭 5 및 간외 담도 9 에서 말초 신경을 표지하기 위해 사용되었습니다.
NFP는 성숙한 신경 세포 뼈대의 일부인 거대 분자 복합체입니다. 신경 필라멘트 관련 단백질NFP와 접합체 사이의 상호 작용을 매개한다. 효소 기능과 링커 단백질의 구조는 NFP 10 에 의해 조절됩니다. NFP 복합체는 NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) 및 NF-H (200 kDa)의 세 가지 폴리 펩타이드로 이루어져 있습니다. NFP는 중추 신경계와 말초 신경계에서 신경 세포의 축색 돌기에서 발견 될 수 있습니다. 항 인간 NFP 항체는 중추 신경계와 말초 신경계의 축삭을 표지하는 것으로 나타났습니다. 해부학 적 및 전기 생리 학적 연구 결과에 의하면 괄약근, 담낭 및 근위부 위장관은 11 , 12 , 13 , 14 로 연결되어 있음이 입증되었습니다. 그러나, 그들의 연결 연결의 형태 학적 특징은 아직 정의되지 않았다.
이 연구는 S. murinus bil의 innervation을 표시하기 위해 whole-mount immunohistochemical 염색법을 사용하는 방법을 보여줍니다NFP 항체가있는 iary tract.
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Protocol
모든 실험 절차는 도쿄 도립 대학 동물 애호 관리위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험실 동물 의 관리와 사용을위한 안내서와 동물 보호에 관한 캐나다위원회 의 실험 동물 의 관리와 사용 안내서에 따라 동물을 수용하고 취급했습니다. 우리는 일본 동경 메트로폴리탄 대학교 (Functional Morphology Laboratory) 프런티어 보건 과학부에서 사육되고 유지 된 동물들을 사용했습니다.
1. 동물 배려 및 주거
- 폐쇄 형 번식 식민지에서 7 S. murinus (암컷 3 마리와 체중 70 ~ 90g의 4 마리)를 얻습니다.
- 종이 스트립이 들어있는 나무 둥지 상자가있는 플라스틱 케이지에서 이유 후 (출생 후 20 일) 개별적으로 S. murinus를 감금하십시오. 전통적으로 컨디셔닝 된 동물 룸 (23-27 ° C), 습도 조절 장치, 12시 12시 (h : 12시 12 분)의 암흑 사이클을 유지하십시오. 공급 commerc송어 알갱이와 물을 자유롭게 먹는다.
2. 조직 준비
- 4 % (w / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하기 위해 PFA 40g을 0.01M 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, pH 7.4) 1,000mL에 녹인다. 흄 찬장에서 용액이 깨끗해질 때까지 와동을 사용하여 혼합하십시오. 4 % PFA O / N를 4 ℃에서 보관하십시오.
주의 : PFA를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. - 동물을 관류 및 고정하기 위해 에테르로 마취 한 다음 somnopentyl (pentobarbital sodium, 0.6 mL / kg bodyweight)을 복강 내에 주입하십시오.
- 동물이 완전히 마취 된 후, 메스로 복강을 열고 3cm 정도의 중간 선 복부 절개를 만듭니다. 대동맥을 절개하는 동안 대정맥을 절개하면서이 동맥 분기점 바로 위의 복부 대동맥에 복강 내 카테터를 삽입하여 장골 동맥을 만든다.
- somnopentyl을 주사하십시오 (그래서 pentobarbital1.0 mL / kg 체중). 완전한 안락사 후, 0.01 M PBS (pH 7.4)로 관류시킨 다음 흄 찬장에서 4 % PFA로 관류시킨다.
- 관류 후, 흰 네오프렌 라텍스 (증류수 (DW)가있는 희석 된 흰색 네오프렌 라텍스 3 : 2) 2 ~ 3 mL를 혈관에 라벨을 붙이도록 주사합니다.
- 간, 담낭, 총 담관, 십이지장 및 췌장을 포함한 복부 기관을 관련 신경 및 혈관과 함께 추출합니다.
- 담낭에 약 12 mL의 파란색 네오프렌 라텍스 (희석 한 흰색 네오프렌 라텍스 10 mL에 파란색 잉크 한 방울 넣기)를 담낭에 약 0.1 mL 주입하십시오.
- 전체 마운트 면역 염색을 위해 4 ℃에서 4 % PFA로 밤새 수정하십시오.
주의 : PFA는 유독합니다. PFA를 직접 취급하지 마십시오. PFA는 연기 찬장에서 사용해야합니다.
3. Whole-mount Immunohistochemistry
참고 : 세척, 항체 배양 및 착색을 포함하여 프로토콜 전반에서 the 시편은 4 ℃에서 또는 RT에서 가볍게 흔들어 고정 장치에 남아 있어야합니다 .
- 1 일 : 잠재적 인 내인성 퍼 옥시 다제의 효소 처리 및 불 활성화
- DW 4x로 준비된 시험편을 RT에서 적당한 크기의 유리 병에 1 시간 씩 씻으십시오. PFA를 제거하기 위해 시료를 nutator에서 조심스럽게 흔들어주십시오. 솔루션을 교환 할 때 표본이 손상되지 않도록하십시오.
- 1 % (w / v) 오르토과 요오드 산을 준비하려면 DW 100 mL에 1 g의 오르토 요오드 산을 용해시킨다.
- 내재 peroxidase 반응을 방지하기 위해 RT에서 20 분 동안 1 % orthoperiodic 산성에서 표본을 품어.
- 0.04 mol / L Tris-HCl 완충액 (pH 7.6) 100 mL에 파파인 0.004 g을 녹여 0.004 % (w / v)의 파파인을 준비한다.
- DW로 표본을 RT에서 10 분 동안 씻으십시오.
- 부드러운 흔들림이있는 항온조에서 37 ° C에서 2 시간 동안 새로 준비한 0.004 % 파파인으로 표본을 배양하십시오.
- D로 표본을 씻는다.W에서 50-60 분 동안 처리 하였다.
- 4 ° CO / N에서 4 % PFA에 검체를 보관하십시오.
- 2 일째 : 효소 처리
- 보관 된 시험편을 DW로 4 시간 동안 RT에서 1 시간 씩 씻으십시오.
- 부드러운 흔들림이있는 항온조에서 37 ° C에서 2 시간 동안 새로 준비한 0.004 % 파파인으로 표본을 배양하십시오.
- DW로 표본을 RT에서 50-60 분 동안 씻으십시오. 4 ° CO / N에서 4 % PFA에 검체를 보관하십시오.
- 3 일째 : 동결 치료
- 위와 같이 저장된 표본을 DW 4x로 각각 1 시간 동안 RT에서 씻으십시오.
- 2.5 g, 5 g, 10 g의 자당을 각각 0.01 M PBS 100 mL에 녹여 2.5 % (w / v), 5 % (w / v), 10 % (w / v) pH 7.4).
- 2.5 % (w / v), 5 % (w / v) 및 10 % (w / v) 자당에 각각 30 분 동안 표본을 담그십시오.
- -20 ° C에서 30-60 분 동안 표본을 동결시킨 다음 RT에서 완전히 녹입니다. 3x 사이클을 반복하십시오.
- 피2 % Triton X-100 (v / v)을 다시 채우고 0.01 M PBS (pH 7.4) 100 mL에 2 mL의 Triton X-100을 첨가한다.
- 4 % CO / N에서 2 % Triton X-100에 시험편을 보관하십시오.
- 주 4 : 일차 항체 배양
- BSA (Bovine Serum Albumin) 0.2g, Triton X-100 0.3mL 및 sodium azide 0.1g을 0.01M PBS (pH 7.4) 100mL에 녹여 1 차 항체 희석액을 준비한다.
주의 : 나트륨 아자 이드는 매우 독성이 있습니다. 흡입과 접촉은 피해야합니다. 적절한 PPE를 착용하십시오. - 1 차 항체 (NFP) 1 : 600을 상기 희석 완충액 (단계 3.4.1)에서 희석한다. 검체가 Nator 항체로 4 ° C에서 3 ~ 6 일 동안 배양하여 표본이 nutator에서 부드럽게 흔들리지 않게하십시오. 더 큰 표본은 배양 시간을 늘려야합니다.
- BSA (Bovine Serum Albumin) 0.2g, Triton X-100 0.3mL 및 sodium azide 0.1g을 0.01M PBS (pH 7.4) 100mL에 녹여 1 차 항체 희석액을 준비한다.
- 이차 항체 배양
- RT에서 각각 1 시간 동안 PBS 4x에서 검체를 씻어서 항체가 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 0.2 g의 BSA와 0.3 mL의 Triton X-100을 0.01 M PBS (pH 7.4) 100 mL에 녹여 2 차 항체 희석액을 준비한다.
- 희석 버퍼 (단계 3.5.2)에서 보조 항체 (peroxidase - 접합, 친화 - 정제 양 항 마우스 IgG - HRP) 1 : 600을 희석. 검체를 2 차 항체와 함께 4 ° C에서 3 일 동안 배양하고 검체를 nutator에 부드럽게 흔들어 놓습니다.
- 천연색
- 짙은 냄새가 나는 곳에서 0.05 mol / L Tris-HCl 완충액 (pH 7.6) 100 mL에 3,3'- 디아 미노 벤지딘 테트라 히드로 클로라이드 (DAB) 0.002 g을 넣고 용액을 어둡게 유지하여 DAB 착색 용액을 조제한다.
- 각각 1 시간 동안 PBS에서 4x RT로 시료를 씻으십시오.
- 갓 준비된 DAB 착색 용액에 30 % H 2 O 2 10 μL를 넣고 4 ° C / N 용액 또는 3 일 동안 incubate 한 후 nutator에서 부드럽게 흔들어 준다.
- pla로 반응 중지최적의 염색 강도에 도달하면 0.04 % 나트륨 아자 이드로 PBS로 표본을 넣는다.
참고 :이 단계까지 나트륨 아자 이드의 사용을 피하십시오. 이는 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제를 억제하기 때문입니다.
- 얼룩진 조직 이미징
- PBS가 담긴 페트리 유리 접시 (높이 5cm, 직경 10cm)에 조심스럽게 표본을 옮긴다. 실체 현미경에 장착 된 카메라를 사용하여 전체 장착 이미지를 캡처하십시오.
참고 : 전체 마운트 스테인드 조직은 투명 유리 접시에 PBS에 완전히 담근 채로 이미지해야합니다.
- PBS가 담긴 페트리 유리 접시 (높이 5cm, 직경 10cm)에 조심스럽게 표본을 옮긴다. 실체 현미경에 장착 된 카메라를 사용하여 전체 장착 이미지를 캡처하십시오.
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Representative Results
그림 1 - 4 는 S. murinus의 간외 담관에서 NFP 양성 신경 섬유에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. NFP에 대한 항체는 간외 담도 ( 그림 1 ), 담낭 ( 그림 2 ), 상부 담관 ( 그림 3 ) 및 십이지장 유두 부위 ( 그림 4 )의 전체 이미지에서 높은 특이도 및 최소 배경.
표본의 모든 조직에 대해, 모양과 크기에 관계없이, tegmental 신경은 동시에 염색 수 있습니다. 간외 담도의 신경 분포 외에도 식도와 위의 미주 신경의 진행 및 분포 밀도가 명확하게 나타났습니다 ( 그림 1 ).
그림 2 ).
상부 담관에서 두 종류의 신경 번들이 분류되었다. 미세 신경 번들은 불규칙하고 조밀 한 신경 회로망을 형성하고, 접착력이 좋으며, 담도 상 / 내에 존재합니다. 더 두꺼운 신경 번들은 담도의 표면에 평행하게 분포되었다 ( 그림 3 ).
총 담관은 파란색 네오프렌 라텍스와 흰 네오프렌 라텍스가 붙은 혈관으로 분류되었다. 총 담관의 끝에있는 얇은 신경 섬유와 십이지장 유두 부위는 높은 c ( 그림 4 ).
그림 1 : 담즙 관, 식도 및 위의 NFP 양성 신경 섬유. 화살표는 식도를 따라 위에서 움직이는 미주를 나타냅니다. 도심, 일반적인 담즙 관; 식도, 식도; St, 위장. 스케일 바 = 1300 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 담낭에있는 NFP 양성 신경 섬유. 담낭의 혈관에는 흰색 라텍스가 표시되어 있습니다. 담낭의 목에 풍부한 신경 분포가 나타났습니다 (화살표). 스케일 바 = 1,000 μm.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg"target = "_ blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 상부 담즙 관에있는 NFP 양성 신경 섬유. 두 종류의 신경 번들이 관찰되었다. 하나의 유형은 접착력이 좋고 외 간성 담도 상에 / 그 안에 존재하는 미세 신경 다발이었다 (화살표); 다른 유형은 간 외 담도의 표면에 평행하게 분포되고 담낭과 십이지장 (삼각형) 사이를 달리는 두꺼운 신경 다발이었다. PV, Portal Vein. 스케일 바 = 650 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 십이지장 유두의 NFP 양성 신경 섬유 총 담관은 파란색 라텍스와 혈관에 흰색 라텍스 (*)로 표시했습니다. 화살표는 총 담관의 끝 부분의 innervation을 보여 주며, 삼각형은 일반적인 담즙 덕트와 혈관에서 유래 된 십이지장 유두 부위 (P)의 신경 분포를 보여줍니다. 스케일 바 = 1,000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 neurofilament 단백질에 대한 항체를 사용하여 extrahepatic 담즙 관의 innervation의 시각화를위한 실험 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쿠라 타니 (Kuratani)와 다나카 (Tanaka) 1 , 2 , 3 에 의해 기술 된 프로토콜로부터 수정되었습니다.
이 실험에서는 전체 마운트 염색 접근법이 2 ~ 3 주 동안 계속되므로 각 실험에 대한 타임 라인을 계획하십시오. 동결 / 해동 과정을 제외하고 조직을 담는 용기는 항상 nutator에서 회전해야합니다. 특히 1 차 항체 및 2 차 항체와 함께 항온 처리하는 동안 시험편을 반응 용액에 균일하게 노출시키기 위해 견본을 시험관에서 회전시키면서 냉장 보관실에 놓았다. 몇 가지 솔루션 - 1 % (w / v) 오르토과 요오드 산, 0.004 % (w / v) 파파인 및 1 차 / 2 차 항균제의 희석 완충액죽는다 - 각 실험마다 새로 만들어야한다. 프로토콜 전반에 걸쳐 솔루션을 변경할 때 표본을 만지거나 손상시키지 않으려면 솔루션은 포셉 15 로 제거하는 대신 쏟아야합니다.
PFA로 고정한 후 시료를 DW 또는 PBS로 충분히 세척해야합니다. 또한 파파인 배양을 통한 효소 처리가 중요합니다. 항원 검색에 사용되는 열과 효소는 항체 침투를위한 조직을 준비하는 데 도움이됩니다. 솔루션의 침투를 강화하기 위해 조직의 외부 멤브레인은 -20 ° C에서 30 분 또는 -80 ° CO / N 15 의 동결 처리로 파열되어야합니다.
용액이 전체 표본을 배양 할 수 있도록 충분한 양의 완충 용액에 실험 표본을 완전히 담그는 것이 중요합니다. 일차 항체의 배양 시간은 경험적으로 결정되어야합니다d를 다른 조직과 표본 크기에 맞게 선택합니다. 보통 2-3cm 샘플의 경우 3 일이어야합니다. 최적의 희석은 각 항체에 대해 실험적으로 결정되어야합니다. 적절한 항체 버퍼를 사용할 때 1 차 및 2 차 항체 모두에 대해 1 : 600 희석을 권장합니다.
이 작품은 S. murinus 의 담도에서 neurofilament 단백질 발현을 밝히기위한 다목적 whole-mount immunohistochemical 접근법의 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 방법은 많은 종에서 모든 내장 기관의 신경 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 또한 다른 연결 항체를 테스트하기 위해 적응 수 있지만, 항체의 최적화가 수행되어야합니다.
그러나이 기술은 얕은 신경 조직에 라벨을 붙이고 입체의 3 차원 모델을 구성하는 데에는 한계가있었습니다. 또한, 신경 섬유의 특징을 동정 할 수 없습니다 ( 예 : 교감 신경 또는 파동정맥, 운동 또는 감각 등 ).
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Disclosures
저자는 아무런 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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