Summary
Burada kırmızı hücre deformasyon ve hücresel heterojenite ektacytometry tarafından ölçmek için teknikler mevcut. Bu teknikler kırmızı hücre deformasyon genel araştırmalar ve kan hastalıkları dolaşım, orak hücreli anemi gibi katı ve deforme kırmızı hücrelerinde varlığı ile karakterize belirli soruşturmalar için geçerlidir.
Abstract
Azalan kırmızı hücre deformasyon çeşitli bozukluklar özelliğidir. Bazı durumlarda, arızalı deformasyon ölçüde hastalık şiddeti veya ciddi komplikasyonlar geçtiği tahmin edebilirsiniz. Ektacytometry kullandığı kırmızı kan hücreleri artan kesme stres veya bir ozmotik degrade uygulanan kesme stres sabit bir değerde tabi deformasyon ölçmek için kırınım viscometry lazer. Ancak, doğrudan deformasyon ölçümleri katı ve deforme kırmızı hücreleri varlığı ile karakterize hànzú kan ölçerken yorumlamak zordur. Bu katı hücre yetersizliği düzgün kesme stres ve bariz deformasyon abartılı bir düşüş olarak işaretlenmiş bir çarpık kırınım deseni sonuçlarında yanıt hizalamak için kaynaklanmaktadır. Bozulma derecesi ölçümü kan eritrositler heterojen bir gösterge sağlar. Orak hücreli anemi, bu katı hücreleri, hemoglobin konsantrasyonu ve eritrositler bileşimi hemoglobin yansıtan yüzdesi ile ilişkilidir. Deformasyon ölçme yanı sıra, ozmotik degrade ektacytometry ozmotik kırılganlık ve eritrositler hidrasyon durumu hakkında bilgi sağlar. Bu parametreler de alyuvarlar orak hücre hastaların hemoglobin bileşimini yansıtır. Ektacytometry deformasyon nüfus alyuvar tedbirler ve bu nedenle, bilgi deformasyon veya bireysel eritrositler mekanik özelliği sağlamaz. Ne olursa olsun, burada açıklanan teknikleri amacı deformasyon ve kan hücresel heterojen ölçmek için kullanışlı ve güvenilir bir yöntem sağlamaktır. Bu teknikler geçici değişiklikler, aynı zamanda hastalık ilerleme ve yanıt-e doğru çeşitli hastalıklarda tedavi müdahale izlemek için yararlı olabilir. Orak hücreli anemi iyi karakterize bir örnektir. Kırmızı hücre deformasyon ve/veya heterojenite ölçümleri ilgi nerede diğer olası bozukluklar kan depolama, diyabet, Plasmodium enfeksiyon, demir eksikliği ve hemolitik anemiler membran hatalarından kaynaklanan içerir.
Introduction
Ektacytometry kırmızı hücre deformasyon yanıt değişiklikler makaslama (Paskal (Pa) ölçülen) stres veya orta osmolalite askıya almak için uygun bir ölçüsü sağlar. Kırmızı hücre deformasyon uygun parametreleri içeren en fazla uzama Index (EI Max), en fazla deformasyon (SS ½) yanıt olarak artan kesme stres ve yamultma stres ½ kırmızı hücre bir ölçüsü, yarım maksimal ulaşmak için gerekli kesme stres Deformasyon. 1 ozmotik degrade ektacytometry çok bilgilendirici parametresi vardır. Bu uzama dizin en az (EI dk), yüzey hacim oranı bir ölçüsü ve bu gerçekleştiği (O dk), osmolalite içerir hangi ozmotik kırılganlık ölçümüdür. EI Max ve (O (EI Max)) gerçekleştiği osmolalite bilgi membran esneklik ve hücre yüzey alanı üzerinde sağlar. Ozmotik geçişin hipertonik kolundan yarım maksimal uzama EI hiper tarafından temsil edilir. EI hiper ve hangi oluşur, osmolalite O hiper, hemoglobin konsantrasyonu tarafından belirlenen kırmızı hücre hücre içi viskozite hakkında bilgi sağlar. 2 , 3 ölçüm deformasyon hànzú kan kırmızı kan hücreleri, orakla gibi katı hücrelerin düzgün kesme stres artan karşılık deforme hücreleri gibi akış yönü ile hizalamak değil Aslında tarafından karmaşıktır. Karakteristik eliptik kırınım görüntü üretmek yerine, sert hücreleri deforme hücreleri tarafından üretilen elips üzerinde overlaid bir elmas şeklindeki kırınım deseni sonuçlanan bir küresel model üretmek. 4 , 5 , 6 küresel desen geri dönüşümsüz orakla hücrelere yoğunluğu aralıklarla takip hücreleri izole kesirler üzerinde ektacytometry gerçekleştirerek karşılık gelecek şekilde gösterilmiştir. 6 uzama Endeksi Hesaplama uzun ve kısa eksen elipsin kararlaştırıldı; eşkenar dörtgen bu nedenle kısa eksen genişliğini artırarak uzama belirgin bir düşüş üretir. 7 aynı daha önce kırınım deseni bozulma derecesini Orak hemoglobin (HbS) yüzdesi ve Orak hücre anemisi olan hastalarda kan hücrelerinde orakla yüzdesi ile korelasyon gösterilmiştir. 5 tarafından karmaşık matematiksel çözümlemeleri kırınım deseni bozulma derecesini elde edilebilir. 8 bu aynı zamanda ektacytometer üzerinde kamera diyafram açılması veya gri kırınım deseni yüksekliği değiştirmek için uygun yazılım düzeyini ayarlayarak elde edilebilir. 5 ancak, gri düzeyi ayarlamak nasıl ilgili ayrıntıları iyi tanımlanmış değildir ve kamera diyafram piyasada bulunan ektacytometer son nesil kolayca erişilebilir değil. Bu sorunları aşmak için kolayca erişilebilir kamera kazanç kırınım deseni yüksekliklerini ayarlamak için kullanılabilir. 9 hücresel heterojenite tahmin etmek için bu yöntemi kullanarak, kırınım deseni bozulma derecesini fetal hemoglobin orak hücre anemisi olan hastalarda kandaki yüzdesi ile ilişkili olabilir. 10 birkaç ozmotik degrade ektacytometry parametreleri aynı şekilde fetal yüzdesi ile ilişkili veya Orak hemoglobin orak hücre anemisi olan hastalarda kan içinde. Kırınım deseni bozulma korelasyon büyük olasılıkla hemoglobin kompozisyon katı, deforme olmayan hücreleri yüzdesini katkısını yansıtır. Ek ilgi tüm ozmotik degrade ektacytometry profil dolaşımı orak hücre krizi sırasında yoğun hücre yüzdesi karşılık bifazik değişiklikleri uğrar. 11
Ektacytometry aynı şekilde birkaç diğer bozuklukları çalışmada yararlıdır. Ozmotik degrade ektacytometry tanı için devralınan kırmızı hücre membran bozuklukları kalıtsal sferositoz, kalıtsal elliptocytosis ve kalıtsal pyropoikilocytosis gibi. 3 , 12 , 13 , 14 demir eksikliği azalmış deformasyon oluşur. 15 -olan istihdam karakterizasyonu "depolama lezyon" kan ektacytometry ve gelecekteki çalışmalar her iki lezyon doğasını araştırıyor ve banked kan depolama sırasında onun oluşumunu önlemek için müdahale etmek büyük olasılıkla Burada sunulan teknikleri. 16 azalmış kırmızı hücre deformasyon da mikrovasküler diyabet hastalığında ile ilişkili. 17 bu faktörler mikrovasküler hastalığı gelişiminde önemli olabilir kırmızı hücre askorbat konsantrasyonları ve ozmotik kırılganlık son çalışmalar, hiperglisemi bağlantı öneririz. 18 Ektacytometry çalışmalar şu anda bu hipotez araştırmaya devam etmektedir (Parrow ve Levine, yayınlanmamış veri). Kan sahne alanı sıtma başka bir ilginç avenue kırmızı hücre deformasyon soruşturmaların enfeksiyondur. Plasmodium falciparum hücresel deformasyon 48 saatlik hücre içi yüzük aşamasından parazit schizont sahne için olgunlaşma sırasında önemli ölçüde azalır kırmızı kan hücreleri enfekte. Kanıt bu düşük deformasyon parazit olgunlaşma ters gösterir. Ters enfekte kırmızı hücreleri sürümü ile dolaşıma denk geliyor. Düşük Deformasyon kırmızı hücre tutma teşvik Plasmodium proteinler tarafından aracılı düşünülmektedir. 19 bu çalışmalar ölçüm eritrosit deformasyon ve ozmotik degrade parametreleri ilgili olduğu klinik olarak önemli koşullardan küçük bir örnekleme temsil eder. Çalışmanın birkaç ek alanlar adlı biri yok.
Kırmızı hücre deformasyon ölçmek için alternatif teknikleri tek kırmızı hücreleri bir veya daha fazla yönde germek için fotonlar fiziksel özellikleri'ni (lazer tuzakları da bilinir) optik cımbız içerir. 20 bu tekniği tek eritrositler, deformasyon ölçme avantajı vardır ama bazı belirsizlik kuvvet yapılmasından çalışmaları 21 önemli ölçüde değişkenlik üretti ve veri analizi emek yoğun olabilir sürece otomatik. 22 micropipette bir eritrosit Aspire için negatif basınç kullanır, micropipette aspirasyon da deformasyon alyuvar ölçmek için kullanılmıştır. 7 , 23 kırmızı hücre Aspire için gerekli basınç gibi birden fazla ölçüm kırmızı hücre farklı özelliklerini tanımlayan her ölçü ile mümkündür. 23 Atomik kuvvet mikroskobu kırmızı hücre yüzey boyunca konsol saptırma bir göstergesi olarak lazer ışını saptırma miktarının tarafından membran sertlik ölçer bir yüksek çözünürlüklü tekniktir. 24 bu teknikler bireysel eritrositler hakkında bilgi, kolayca kırmızı kan hücrelerinin nüfus değişiklikleri ölçmek ve genel olarak, önemli teknik uzmanlık gerektiren için adapte değil.
Arzu örnek birey ve nüfus hücre aynı anda gelişmeler otomasyon ve havacilik ve dizi tabanlı yöntemler geliştirilmesi yol açmıştır. Ektacytometry gibi rheoscopy deformasyon kesme stres bir fonksiyonu olarak ölçer ama görüntüleri doğrudan mikroskop yolu ile iktisap. 25 daha yüksek yerine aracılığıyla analizleri için otomatik hücre görüntüleme deformasyon dağılımları rheoscope kullanarak üretmek için istihdam edilmiştir. 26 bir sağlıklı denetim konu verilerden kullanılabilir yoksa hücresel heterojenite bu yöntemle sayısal. 27 havacilik teknikleri de tek hücreler yüksek yerine aracılığıyla analizleri için izin; uyarlamalar filtrasyon,28 hücre transit Analizörleri, bir micropore ile bir eritrosit akışı için gereken zamanı ölçer29 ve eritrosit transit için oldukça gerekli basıncı ölçmek alternatifleri kullanarak birden çok tasarımlar zaman 30 ' dan geliştirilmiştir. Başka bir tek tek hücreler yüksek yerine yoluyla çözümlenmesi için aşağı akım Floresans tabanlı karakterizasyonu hücreleri için izin ek avantajı tek hücre microchamber dizi çip platformudur. 31 bu tekniklerin herbirini potansiyel olarak yararlı ve belirli uygulamalar için üstün olabilir rağmen ektacytometry karşılaştırmalı avantajlarını içerir duyarlılık, kullanım kolaylığı ve hassas. 32 piyasada bulunan ektacytometers son nesil de gerçekleştirilebilir deneyleri sayısında önemli çok yönlülük sahip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada tüm konular Helsinki Bildirgesi ve ulusal kurumları, Sağlık Kurumsal inceleme onaylı kurulu iletişim kuralları uyarınca yazılı onay verdi.
1. ektacytometer açma
- Tüp temizleme solüsyonu düşük ve yüksek osmolar polyvinylpyrrolidone (PVP) çözümleri için bağlayın. Düşük osmolar çözüm için 0 osmolar tüp ve 500 osmolar tüp yüksek osmolar çözüme bağlamak dikkat et.
Not: Düşük osmolar PVP çözüm 7.25-25 ° C 7.45 pH ve viskozite için 37,0 ± yönü 27.0 ve 33.0 centipoise (cP) arasında bir osmolalite (mOsm/kg), kilogram başına 35 ve 55 milliosmoles arasında olmalıdır 0.5 ° C. Yüksek osmolar PVP çözüm-meli-si olmak bir osmolalite 764 ve 804 mOsm/kg, 7.25-25 ° C 7.45 pH ve 27.0 33.0 cP viskozite ölçüsü arasındaki 37,0 ° 0.5 ° C. - Bob fincan içine tamamen indirilir sağlamak. Yazılımı başlatmak ve makine prime (kontrol madeni eşya | Araç IO). Astar döngüsünü tamamlamak araç sağlar. Döngüsü tamamlandıktan sonra bob kadehi kaldırmak ve bob ve kupa ile düşük bir tüy bırakmayan dokusu temizlik kurumasını.
Not: Artık su kırmızı girişim üreten hücrelerin, parçalayıcı.
2. ölçme deformasyon kesme stres artan bir fonksiyonu olarak
- Kan (1 mL bu teknikleri ile gerçekleştirmek yeterli olduğunu daha az çoğaltır) uygun bir antikoagülan içeren şişede edinin.
Not: Hemorheological parametreleri üzerinde daha az etkisi vardır çünkü EDTA heparin tercih edilir. 33 ölçümleri kan 6 saat içinde gerçekleştirilmesi durumunda, oda sıcaklığında tutmak kan. - Tam kan örnek birkaç kez şişeyi ters çevirme tarafından test etmeden önce karışımı yavaşça. Pipetting tarafından ISO-osmolar PVP çözüm için 5 mL tam kan 25 µL ekleyin, şişeyi kap ve karışımı yavaşça birkaç kez ters çevirme. ISO-osmolar PVP çözüm bir osmolalite 284 ve 304 mOsm/kg, pH değeri 7.3-7,4 25 ° c ve viskozite 27.0 33.0 cP arasında olmalıdır 37,0 ± 0,5 ° c
- Yazılım üzerinde deformasyon ana menüden seçin. Yeni bir analiz oluşturmak ve deneysel bilgi eklemek (deformasyon | İstediğiniz ayrıntıları Ekle | Tamam).
- Kapak ektacytometer için Kaldır, bob tam bardağa indirilir ve Kupası dönüyor doğrulayın.
- Pipetting tarafından Kupası ve bob arasındaki boşluğa 1 mL PVP kan çözeltisi ekleyin.
- Örnekleri biraz getirmek bob kaldır. Tüm kabarcıklar dışında çözüm gidinceye kadar bekleyin, sonra ektacytometer için kapağını kapatın. Gerekirse, kabarcıklar kaldırmak için aspirasyon düğmesine basın.
- Yazılım ok boyunca kaydırma çubuğunu taşıyarak 200 kazanç ayarlayın (bkz. Not). Sıcaklığı 37 ° C'de kararlı ve kırınım görüntü stabil, basın başlatmak (Başlangıç).
Not: Birçok çalışma için iyi kırınım görüntü sağlıklı kandan (hemoglobin konsantrasyonu > 12.0 g / dL, 80-96 fL ortalama corpuscular hacmi ve ortalama corpuscular hemoglobin konsantrasyonları 33-36 g/dL) 200'e ayarlayın kamera kazancı elde edilebilir. Orak hücreli anemi kan çalışmaları için 4,5 cm kırınım görüntü oluşturmak için kamera kazanç ayarlama çalışmalar ve laboratuvarlar arasında karşılaştırma sonuçlarının izin vermek için varsayılan ayar olarak sürülmüştür. 9 - Kırınım desenler onlar dairesel, eliptik kalmasını sağlayacak şekilde veri edinme ilerledikçe veya elmas şeklindeki olarak gözlemlemek. Veri toplama işlemi tamamlandığında raporu kaydedebilir veya yazdırabilirsiniz (dosya | Kaydet veya dosya | Yazdırma). EI Max ve SS değerleri otomatik olarak kullanıcı tarafından belirtilen için karşılık gelen uzama endeksleri ile birlikte bildirilir veya varsayılan ½ gerilmeler kesme. Veri aynı zamanda yazılım tarafından otomatik olarak kaydedilir.
- Sonunda iletişim kutusundaki bilgisayar monitör (temiz) temiz Seçenek tuşuna basın. Örnek emişli sonra Kupası ve bob arasındaki boşluğu uzaya araç temiz döngüsünde kalırken deiyonize su oyuncak tarafından durulayın. Temiz döngüsü tamamlandıktan sonra bob kadehi kaldırmak ve bob ve kupa ile düşük bir tüy bırakmayan dokusu temizlik kurumasını (kritik: artık su kırmızı girişim üreten hücrelerin, parçalayıcı).
- Ana sayfaya (Ana Menü) dönmek üzere yazılımı ana menü düğmesini tıklatın.
3. ölçme hücresel heterojenite
- Tam kan örnek birkaç kez şişeyi ters çevirme tarafından test etmeden önce karışımı yavaşça. Damlalıklı 25 µL bütün kan için ISO-osmolar PVP çözüm, yeni 5 mL şişe şişeyi kap ve karışımı yavaşça karışım homojen olana ters çevirme.
- Deformasyon ana menüden seçin. Yeni bir analiz oluşturmak ve deneysel bilgi eklemek (deformasyon | İstediğiniz ayrıntıları Ekle | Tamam).
- Kapak ektacytometer için Kaldır, bob tam bardağa indirilir ve Kupası dönüyor doğrulayın.
- Damlalıklı Kupası ve bob arasındaki boşluğa PVP kan çözeltinin 1 mL.
- Tüm kabarcıklar dışında çözüm gidinceye kadar bekleyin, sonra ektacytometer için kapağını kapatın.
- İstikrarlı kırınım görüntü ekranda mevcut olduğundan emin olun. Kamera kazanç 3.8 cm kırınım yükseklik ürettiği kadar yazılım ok scrollbar boyunca taşıyarak ayarlayın. Bilgisayar ekranında resmin yüksekliğini doğrulamak için bir cetvel kullanın.
- Sıcaklığı 37 ° C'de kararlı ve kırınım görüntü stabil, basın başlatmak (Başlangıç).
- Kırınım desenler onlar yuvarlak, Oval veya elmas şeklindeki kalmasını sağlamak için veri edinme ilerledikçe gözlemlemek. Veri toplama işlemi tamamlandığında raporu kaydedebilir veya yazdırabilirsiniz (dosya | Kaydet veya dosyası | Yazdırma).
- Sonunda iletişim kutusundaki bilgisayar monitör (Clean) temiz Seçenek tuşuna basın. Örnek emişli sonra Kupası ve bob arasındaki boşluğu araç temiz döngüsünde kalırken fışkırmak şişe deiyonize su içine oyuncak tarafından durulayın. Temiz döngüsü tamamlandıktan sonra bob kadehi kaldırmak ve bob ve kupa ile düşük bir tüy bırakmayan dokusu temizlik kurumasını (kritik: artık su kırmızı girişim üreten hücrelerin, parçalayıcı).
- 2.1-2,5 adımları yineleyin ve kamera kazanç 4,5 cm kırınım deseni Yükseklik (Adım 2.2) elde etmek için ayarlayın.
- 2.1-2,5 adımları yineleyin ve kamera kazanç 5.4 cm kırınım deseni Yükseklik (Adım 2.2) elde etmek için ayarlayın.
- Sonunda, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı (Ana Menü) ana sayfasına dönmek için ana menü düğmesini tıklayın.
- EI Max yüzde olarak temel kırınım deseni bozulma derecesini belirlemek için aşağıdaki denklemi (aynı denklemin 4,5 cm kırınım deseni yükseklik gelen verilerle istenirse gerçekleştirilebilir) kullanın:
- Benzer şekilde, kırınım derecesini belirlemek için bildirilen SS1/2 değeri ile aynı denklemin SS1/2 kullanım desen bozulma dayanarak:
4. ozmotik degrade ektacytometry
- Örnek 1. 1'açıklandığı gibi elde edilir. Tam kan örnek birkaç kez ters çevirme tarafından test etmeden önce karışımı yavaşça. Pipetting tarafından 5 mL ISO-osmolar PVP şişe için tam kan 250 µL eklemek, şişeyi kap ve karışımı yavaşça karışım homojen olana ters çevirme.
- Osmoscan (Osmoscan) ana menüden seçin. PVP çözüm makinenin sol taraftaki iğneyi altında kan içeren flakon yerleştirin. Şişenin dibinde dokunana dek iğne indirin. Boru düzgün degrade üretimi için alçak ve yüksek osmolar çözümlerine bağlı olduğundan emin olun. Ektacytometer için kapağını kapatın ve tüp girin kan izleyebilirsiniz böylece alt yarısında kapıyı açın.
- Basın yeni analiz ve türü deneysel ayrıntılarda (Osmoscan | Yeni analiz | İstediğiniz ayrıntıları girin | Tamam). Yazılım kontrol ok taşıyarak 200 kamera kazanç ayarlayın ve makinenin kan araç altında boru üzerinden Kupası girerek görülür kadar çalışmasına izin verir.
- Bir kez kan Kupası giriş yaptı ve bilgisayar ekranında istikrarlı kırınım deseni görüntüdür, veri toplama başlangıç şimdi basarak iletişim kutusundaki (şimdi Başlat) düğmesini başlar.
- Yaklaşık 500 mOsm/kg kadar verileri elde etmek ektacytometer izin verin ve sonra Aracı durdurun. Kaydetmek veya yazdırmak rapor (dosya | Kaydet veya dosya | Yazdırma). Veri de otomatik olarak kaydeder.
- Eski PVP-kan şişeyi kaldır. Deiyonize su içeren temiz bir şişe ile değiştirin. O iğneyi altında yer, şişe dibinde dokunduğu için iğne getirilecek ve degrade sistemi (durulama) durulama için iletişim kutusundaki durulama düğmesine basın.
- Durulama işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar monitör (temiz) iletişim kutusundaki temiz Seçenek tuşuna basın. Temiz döngüsü tamamlandıktan sonra bob kadehi kaldırmak ve bob ve kupa ile düşük bir tüy bırakmayan dokusu temizlik kurumasını (kritik: artık su kırmızı girişim üreten hücrelerin, parçalayıcı).
Not: Osmoscan rapor uzama endeksleri ozmotik degrade boyunca sağlar. EI Min, O (EI dk), EI Max, O (EI Max), EI hiper ve O hiper otomatik olarak oluşturulur ve rapora dahil. Sağlıklı gönüllüler 9 kandan elde edilen ozmotik degrade ektacytometry parametreleri aralığıdır: EI Min 0,12-0.196 rasgele birimleri (yapıyordum); Ey Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 yapıyordum; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI hiper 0.278-0.286; O hiper 454-505 mOsm/kg.
5. ektacytometer kapatma
- Kapamak aşağı önce araç düzgün temizlik.
- Bunu yapmak için düşük ve yüksek osmolar çözümlerinden tüp temizleme solüsyonu önde gelen y-adaptörü bağlayın. Makinenin sol taraftaki iğneyi aşağıda temizleme solüsyonu içeren bir flakon yerleştirin ve şişe dibinde dokunana dek iğne indirin. Bob fincan içine tamamen indirilir sağlamak.
- Yakın başlangıç yazılım ve basın gün temiz iletişim kutusunu bilgisayar monitör ucunda (yakın | Başlangıç). Araç tamamen temizlik aracılığıyla geçiş yapmak izin.
- Atık şişe için Boru kesme ve atık atmak için araç kaldırın. Bob tamamen kuru. Makineyi kapat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu el yazması açıklanan ektacytometry sonuçlar kırmızı hücre deformasyon herhangi bir durumda ölçmek için kullanılabilir. Bir ektacytometer Genel Kurulum şeması şekil 1' de gösterilen. Eritrositler homojen nüfus yanıt-e doğru Şekil 2' de gösterildiği gibi uzama dizin hesaplamak için kullanılan kesme stres artan bir eliptik kırınım deseni üretecek. Katı kırmızı hücreleri değil düzgün deforme hücrelerle hizalama ve bindirmeleri kırınım deseni bir elmas kaynaklanan elips şeklinde bir küresel model üretmek için kırınım deseni bozulma hànzú Kan örneklerinde oluşur. Bu bozuk desen giderek tespit gibi kamera kazanç şekil 3' te gösterilen büyük kırınım deseni boyutları oluşturmak için ayarlanır. Sağlıklı gönüllüler, bulunan homojen kan nüfus üretmek farklı deformasyon eğrileri farklı kırınım boyutları ölçülen zaman (şekil 4A). Buna ek olarak, hànzú kan nüfus, orak hücre anemisi olan hastalarda kan gibi deformasyon ölçümleri önemli düşüşler kırınım deseni boyutu (şekil 4) bir fonksiyonu olarak göster. Kırınım deseni bozulma düzeyini EI Max, bir işlev olarak kullanılarak ölçülen Orak kan, bu HbS (şekil 5A) ve yetişkin hemoglobin varyant, HbA2 (şekil 5C) ile ilişkilidir. Kan nakli bozulması, normal yetişkin hemoglobin (HbA) kan (şekil 5 d) yüzdesi ile onun ters ilişki tarafından belirtildiği şekilde düzeltir. Kırınım deseni bozulma derecesini kesme stres ½ (şekil 5B) bir fonksiyonu olarak veya EI Max (şekil 5E) bir fonksiyonu olarak ölçülür olsun, fetal hemoglobin ile ilişkilidir. Ancak, ikinci eski daha güçlü bir ilişkidir. O (EI Max), EI Min ve O dk gibi anahtar ozmotik degrade ektacytometry parametreleri sırasıyla hücresel hidrasyon, yüzey hacim oranları ve ozmotik kırılganlık, hakkında ek bilgi sağlar. Orak kandan elde edilen ozmotik degrade eğrileri şekil 6' da gösterildiği gibi hipertonik bölgede giderek belirgin hale işaretli deformasyon düşüşler ile karakteristik sol-kaymıştır.
Resim 1 . Ektacytometer tuzak şematik. Bir dış Kupası aralarında yerleştirilir tanımlanmış viskozite bir PVP çözüm resuspended kan üzerinde kesme stres oluşturur için sabit bir bob etrafında döner. Kırınım deseni ile çözüme geçer bir lazer tarafından üretilen ve kırınım deseni bir projeksiyon ekranında görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Kırınım deseni ve uzama dizin arasındaki ilişkiyi genel bir bakış. Yanıt stres yamultmak için sağlıklı kandan elde edilen kırınım deseni beklenen eliptik desen gösterir. Uzama Index (EI) denklemi kullanarak belirtilen 7hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Hücresel heterojenite üretir kırınım deseni distorsiyonları. Kırınım desenler elde bir orak hücreli anemi hastadan kan üzerinden kamera kazanç üretmek için ayarlandığında A) 3.8 cm kırınım deseni B) 4,5 cm kırınım deseni ve C) 5.4 cm kırınım deseni. Deformasyon eğrileri bariz deformasyon ilerici bir düşüş ve karşılık gelen bir artış belirgin kesme stres ½, gösterilen belirtilen hatları, kamera kazanç üretmek için ayarlandığında aynı kandan D) 3.8 cm kırınım desen, E) 4,5 cm kırınım deseni ve F) 5.4 cm kırınım deseni. [Parrow ve arkizninden tarafından yeniden basıldı. 10]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Kırınım deseni distorsiyonları kesme gerilmeler orak hücre anemisi olan hastalarda kan içinde bir dizi genelinde deformasyon belirgin bir azalma üretmek. Üretilen deformasyon eğrileri karşılaştırılması A) sağlıklı gönüllülerden kan ve B) 3.8 cm, 4,5 cm ve 5.4 cm kırınım deseni boyutu oluşturmak için kamera kazanç ayarlayarak orak hücre anemisi olan hastalarda kan. Orak hücre anemisi olan hastalarda, ancak sağlıklı gönüllüler, kan ile oluşturulan deformasyon eğrileri ilerici ve önemli düşüşler bariz deformasyon kadar az 5 Pa shear strese yanıt kırınım bir fonksiyonu olarak göster: desen boyutu. [İzninden Renoux ve arktarafından yeniden basıldı. 9]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Kırınım deseni bozulma derecesini orak hücre anemisi olan hastalarda kan içinde hemoglobin bileşimi ile ilişkilidir. Doğrusal regresyon analizleri göstermek arasındaki ilişkiyi A) EI Max tabanlı bozulma deformasyon ve HbS, yüzdesini B) SS 1/2 tabanlı bozulma deformasyon ve fetal hemoglobin (HbF), yüzdesini C) EI Max tabanlı bozulma deformasyon ve HbA2, yüzdesini D) deformasyon ve HbA yüzdesini EI Max tabanlı bozulma ve E) doğrudan karşılaştırma, EI Max tabanlı bozulma amaçları için deformasyon ve HbF yüzdesi orak hücre anemisi olan hastalarda kan içinde. Pearson ürün momenti korelasyon katsayısı, rve karşılık gelen p-değeri gösterilir. [İzin Parrow ve ark.10tarafından yeniden basıldı]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Orak hücreli anemi ile bir hastadan kan karakteristik bir sola kaydırma ozmotik degrade ektacytometry tarafından analiz zaman sağlıklı gönüllü gelen kan için karşılaştırıldığında düşük deformasyon ile eşlik eden gösterir. Sağlıklı gönüllü (-) kan önemli parametreleri belirtilen konuma sahip bir temsilcisi ozmotik degrade ektacytometry eğrisi gösterir. Ozmotik degrade değerleri'sağlıklı gönüllü olan EI Min, 146.3 mOsm/kg O dakika, EI Max için 0.576 yapıyordum ve O hiper için 473 mOsm/kg için 0.143 yapıyordum. Orak hücreli anemi ile bir hastadan kan ile oluşturulan bir temsilcisi ozmotik degrade ektacytometry eğrisi (-) overlaid. Ozmotik degrade orak hücre kandan 0.237 yapıyordum EI Min, 110.3 mOsm/kg O dakika, EI Max için 0.429 yapıyordum ve O hiper için 406 mOsm/kg için değerlerdir. [Parrow ve arkizniyle uyarlanmıştır. 10]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan ektacytometry teknikleri basit ve de otomatik, geçerli ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlanması. Yine de, bazı önemli adımlar vardır. Uygun sıcaklık kontrolü kan önemlidir. Depolama sekiz saatten fazla oda sıcaklığında SS ½ etkileyebilir değerleri. 34 suspending ortamın viskozitesi sıcaklık bağımlı olduğu gibi makine sıcaklığı 37 ° C'de stabil sağlama da önemlidir. Kan tamamen ilgi deneysel parametreleri bunlar sürece düşük deformasyon olmayan oksijenli veya kısmen oksijenli örnekleri, doğan önlemek için oksijenli. 35 açısından bakıldığında, araçları, uygun aracı Temizleme Aracı ile kurutma ve bloğu sıvı akış sertleşmesine olacak gibi tüp veya bob giriş noktasını kalan hiçbir PVP olması için önemlidir. Bu ayrıntılara dikkat doğru sonuçlar teşvik ve araç iyi çalışır durumda tutmak.
Hücresel heterojenite miktar değişiklik yapılması gerekebilir. 3.8 cm kırınım deseni sarp bir damla en yüksek kesme stresleri uzama dizinde bazı örnekler göstermek. Bu zaman zaman taze bir örnek ile ölçüm tekrar ederek üstesinden gelebilir. Aksi halde, kırınım deseni bozulma derecesi bir uzama dizin değeri daha düşük bir makaslama stres ölçülebilir veya 4,5 cm kırınım deseni kullanılabilir. 9 da çünkü elips uzun ekseninin de uzun bile en düşük kamera kazanç 3.8 cm kırınım deseni sağlıklı kan elde etmek zor olabilir. Yine, 4,5 cm kırınım deseni veri bu sorunu aşmak için kullanılabilir. Karşılaştırmalar sadece aynı veri noktası ve kırınım deseni boyutu kullanılarak hesaplanan verileri mümkün olduğu gibi seçilen değeri Elbette, deney sabit tutulmalıdır. Hücresel heterojenite önlemler kurmak cihazda bağımlı olduğundan, iç doğrulama kırınım deseni distorsiyonları izole hücre kesirler ölçerek elde edilebilir veya tam olarak tanımlanan kesirler, aşağıdaki yoğunluğu karışımları Santrifüjü daha önce açıklandığı gibi. 6
Birçok ektacytometry parametreleri için hasta özellikleri duyarlı olduğunu unutmamak gerekir. Orak hücreli anemi örneklerde Alfa globin durumu,36 MCV 37 ve kan nakli içerir. 10 bu nedenle, klinik çalışmalar dikkatle tasarlanmış olması gerekir ve bu ilişkiler için ektacytometry verileri yorumlarken hesaba katılması gerekir.
Başka bir önemli uyarı azaltılmış ektacytometry ölçümleri ve kırmızı hücre survival azalma arasında doğrudan bir genel ilişki değil mi. Güneydoğu Asya ovalocytosis gibi ciddi azalma deformasyon ile asemptomatik koşulu mevcut. 38 ancak, karmaşık ve hücre yüzey alanı hacim oranı (küresellik), sitoplazmik viskozitesi (hücresel hemoglobin konsantrasyonu) ve membran sertlik bağımlı deformasyon ölçümleri herhangi bir tekniği ile vardır. Kırmızı hücre Reolojisi aynı şekilde karmaşıktır ve çeşitli vasküler yatak fizyolojik kan akışında karmaşıklığı üretebileceği bir tekniği kullanılabilir değil. Ektacytometry yine de değişmiş kırmızı hücre deformasyon ve Reolojisi önemli anlayışlar sağlar.
Birincil ektacytometry tek tek hücreleri içinde deformasyon ölçmek için yetersizlik kısıtlamasıdır. Böylece, orak hücreli anemi, heterocellular dağılımı, belirli bir eritrosit deformasyon üzerinde olan fetal hemoglobin katkısını belirlemek için yolu yoktur. 10 aynı şekilde, bir hastadan enfekte Plasmodium kanlar içinde parazit olgunluk belirli kırmızı kan hücre içindeki etkisini belirlemek için yolu yoktur. 19 Bu yöntemlerle elde edilen ile karşılaştırma ektacytometery-den sonuçlanmak gelecek çalışmalar tek tek hücreler değerli olurdu için uygun. Bu sınırlama ne olursa olsun, ektacytometry eritrositler rheological özelliklerini ve kan nüfus heterojen rahat ve hassas ölçüsü sağlar. Bu veriler çeşitli bozuklukları çalışmada önemli ve sık sık klinik alaka vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal diyabet kurumları, sindirim ve böbrek hastalıkları ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural araştırma programıyla desteklenmiştir. Bu düşünceleri dile getirdi yazarlar sorumluluğunda ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
