Summary
Aqui nós apresentamos técnicas para medir a deformabilidade eritrócitos e heterogeneidade celular por ektacytometry. Estas técnicas são aplicáveis às investigações gerais de deformabilidade eritrócitos e investigações específicas de doenças do sangue caracterizadas pela presença de eritrócitos rígidas e deformáveis em circulação, tais como anemia falciforme.
Abstract
Deformabilidade eritrócitos diminuída é característica de vários distúrbios. Em alguns casos, o grau de deformabilidade defeituoso pode prever a severidade da doença ou a ocorrência de complicações sérias. Ektacytometry usa a laser viscosidade de difração para medir a deformabilidade dos glóbulos vermelhos, sujeitos a crescente tensão de cisalhamento ou um gradiente osmótico em um valor constante de tensão de cisalhamento aplicada. No entanto, medições de deformabilidade direto são difíceis de interpretar quando medindo sangue heterogênea que se caracteriza pela presença de eritrócitos rígidas e deformáveis. Isto é devido à incapacidade das células rígidas para alinhar corretamente em resposta à tensão de cisalhamento e resulta em um padrão de difração distorcida, marcado por uma exagerada diminuição da deformabilidade aparente. Medição do grau de distorção fornece um indicador da heterogeneidade das hemácias no sangue. Na anemia falciforme, isto está correlacionado com a porcentagem de células rígidas, que reflete a concentração de hemoglobina e a composição da hemoglobina das hemácias. Além de medir a deformabilidade, ektacytometry gradiente osmótico fornece informações sobre a fragilidade osmótica e o status de hidratação de eritrócitos. Estes parâmetros também refletem a composição da hemoglobina das células vermelhas do sangue de pacientes de anemia falciforme. Ektacytometry mede deformabilidade em populações de células vermelhas e não, portanto, fornecer informações sobre a deformabilidade ou propriedades mecânicas de eritrócitos individuais. Independentemente disso, o objetivo das técnicas descritas neste documento é fornecer um método conveniente e confiável para medir a deformabilidade e heterogeneidade celular do sangue. Estas técnicas podem ser úteis para monitorar mudanças temporais, bem como a progressão da doença e resposta à intervenção terapêutica em diversos transtornos. A anemia falciforme é um exemplo bem caracterizado. Outros distúrbios potenciais onde medidas de deformabilidade eritrócitos e/ou heterogeneidade são de interesse incluem o armazenamento de sangue, diabetes, infecção Plasmodium , deficiência de ferro e as anemias hemolítica devido a defeitos de membrana.
Introduction
Ektacytometry fornece uma medida conveniente de deformabilidade eritrócitos em resposta a alterações na tensão de cisalhamento (medida em Pascal (Pa)), ou suspendendo a osmolalidade média. Parâmetros pertinentes de deformabilidade eritrócitos incluem o índice de alongamento máximo (Max de El), uma medida da máxima da deformabilidade de uma célula vermelha em resposta à crescente tensão de cisalhamento e a tensão de cisalhamento ½ (SS ½), a tensão de cisalhamento necessária para alcançar o máximo de metade deformabilidade. 1 ektacytometry gradiente osmótico tem vários parâmetros informativos. Estes incluem o índice de alongamento mínimo (EI Min), uma medida da proporção de superfície e o volume e a osmolalidade em que ocorre (O Min), que é uma medida de fragilidade osmótica. EI Max e a osmolalidade em que ocorre (O (EI Max)) fornecem informações sobre a área de superfície da membrana flexibilidade e celular. Alongamento máximo metade no braço hipertônico do gradiente osmótico é representado pela EI hiper. EI hiper e a osmolalidade em que ele ocorre, O hiper, fornecem informações sobre a viscosidade intracelular da célula vermelha que é determinada pela concentração de hemoglobina. 2 , 3 medição deformabilidade em sangue heterogêneo é complicada pelo fato de que células rígidas, tais como glóbulos vermelhos falciformes, não alinhar corretamente com a direção do fluxo, tais como células deformáveis em resposta ao aumento da tensão de cisalhamento. Em vez de produzir uma imagem de difração característicos de elíptico, rígidas células produzem um padrão esférico que resulta em um padrão de difração em forma de diamante quando sobrepostos sobre a elipse produzida pelas células deformáveis. 4 , 5 , 6 o padrão esférico foi mostrado para corresponder a células falciformes irreversíveis, realizando ektacytometry em frações isoladas das células após centrifugação de densidade. 6 o cálculo do índice de alongamento inclui medidas de ambos os longa e curta eixo da elipse; uma forma de diamante, portanto, produz uma diminuição aparente no alongamento, aumentando a largura do eixo curto. 7 anteriormente mostrou que o grau de distorção do padrão de difração está correlacionado com a porcentagem de hemoglobina falciforme (HbS) e a percentagem de células falciformes no sangue de pacientes com anemia falciforme. 5 o grau de distorção do padrão de difração pode ser obtido por análises matemáticas complexas. 8 pode também ser obtido ajustando a abertura da abertura da câmera sobre o ektacytometer ou nível de cinza do encaixe software para alterar a altura do padrão de difração. 5 no entanto, detalhes sobre como ajustar o nível de cinza não estão bem definidos e a abertura da câmera não é facilmente acessível sobre a geração mais recente de ektacytometer o comercialmente disponível. Para contornar esses problemas, o ganho facilmente acessível câmera pode ser usado para ajustar alturas padrão de difração. 9 usar esse método para estimar a heterogeneidade celular, o grau de distorção do padrão de difração pode ser correlacionado com a porcentagem de hemoglobina fetal no sangue de pacientes com anemia falciforme. 10 vários parâmetros ektacytometry gradiente osmótico da mesma forma são correlacionados com a porcentagem de fetal ou foice de hemoglobina no sangue de pacientes com anemia falciforme. Correlações de distorção da padrão de difração provavelmente refletem a contribuição da composição da hemoglobina para a percentagem de células rígidas, não deformável. De interesse adicional, o perfil de toda ektacytometry gradiente osmótico sofre alterações de bifásico que correspondem à percentagem de células densas em circulação durante a crise falciforme. 11
Ektacytometry também é útil no estudo de várias outras doenças. Ektacytometry gradiente osmótico é diagnóstico para os distúrbios de membrana eritrócitos herdadas, como esferocitose hereditária, elliptocytosis hereditária e pyropoikilocytosis hereditária. 3 , 12 , 13 , 14 deformabilidade diminuição ocorre na deficiência de ferro. 15 caracterização da lesão de"armazenamento" de sangue empregou ektacytometry e futuros estudos investigando tanto a natureza da lesão e intervenções para prevenir a sua formação durante o armazenamento de sangue bancado são susceptíveis de beneficiar o técnicas aqui apresentadas. 16 diminuição eritrócitos deformabilidade também tem sido correlacionada com doença microvascular em diabetes. 17 estudos recentes vinculando hiperglicemia, concentrações de ascorbato de eritrócitos e fragilidade osmótica sugerem que estes fatores podem ser importantes no desenvolvimento da doença microvascular. 18 Ektacytometry estudos estão em andamento para investigar esta hipótese (Parrow e Levine, dados não publicados). Infecção da malária do sangue palco é outro interessante Avenida das investigações de deformabilidade eritrócitos. Deformabilidade celular de Plasmodium falciparum infectados células vermelhas do sangue diminui drasticamente durante as 48 horas de maturação intracelular do parasita de palco anel palco schizont. Evidências indicam que esta diminuição da deformabilidade é revertida após a maturação do parasita. A reversão coincide com o lançamento de eritrócitos infectados na circulação. Diminuição da deformabilidade é pensada para ser mediado por proteínas de Plasmodium que promovem o sequestro da célula vermelha. 19 estes estudos representam uma pequena amostra das condições clinicamente importantes, onde a medição deformabilidade eritrocitária e parâmetros de gradientes osmóticos são relevantes. Existem várias áreas adicionais de estudo.
Técnicas alternativas para medir deformabilidade eritrócitos incluem Pinça óptica (também conhecida como armadilhas do laser), que utilizam as propriedades físicas dos fótons para esticar as células vermelhas do única em uma ou mais direções. 20 esta técnica tem a vantagem de medir a deformabilidade dos eritrócitos único, mas alguma incerteza na calibração de força produziu considerável variabilidade através de de estudos 21 e análise de dados pode ser trabalhosa a menos automatizado. 22 aspiração micropipeta, que utiliza pressão negativa para aspirar um eritrócito para uma micropipeta, também tem sido usada para medir a deformabilidade das células vermelhas. 7 , 23 medições múltiplas, tais como a pressão necessária para aspirar os eritrócitos, são possíveis com cada medida definem características diferentes da célula vermelha. 23 , microscopia de força atômica é uma técnica de alta resolução que mede a rigidez da membrana através da quantificação de deflexão de feixe de laser como um indicador da deflexão do cantilever, ao longo da superfície de uma célula vermelha. 24 estas técnicas fornecem informações sobre eritrócitos individuais, não são facilmente adaptados para medir mudanças nas populações de células vermelhas do sangue e, em geral, exigem conhecimentos técnicos consideráveis.
O desejo de experimentar tanto individual e populações de células simultaneamente tem levado a avanços na automação e o desenvolvimento de microfluídica e métodos baseados em matriz. Como ektacytometry, rheoscopy medidas de deformabilidade em função da tensão de cisalhamento, mas imagens são adquiridas diretamente através do microscópio. 25 para maiores Coloque-através de análises, imagem latente da pilha automatizado foi empregado para produzir distribuições de deformabilidade usando o rheoscope. 26 heterogeneidade celular pode ser quantificada por esse método se estiverem disponíveis dados de um assunto de controle saudável. 27 técnicas de microfluídica também permitem altas Coloque-através de análises de células únicas; vários projetos utilizando adaptações de filtração, analisadores de trânsito de célula28 ,29 , que mede o tempo necessário para um fluxo de eritrócitos através um micropore e alternativas que medem a pressão necessária para o trânsito de eritrócitos bastante que tempo 30 foram desenvolvidos. Outra plataforma para alta Coloque-através de análise de células individuais é o chip de matriz única célula microchamber, que tem a vantagem adicional de permitir para jusante caracterização baseada em fluorescência das células. 31 embora cada uma dessas técnicas é potencialmente útil e pode ser superior para aplicações específicas, as vantagens comparativas de ektacytometry inclui sensibilidade, facilidade de uso e precisão. 32 a última geração de ektacytometers comercialmente disponível também possuem versatilidade considerável no número de ensaios que podem ser executadas.
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Protocol
Todas as disciplinas neste estudo deram consentimento escrito em conformidade com a declaração de Helsínquia e os protocolos nacionais institutos de saúde institucional Review Board aprovado.
1. ligar o ektacytometer
- Conecte o tubo de solução de limpeza para as soluções de polivinilpirrolidona (PVP) de baixa e alta osmolar. Tenha cuidado para conectar-se a 0 osmolar à baixa osmolar solução a 500 osmolar tubo e para a solução de alta osmolar.
Nota: A solução PVP osmolar baixa deve ter uma osmolalidade entre 35 e 55 milliosmoles por quilograma (mOsm/kg), um pH de 7.25-7,45 a 25 ° C e uma viscosidade entre 27,0 e 33,0 centipoise (cP) a 37,0 ± 0,5 ° C. A solução PVP osmolar elevado deve ter uma osmolalidade entre 764 e 804 mOsm/kg, um pH de 7.25-7,45 a 25 ° C e uma medida de viscosidade de cP 27,0 33,0 37,0 ° 0,5 ° C. - Certifique-se de que o bob é reduzido completamente no copo. Inicie o programa e acione a máquina (Hardware verificar | IO do instrumento). Permitir que o instrumento completar o ciclo de escorva. Uma vez que o ciclo está completo, levante o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo tecido de limpeza.
Nota: Água residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência.
2. medir a deformabilidade em função do aumento da tensão de cisalhamento
- Obter sangue (menor que 1 mL é adequada para realizar estas técnicas com Replica) no tubo de ensaio contendo anticoagulante apropriado.
Nota: EDTA é preferido por heparina, porque tem menos influência sobre parâmetros de hemorheological. 33 sangue manter à temperatura ambiente se as medições são realizadas dentro de 6 horas de sangue de desenhar. - Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar o frasco várias vezes por inversão. Adicione 25 µ l de sangue total para 5 mL de solução PVP iso-osmolar pipetando, tampar o frasco e misture suavemente várias vezes por inversão. A solução PVP iso-osmolar deveria ter uma osmolalidade entre 284 e 304 mOsm/kg, um pH de 7,3-7,4 a 25 ° C e uma viscosidade de cP 27,0 33,0 37,0 ± 0,5 ° C.
- Sobre o software escolha deformabilidade do menu principal. Criar uma nova análise e adicionar detalhes experimentais (deformabilidade | Adicionar detalhes desejados | Okey).
- Levante a tampa para ektacytometer, verifique se o bob é totalmente abaixado no copo e o copo está se transformando.
- Adicione 1 mL de solução PVP sangue para o espaço entre o copo e bob pipetando.
- Levante o bob ligeiramente para derrubar as amostras. Espere até todas as bolhas têm saído a solução e, em seguida, feche a tampa para o ektacytometer. Se necessário, pressione o botão de aspiração para ajudar a remover as bolhas.
- Ajuste o ganho de 200 movendo a seta ao longo da barra de rolagem no software (ver nota). Quando a temperatura é estável a 37 ° C e a imagem de difração é estável, pressione Iniciar (Iniciar).
Nota: Para muitos estudos, uma imagem boa de difração pode ser obtida (hemoglobina concentração > 12,0 g / dL, volume corpuscular médio de 80-96 fL e concentração de hemoglobina corpuscular média de 33-36 g/dL) de sangue saudável, com o ganho de câmera definido para 200. Para estudos de sangue da anemia falciforme, ajustar o ganho da câmera para gerar uma imagem de difração de 4,5 cm tem sido sugerido como a configuração padrão para permitir a comparação de resultados através de estudos e laboratórios. 9 - Observe os padrões de difração como progride de aquisição de dados para garantir que eles permaneçam circular, elíptica ou em forma de diamante. Quando a aquisição de dados é concluída, salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão). EI Max e SS ½ valores serão relatados automaticamente, juntamente com os índices de alongamento correspondente ao usuário especificado ou padrão tensões de cisalhamento. Dados serão também salvos automaticamente pelo software.
- No final, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (Clean). Depois que a amostra é aspirada, enxágue o espaço entre o copo e bob por esguichar água desionizada para o espaço, enquanto o instrumento permanece no ciclo de limpeza. Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
- Clique no botão do Menu principal do software para retornar à página principal (Main Menu).
3. medição heterogeneidade celular
- Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar o frasco várias vezes por inversão. Pipetar 25 µ l de sangue total para um novo frasco de 5 mL de iso-osmolar solução PVP, tampar o frasco e misture suavemente, invertendo-se até obter uma mistura homogênea.
- Escolha a deformabilidade do menu principal. Criar uma nova análise e adicionar detalhes experimentais (deformabilidade | Adicionar detalhes desejados | Okey).
- Levante a tampa para ektacytometer, verifique se o bob é totalmente abaixado no copo e o copo está se transformando.
- Pipetar 1 mL da solução de sangue de PVP para o espaço entre o copo e bob.
- Espere até todas as bolhas têm saído a solução e, em seguida, feche a tampa para o ektacytometer.
- Certifique-se de que uma imagem de difração estável está presente na tela. Ajuste o ganho da câmera movendo a seta junto a barra de rolagem no software até produz um 3,8 cm de altura de difração. Use uma régua para verificar a altura da imagem na tela do computador.
- Quando a temperatura é estável a 37 ° C e a imagem de difração é estável, pressione Iniciar (Iniciar).
- Observe os padrões de difração como progride de aquisição de dados para garantir que eles permaneçam circular, elíptica ou em forma de diamante. Quando a aquisição de dados é concluída, salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão).
- No final, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (limpar). Depois que a amostra é aspirada, enxágue o espaço entre o copo e bob por esguichar água desionizada de uma garrafa de esguicho nele, enquanto o instrumento permanece no ciclo de limpeza. Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
- Repita os passos 2.1-2.5 e ajustar o ganho da câmera para obter uma altura de padrão de difração de 4,5 cm (passo 2.2).
- Repita os passos 2.1-2.5 e ajustar o ganho da câmera para obter uma altura de padrão de difração de 5,4 cm (passo 2.2).
- No final, clique no botão de menu principal para retornar à página principal do software (Menu principal).
- Para determinar o grau de distorção de padrão de difração baseado no EI Max como uma porcentagem, use a seguinte equação (a mesma equação pode ser realizada com os dados a partir da altura de padrão de difração de 4,5 cm se desejado):
- Da mesma forma, para determinar o grau de difração distorção padrão com base em SS1/2 uso a mesma equação com o valor relatado do SS1/2:
4. osmótica ektacytometry gradiente
- Obter amostra conforme descrito no ponto 1.1. Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar várias vezes por inversão. Adicionar 250 µ l de sangue total para 5 mL frasco PVP de iso-osmolar pipetando, tampar o frasco e misture suavemente, invertendo-se até obter uma mistura homogênea.
- Escolha osmoscan no menu principal (Osmoscan). Coloque o frasco que contém o sangue, solução PVP por baixo da agulha do lado esquerdo da máquina. Abaixe a agulha até que toque o fundo do frasco. Certifique-se de tubulação está correctamente ligada às soluções para a produção de gradiente osmolar de baixa e alta. Feche a tampa para o ektacytometer e abra a porta na metade inferior, para que você pode assistir o sangue entrar no tubo.
- Pressione nova análise e tipo em detalhes experimentais (Osmoscan | Nova análise | Inserir os dados desejados | Okey). Ajuste o ganho da câmera para 200 movendo a seta controlá-la no software e deixe a máquina funcionar até sangue é visto entrando a Taça do tubo sob o instrumento.
- Uma vez que o sangue entrou a taça e uma imagem do padrão de difração estável é na tela do computador, iniciar aquisição de dados pressionando o começo agora botão na caixa de diálogo (começar agora).
- Permitir que o ektacytometer adquirir dados até aproximadamente 500 mOsm/kg e, em seguida, pare o instrumento. Salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão). Dados também salvará automaticamente.
- Remova o frasco de PVP-sangue velho. Substituí-lo com um frasco limpo contendo água desionizada. Coloque-o debaixo da agulha, traga a agulha para baixo assim que toca o fundo do frasco e pressione o botão de enxágue na caixa de diálogo para enxaguar o sistema gradiente (enxaguar).
- Uma vez concluída a lavagem, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (Clean). Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
Nota: O relatório de osmoscan fornece índices de alongamento através do gradiente osmótico. EI Min O (EI Min), EI Max, O (El Max), EI hiper e O hiper são gerados automaticamente e incluídas no relatório. É o intervalo de ektacytometry gradiente osmótico parâmetros obtidos de sangue de 9 voluntários saudáveis: EI Min 0.12-0.196 unidades arbitrárias (u.a.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 u.a.; Ó (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI 0.278 hiper-0.286; O hiper 454-505 mOsm/kg.
5. desligar o ektacytometer
- Limpe o aparelho corretamente antes de ele é parar.
- Para fazer isso, conecte o tubo das soluções osmolar de baixa e alta para o adaptador em y levando a solução de limpeza. Coloque um frasco contendo solução de limpeza abaixo da agulha do lado esquerdo da máquina e abaixe a agulha até que toque o fundo do frasco. Certifique-se de que o bob é reduzido completamente no copo.
- Fechar o software e a imprensa começam na extremidade dia limpa caixa de diálogo no monitor do computador (perto | Iniciar). Permitir que o instrumento percorrer limpeza completamente.
- Desconecte o tubo no frasco de resíduos e removê-lo do instrumento para descarte de resíduos. O bob seque completamente. Desliga a máquina.
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Representative Results
Os resultados do ektacytometry descritos neste manuscrito podem ser usados para medir a deformabilidade eritrócitos em qualquer condição. Um diagrama esquemático do conjunto geral acima de um ektacytometer é mostrado na Figura 1. Populações homogêneas de eritrócitos irão produzir um padrão de difração elíptica em resposta ao aumento da tensão de cisalhamento que pode ser usado para calcular o índice de alongamento, como mostrado na Figura 2. Distorção do padrão de difração ocorre em amostras de sangue heterogênea porque hemácias rígidas não alinhar corretamente com células deformáveis e produzir um padrão esférico que sobrepõe a elipse, resultando em um diamante em forma de padrão de difração. Esse padrão distorcido é cada vez mais detectável, como o ganho de câmera é ajustado para gerar maiores tamanhos padrão de difração como mostrado na Figura 3. Populações homogêneas de sangue, como os encontrados em voluntários saudáveis, não produzem curvas de deformabilidade diferentes quando medem-se tamanhos diferentes de difração (Figura 4A). Em contraste, as populações heterogêneas de sangue, como sangue de pacientes com anemia falciforme, mostram diminuições significativas nas medidas de deformabilidade em função do tamanho padrão de difração (Figura 4). No sangue de foice, quando o grau de distorção do padrão de difração é medido em função do EI Max, está correlacionada com HbS (Figura 5A) e a variante de hemoglobina adulta, HbA2 (Figura 5). Transfusão corrige a distorção, conforme indicado pela sua relação inversa com a porcentagem de hemoglobina adulta normal (HbA) no sangue (Figura 5). Se o grau de distorção do padrão de difração é medido em função da tensão de cisalhamento ½ (Figura 5B) ou como uma função de El Max (Figura 5E), ele está correlacionado com a hemoglobina fetal. No entanto, a relação é mais forte no primeiro do que o último. Parâmetros de chave ektacytometry gradiente osmótico, tais como O (EI Max), EI Min e Min O fornecem informações adicionais sobre a hidratação celular, rácios de superfície e o volume e fragilidade osmótica, respectivamente. Curvas de gradientes osmóticos obtidas de sangue foice são caracteristicamente esquerda deslocada com decréscimos marcados na deformabilidade tornam-se cada vez mais pronunciados na região hipertônica, conforme mostrado na Figura 6.
Figura 1 . Esquemático de set-up ektacytometer. Uma taça exterior gira em torno de um bob estacionário que gera tensão de cisalhamento no sangue resuspended em uma solução PVP de viscosidade definida que é colocada entre eles. Um padrão de difração é gerado por um laser que passa através da solução e o padrão de difração é exibido em uma tela de projeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Visão geral da relação entre o índice de difração padrão e alongamento. Padrão de difração obtido de sangue saudável em resposta ao estresse de cisalhamento mostra o padrão esperado elíptico. Índice de alongamento (EI) é calculado usando a equação indicada 7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Heterogeneidade celular produz distorções do padrão de difração. Padrões de difração obtidos de sangue de um paciente de anemia falciforme, quando o ganho de câmera é ajustado para produzir A) um padrão de difração de 3,8 cm, B) um padrão de difração de 4,5 cm e C) um padrão de difração de 5,4 cm. Curvas de deformabilidade, mostrando uma diminuição progressiva da deformabilidade aparente e um correspondente aumento na tensão de cisalhamento aparente ½, indicada pelas linhas, do mesmo sangue quando o ganho de câmera é ajustado para produzir D) a difração de 3,8 cm padrão, E) o padrão de difração de 4,5 cm e F) o padrão de difração de 5,4 cm. [Reimpresso com permissão da Parrow et al. 10]. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Distorções do padrão de difração produzem uma aparente diminuição da deformabilidade em toda uma gama de tensões de cisalhamento no sangue de pacientes com anemia falciforme. Comparação das curvas de deformabilidade gerados a partir de A) sangue de voluntários saudáveis e B) sangue de pacientes com anemia falciforme, ajustando o ganho da câmera para gerar um tamanho de padrão de difração de 3,8 cm, 4,5 cm e 5,4 cm. Curvas de deformabilidade geradas com sangue de pacientes com anemia falciforme, mas não de voluntários saudáveis, mostram progressiva e significativa diminuição aparente deformabilidade em resposta à tensão de cisalhamento tão pouco quanto 5 Pa como uma função de difração tamanho padrão. [Reimpresso com permissão da Renoux et al. 9]. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . o grau de distorção do padrão de difração está correlacionado com a composição de hemoglobina no sangue de pacientes com anemia falciforme. Análises de regressão linear mostram a relação entre A) a distorção EI Max-baseado na deformabilidade e o percentual de HbS, B) a distorção de base 1/2 SS na deformabilidade e a porcentagem de hemoglobina fetal (HbF), C) o EI Max-baseado distorção na deformabilidade e o percentual de HbA2, D) a distorção EI Max-baseado na deformabilidade e o percentual de HbA e E) para fins de comparação direta, a distorção EI Max-baseado em deformabilidade e o percentual de HbF no sangue de pacientes com anemia falciforme. Coeficiente de correlação de momento de produto de Pearson, re correspondente p-valor são indicados. [Reimpresso com permissão da Parrow et al.10]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Sangue de um paciente com anemia falciforme mostra uma característica shift esquerda concomitante com a diminuição da deformabilidade em comparação com o sangue de um voluntário saudável quando analisados por ektacytometry gradiente osmótico. Sangue do voluntário saudável (-) mostra uma curva representativa ektacytometry gradiente osmótico com a localização dos parâmetros importantes indicado. Valores de gradientes osmóticos do são voluntário saudável 0,143 u.a. para EI Min, 146.3 mOsm/kg para O Min, 0,576 u.a. para EI Max e 473 mOsm/kg para O hiper. Uma curva representativa ektacytometry gradiente osmótico gerada com o sangue de um paciente com anemia falciforme é sobreposta (-). Valores de gradientes osmóticos do sangue anemia falciforme são 0,237 u.a. para EI Min, 110.3 mOsm/kg para O Min, 0,429 u.a. para EI Max e 406 mOsm/kg para O hiper. [Adaptado com permissão de Parrow et al. 10]. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As ektacytometry técnicas descritas são simples e bem automatizado, garantindo resultados válidos e reproduzíveis. No entanto, existem algumas etapas críticas. Controle de temperatura adequada do sangue é importante. Armazenamento em temperatura ambiente por mais de oito horas pode afetar SS ½ valores. 34 garantir que a temperatura da máquina é estável a 37 ° C também é importante, como a viscosidade do meio de suspensão é dependente de temperatura. Sangue deve ser totalmente oxigenado para evitar a diminuição da deformabilidade decorrentes de amostras não-oxigenado ou parcialmente oxigenadas, a não ser que estes são parâmetros experimentais de interesse. 35 do ponto de vista da instrumentação, limpeza adequada do instrumento é fundamental para garantir que não há nenhum PVP restantes na tubulação ou ponto de entrada do bob, como ele vai endurecer após secagem e bloco de fluxo de fluido através do instrumento. Atenção para esses detalhes irá promover resultados precisos e manter o aparelho em boa condição de funcionamento.
Quantificação da heterogeneidade celular pode exigir a modificação. No padrão de difração de 3,8 cm, algumas amostras podem apresentar uma queda acentuada no índice de alongamento para as tensões de cisalhamento mais altos. Ocasionalmente, isto pode ser superado, repetindo a medição com uma nova amostra. Caso contrário, o grau de distorção do padrão de difração pode ser medido usando um valor de índice de alongamento de uma baixa tensão de cisalhamento, ou pode ser usado o padrão de difração de 4,5 cm. 9 também pode ser difícil obter um padrão de difração de 3,8 cm de sangue saudável porque o longo eixo da elipse é muito tempo, mesmo com o menor ganho de câmera. Novamente, os dados de padrão de difração de 4,5 cm podem ser usados para contornar este problema. O valor escolhido deve, claro, ser mantido constante em toda a experiência como as comparações são apenas possíveis a partir de dados calculados usando o mesmo ponto e difração padrão tamanho de dados. Como as medidas de heterogeneidade celular dependem do instrumento instituído, validação interna pode ser obtida medindo-se distorções de padrão de difração em fracções de células isoladas, ou precisamente definidas as misturas de frações, densidade seguinte centrifugação conforme descrita anteriormente. 6
É importante observar que muitos ektacytometry parâmetros são sensíveis às características do pacientes. Status de Globina alfa,36 MCV 37 e transfusão são exemplos na anemia falciforme. 10 portanto, estudos clínicos precisam ser cuidadosamente projetado e essas relações precisam ser contabilizados ao interpretar dados ektacytometry.
Outra ressalva importante é que não há uma relação direta geral entre as medidas de redução de ektacytometry e redução na sobrevivência de eritrócitos. Existem condições assintomáticas com deformabilidade severamente diminuída, como o Sudeste Asiático, ovalocytose. 38 no entanto, medições de deformabilidade por qualquer técnica são complexas e dependentes a área da superfície à relação do volume (esfericidade), viscosidade citoplasmática (concentração de hemoglobina celular) e rigidez da membrana celular. Reologia de eritrócitos, da mesma forma é complexa, e não há uma técnica disponível que pode reproduzir a complexidade fisiológica do fluxo de sangue em várias camas vasculares. Ektacytometry, no entanto, fornece importantes insights sobre a deformabilidade eritrócitos alterados e reologia.
A principal limitação do ektacytometry é a incapacidade de medir deformabilidade em células individuais. Assim, na anemia falciforme, não há nenhuma maneira de determinar a contribuição da hemoglobina fetal, que tem uma distribuição heterocelulares, sobre a deformabilidade de um determinado número de eritrócitos. 10 da mesma forma, em uma poça de sangue de Plasmodium infectado de um paciente não há nenhuma maneira de determinar a influência da maturidade de parasita dentro de uma célula específica de sangue vermelho. 19 estudos de futuro comparando ektacytometery resultados com aqueles obtidos com métodos apropriados para células individuais seria valiosas. Independentemente desta limitação, ektacytometry fornece uma medida conveniente e sensível das propriedades reológicas das hemácias e da heterogeneidade de populações de sangue. Estes dados são importantes no estudo de diversos transtornos e são frequentemente de relevância clínica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural dos institutos nacionais de Diabetes, digestivo e doenças renais e nacional do coração, pulmão e sangue Instituto do institutos nacionais da saúde. As opiniões aqui expressadas são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos institutos nacionais de saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
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