Summary
I denne artikel beskrives en økonomisk, optimeret og enkel protokol som bruger Evans blå farvestof metode til vurdering af plasma ekstravasation i organer af FVBN mus, der kan tilpasses til brug i andre stammer, arter, og andre organer eller væv.
Abstract
Vaskulær lækage eller plasma ekstravasation, har en række årsager, og kan være en alvorlig konsekvens eller symptom på en inflammatorisk reaktion. Denne undersøgelse kan i sidste ende føre til ny viden om årsagerne til eller nye måder at hæmme eller behandle plasma ekstravasation. Det er vigtigt, at forskere har de rette værktøjer, herunder de bedste metoder til rådighed, for at studere plasma ekstravasation. I denne artikel vil beskrive vi en protokol, ved hjælp af metoden Evans blå farvestof til vurdering af plasma ekstravasation i organer af FVBN mus. Denne protokol er bevidst simpelt, at så stor en grad som muligt, indeholder men data af høj kvalitet. Evans blå farve er blevet valgt, primært fordi det er let for den gennemsnitlige laboratorium til at bruge. Vi har brugt denne protokol til at levere dokumentation og support til den hypotese, at enzymet neprilysin kan beskytte Vaskulaturen mod plasma ekstravasation. Men denne protokol kan eksperimentelt anvendt og nemt tilpasses til brug i andre stammer af mus eller andre arter, i mange forskellige organer eller væv, for undersøgelser, der kan indebære andre faktorer, der er vigtige i forståelsen, forebyggelse eller behandling af plasma ekstravasation. Denne protokol er blevet grundigt optimeret og ændret fra eksisterende protokoller og kombinerer pålideligheden, lette, økonomi, og general anvendelighed af materialer og udstyr, hvilket gør denne protokol overlegen i forhold til den gennemsnitlige laboratorium til brug i kvantificere plasma ekstravasation fra organer.
Introduction
Vaskulær lækage i organer henviser til ekstravasation, eller udsivning af blodplasma gennem huller produceret i endothelium for post kapillær venules i organer. Denne plasma ekstravasation eller øget vaskulær permeabilitet, der kan opstå fra nogle type af en inflammatorisk reaktion, som kan have alvorlige konsekvenser. Det er således vigtigt, at dette fænomen, dets årsager, modulatorer og konsekvenser, er undersøgt og forstået, og ligeledes, at efterforskere har gode værktøjer og protokoller med at studere dem. I endothelial huller kan fremstilles via en række stimuli, men normalt er produceret ved hjælp af peptid neurotransmittere og/eller tachykinins på endothelia. En af de store naturligt forekommende mediatorer af denne proces, hvilket resulterer i øget plasma ekstravasation, er undecapeptide tachykinin neuropeptid, substans P1.
Metoder til at undersøge og måle vaskulær permeabilitet eller plasma ekstravasation, der bruger egenskaben albumin-bindingen af Evans blå farvestof, er blevet udviklet, og er normalt kendt for deres nøjagtighed, enkelhed, økonomi, sikkerhed og muligheden for at tillade den bestemmelse af plasma ekstravasation fra flere væv på én gang, ønskede så2,3,4,5,6,7,8,9 . Denne Evans blå protokol for at vurdere plasma ekstravasation i organer af FVBN mus bruger alle disse, men tilføjer nogle vigtige ændringer, der gør det generelt nyttigt og fleksibel til fremtidige undersøgelser, der involverer den gennemsnitlige laboratorium, der udfører eller vil gennemføre vigtige studier af faktorer i forbindelse med plasma ekstravasation eller vaskulær permeabilitet. I denne protokol, er substans P introduceret til mus på 1 nmol/kg, hvilket øger ekstravasation af plasma af 1.5-fold. Dette øger følsomheden af den protokol, hvilket resulterer i mere nemt observerbare og opnåelige resultater. Andre faktorer, der påvirker permeabilitet, som forskellige andre peptider, kemikalier eller nogle former for toksisk skade, kan bruges eller studeret af andre laboratorier, som ønsket. Halsfedt injektioner anvendes i denne protokol til at indføre Evans blå og substans P systemisk, som kræver terminal kirurgi. Men halsfedt injektioner5,7,10, selv efter overvejelse af de nødvendige terminal kirurgiske teknikker, er lettere at styre og føre til udarbejdelse af mere konsekvente resultater end andre venøse injektioner, herunder hale vene injektioner4,9. Selv om det kan være muligt for Evans blå leveres af retro-orbital venøse sinus injektioner, har ingen referencer i litteraturen fundet at bruge denne metode til levering af Evans blå. Men som for tail vene injektioner, den høje grad af ekspertise og praksis til reproducerbar mestrer denne teknik stærkt begrænser dets anvendelse til vellykket Evans blå injektioner. Derimod tilbyder alternative halsfedt injektion metode som beskrevet i vores protokol, en teknisk opnåelige løsning. En afgørende procedure for perfusion af musens vener, udføres lige efter ofringen af Evans blå-perfunderet mus, fjerner overskydende Evans blå farvestof, og er blevet standardiseret i denne protokol. Tidligere beskrevne metoder af perfusion er blevet nøje undersøgt og ændret for at opnå den nuværende procedure. Andre ændringer, der er beskrevet her er alle optimeret, ligetil og billig.
Der er nogle vigtige begrænsninger af metoden Evans blå farvestof. For eksempel, kan lav følsomhed undertiden forbundet med denne metode forhindre nogle ekstra grov patologiske og histologiske undersøgelse af væv fra Evans blå-indsprøjtning dyr. Men disse og andre begrænsninger har ført til udviklingen af alternative metoder og modeller, der dog stadig bruger Evans blå. Måling af Evans blå af fluorescens (ikke af visuel-range) spektroskopi kan øge følsomheden af metoden. Derudover blev Fluorescens mikroskopi af Evans blå-farvede væv udviklet for at give mulighed for observation af vaskulær lækage i flere forskellige steder11. Også, hele kroppen imaging og scanning af et levende dyr tidligere injiceres med Evans blå12 giver mulighed for undersøgelse af Evans blå koncentrationer på en sammenhængende måde, snarere end en specifik tid valgt punkt af eksperimentet. Men denne metode kræver tilgængeligheden af passende imaging faciliteter, og kan være meget dyrt. Ændringer der involverer Evans blå og udført i en in vitro- type model, er som i en celle kultur eller kylling chorioallantoic model13 (CAM) også blevet beskrevet. Disse modeller er overvåget af fluorescens og intravital14 mikroskopi, og giver mulighed for kvantificering af vaskulær permeabilitet ændringer over tid, men kan rejse spørgsmål om nøjagtig modellering af i vivo betingelser og kan også være dyrt.
Der har været andre metoder udviklet til bestemmelse og kvantificering af vaskulær lækage eller permeabilitet, der ikke involverer administrationen af Evans blå. Disse metoder kan ansætte en passende fluorescerende molekyle (såsom albumin eller fluorescein), eller en brændselsfremstilling mærket eller på anden måde mærkede molekyle, at levende dyr (eller til celle kultur eller chorioallantoic (CAM) modeller13, efterfulgt af ikke-invasive Imaging (PET scanning, Mr, intravital mikroskopi, hele krop scanning) eller af invasive billeddannelse (fluorescerende mikroskopi)3,12,15. Selv om disse teknikker kan tilbyde en række fordele i forhold til andre Evans blå metoder, har de også ulemper, der kan omfatte deres betydelig kompleksitet, nødvendige ekspertise, ressourcer og høje monetære omkostninger.
Neprilysin16 (peptidase enzymet NEP, også kendt som CD10, MME eller Enkephalinase) er blevet foreslået for at være involveret i at hæmme plasma ekstravasation, i det mindste i en del gennem enzymatisk metabolisme og inaktivering af endogent stof P. Således, i væv hvor celle overflade peptidase NEP forekommer, kan der være en dæmpning af effekten af substans P, formentlig af peptidase aktivitet af NEP.
I første omgang, testede vi for substans P-induceret plasma ekstravasation udnytter denne ændrede Evans blå protokol, med FVBN vildtype (WT) og NEP knockout (KO) mus. NEP inddragelse i substans P-augmented plasma ekstravasation var mistænkt fra disse indledende undersøgelser, og vi beskrive disse og yderligere eksperimenter involverer NEP rolle i plasma ekstravasation. Fokus i dette håndskrift er ikke NEP eller dens rolle i plasma ekstravasation, men snarere plasma ekstravasation eksperimenter selv. NEP resultaterne er repræsentative for slags resultater, som kan opnås gennem brug af denne ændrede protokol. Evans blå metode til at måle plasma ekstravasation er optimeret og ændret, som beskrevet i detaljer nedenfor for FVBN mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gældende internationale, nationale og/eller institutionelle retningslinjer for pleje og brug af dyr (mus) blev fulgt i eksperimenter beskrevet i dette håndskrift.
Denne metode bruger FVBN voksne mus, i alderen 16-20 uger, anset for at være optimal med henblik på denne undersøgelse. Dag 1 omfatter trin 1-5 og dag 2 omfatter trin 6-7 (figur 1).
1. udstyr forberedelse
- Sikre en tilstrækkelig forsyning af steril, engangs sprøjter og kanyler, hvis ketamin/xylazin bruges som narkose (som anbefalet). Hvis isofluran bruges som narkose, kontrollere ilt tank og væskeniveau for isofluran til at sørge for der er tilstrækkelige forsyninger til eksperiment før du starter. Også samle nosecone vejrtrækning kredsløb og vedhæfte dem til boksen induktion; knytte nye trækul dunke til vejrtrækning kredsløb. Forberede boksen induktion ved at dreje på ilt og fastslå, at anden etape læser ca 50 psi.
- Tænde varmepude til 37 ° C.
- Forberede rektal temperatursonden til kirurgi.
2. mus forberedelse
Dette trin omfatter anæstesi, hårfjerning og positionering (voksen FVBN mus-alder 16-20 uger).
- Vejer mus og optage vægtene.
- Bedøver musene.
- Administrere ketamin og xylazin IP (80-100 mg/kg og 7,5-16 mg/kg, henholdsvis). Men, det anbefales at begynde med lavere doser af ketamin og xylazin (omkring 30 mg/kg og 6 mg/kg, henholdsvis).
- Vedligeholde anæstesi med omkring 0,1 - 0,25 gange indledende doser af ketamin/xylazin under hele operationen. Ketamin og xylazin var den bedøvende stof(fer) valg i denne særlige undersøgelse, som mere reproducerbarhed og overlevelsesevne blev observeret. Den bedøvende stof(fer) valg i andre undersøgelser kan vise sig for at være forskellige. Hvis isofluran bruges, sætte musen i en induktion kammer og tænde isofluran til 5%, indtil musen mister fuld bevidsthed. Brug derefter en nasal nosecone indstillet på 1,5-2,5% isofluran i resten af proceduren.
- Overvåge mus hver 2-3 min af tå knivspids hen til indskrive nemlig passende dybde af anæstesi.
- Barbere ventrale hals-området af musen.
- Placere musen i en liggende stilling på forvarmet puden. Sikre poter og fødder af mus til kirurgisk overfladen med tape.
- Placer kunstige tåre salve på øjnene at forhindre udtørring under kirurgi.
3. kirurgisk detaljer
- Gøre en 1 cm incision i lige ventrale halsen over halsfedt.
- Anvende en eller to dråber af lidocain (1-2%) i området indsnit for smertebehandling og at fremme vasodilation. Vente 2 min. til lidocain træder i kraft.
- Udsætte og isolere de lige interne halsfedt via stump dissektion. Binde venen ud med 4-0 sutur og forsigtigt trække den rostralt årets fartøj med en hemostat. Skær et hul, ved hjælp af fine saks, ca 3 mm nedenfor eller caudale til slips, cirka halvvejs gennem diameteren af venen.
- Markere en PV-1 polyvinyl kateter 1,5 cm fra enden og indsætter halsfedt gennem hullet ved hjælp af et fartøj dilator tråd kateter i caudale slutningen af fartøjet, ca 1,5 cm.
- Binde kateter sikkert inden for den caudale del af fartøjet (under cut), med 4-0 silke. Binde den rostralt del af fartøjet til ydersiden af kateteret med de løse ender af sutur, som blev brugt til at binde off den rostralt halsfedt taktfast 3.3.
- Tack huden tilbage løst sammen omkring kateter med 4-0 silke for at forhindre tab af kropsvarme og udtørring af væv.
- Tilsluttes en sprøjte indeholdende heparinized saltvand (10 U/mL) kateteret og skylle kateteret.
4. injektioner
- Tilføre halsfedt kateter, efterfulgt af en lille mængde af heparinized saltvand til at skylle linjen Evans blå løsning (50 μL af 30 mg/mL opløsning i 0,9% normal, unheparinized saltvand eller ca 50 mg/kg).
- 2 min senere, injicere substans P (100 μL af 0,3 μM opløsning i 0,9% normal, unheparinized saltvand eller 1 nmol/kg), efterfulgt af en lille mængde af heparinized saltvand til at skylle linjen. Substans P øger ekstravasation af plasmaproteiner gennem i endothelial lag; i denne protokol inducerer det rutinemæssigt en forstærkning af plasma ekstravasation værdier af ca 1.5-fold, hvilket gør plasma ekstravasation værdier lettere at måle.
- Vente 18 min, efter substans P sprøjtes. I løbet af denne tid, vil Evans blå farvestof Reagensglasset og cirkulere.
- Opsige eksperiment 18 min efter injektion af substans P (20 min efter Evans blå injektion) ved at ofre mus med livmoderhalskræft dislokation. Det er sandsynligt, at musen kan være direkte cervically forvredet, uden først at give en overdosis af anæstesi, da musen er sikkert stadig godt bedøvede fra kirurgi. Men hvis det er nødvendigt, en overdosis af anæstetika ketamin/xylazin, isofluran eller pentobarbital kan gives, efterfulgt af cervikal dislokation.
5. isolering af organer
- Skar brysthulen af musen og tyngdekraft-perfuse (fra en højde på omkring 51 cm eller 20") hjertet og blodkarrene med 50 mL af 50 mM natriumcitrat, pH 3,5. pH 3,5 bevarer formentlig Evans blå binding til albumin.
- Punktafgifter 1-5 relevante organer (væv) med en dissekere skalpel (fx urinblæren, nyre, mave, lever, bugspytkirtlen, proksimale eller distale colon, ileum, duodenum, flanke hud, ører, hale, hjerte, og lunger) og fjerne eventuelle resterende indhold, hvis nuværende.
- Skyl organerne i stuetemperatur (RT) fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g NaCl og 0,20 g af KCl i 1 L, pH 7,4).
- DUP organer med væv, halveret hvert organ og vejer hver halvdel (våd vægt i g).
- Tørre en halvdel af væv i en tørring ovn ved 150 ° C, folie, for 48 h.
- Placer det andet væv halvdelen i en konsekvent mængde (op til 200 µL) formamid i et mikrofuge rør for 48 h (og op til 72 h) til at udtrække Evans blå.
6. maaling af væv OD
- Fjerne 50 µL af Evans blå-infunderes formamid (efter 48-72 h RT inkubation) fra mikrofuge tube og sted i en brønd på en 96-brønd polystyren plade. Vær omhyggelig med ikke at overføre væv stykker sammen med formamid.
- Sted 50 µL af ny, ren formamid i hver af to tomme pladens huller, 96-godt for de tomme felter.
- Måle og registrere OD620 i hvert hul i 96-brønd plade på en absorbans pladelæseren. 620 nm er absorbansen max Evans blå.
7. beregning af Plasma ekstravasation
- Vejer det tørt væv halvdelen, som har været i ovnen i 48 timer.
- Beregn våd vægt/tør vægt-forholdet for de specifikke orgel af interesse fra hver individuelle mus, begyndende med vådvægt af dette væv halvt (opnåede i trin 5.4), divideret med tørvægt af denne samme væv halvt (opnåede i trin 7.1).
- Beregne tørvægt (i g) af væv halvdelen i formamid ved at dividere vådvægt af væv halvdelen før det blev placeret i formamid (fremstillet i trin 5.4) ved våde: tør vægtforhold for den specifikke orgel af interesse (beregnet i trin 7.2).
- Beregne rettet OD620 værdier. Startende med OD620 værdi fra hver eksperimentelle godt af 96-brønd plade (der indeholder Evans blå-infunderes formamid fra hver væv, fremstillet i trin 6.3), Subtraher Tom godt OD620 værdien (OD620 middelværdien af de to brønde, der indeholder ren formamid, forberedt i trin 6.2, OD620 værdier opnået i trin 6.3) fra hver eksperimentelle værdi.
- Beregne plasma ekstravasation værdien ved at dividere den korrigerede OD620 (beregnet i trin 7.4) med tørvægt af væv halvdelen i formamid (beregnet i trin 7.3). Enheder af plasma ekstravasation bliver OD620/g tørvægt.
- Analysere data og express som den gennemsnit ± SEM. statistisk sammenligne grupper af t-test eller en-vejs variansanalyse og Scheffé's multiple-sammenligning test (lycofs01.lycoming.edu), som passende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1, er en skematisk af proceduren vist, som har vist sig for at resultere i de mest pålidelige og sammenhængende substans P-induceret plasma ekstravasation værdier fra organer af FVBN mus. Denne procedure tager normalt to dages arbejde, adskilt af mindst 48 timer af ventetid. Det er muligt at sprede det ud endnu mere, hvis dette gøres konsekvent for alle eksperimenter skal sammenlignes. For eksempel, efter organer er isoleret på dag 1, kan organer være flash frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C; efter omhyggeligt optøning organer (inden for et par dage til 1 uge), kan de vaskes i PBS og renset før resten af protokollen. Også, selv om tørring af væv bør ske som anført (ved 150 ° C for 48 h), udvinding af Evans blå af væv halvdelen i formamid kan udvides fra 48-72 h, så længe tiden i formamid er konsekvent for alle eksperimenter.
Vist i figur 2 og tabel 1 data viser substans P-induceret plasma ekstravasation fra urinveje blærer af FVBN vildtype (WT) og NEP knockout (KO) mus17, der var til rådighed primært på grund af dette laboratorium langvarige interesser i NEP og forordning og aktioner af valgte neuropeptider18,19. NEP KO mus udtryk ikke NEP i alle væv. Men NEP er udtrykt i urinblæren af WT mus, omend på lavt niveau20,21,22. Figur 2 og tabel 1 tyder på der er en forskel i substans P-induceret plasma ekstravasation fra urinveje blærer fra disse to grupper af mus. Dette indebærer en rolle for NEP i substans P-induceret plasma ekstravasation fra urinblæren, da udtrykket af NEP er potentielt den største forskel i urin blærer af WT og NEP KO mus.
Fordi de oprindelige data antydede en mulig rolle for NEP i substans P-induceret plasma ekstravasation i urinblæren (figur 2 og tabel 1), besluttede vi at mere fuldt ud undersøge inddragelsen af NEP i plasma ekstravasation i en anden orgel. Først, vi lavet en dobbelt Transgene mus til overexpress NEP næsten universelt23. Denne manipulerede mus tilladt en sammenligning af data fra tre typer af FVBN mus: WT mus16, som naturligvis udtrykke en begrænset mængde af NEP i mange væv; NEP KO mus17, som udtrykker ingen NEP i alle væv; og vores dobbelt transgene NEP overexpressor mus23, hvilke overexpress NEP i næsten alt væv ved administration af doxycyclin. Mus har gratis adgang til Doxycyclin-holdige chow for 1 uge forud for operationen (figur 1); Doxycyclin dosis er 1 mg/kg af chow, ufarvede. Opførelsen af disse dobbelt Transgene mus, der overexpress NEP har været detaljeret beskrivelse af NEP assays, westerns og NEP mRNA qPCR23.
Med disse 3 typer af mus viser denne protokol en rolle for NEP i plasma ekstravasation i væv, herunder duodenum23 (figur 3 og tabel 2). I disse eksperimenter, NEP overekspression i dobbelt transgene NEP overexpressor mus blev tændt af fodring, for 1 uge før dag 1, chow indeholdende doxycyclin (ufarvede; 1 mg doxycyclin/mg chow, figur 3en). Som kontrol, blev nogle WT og NEP KO mus også fodret ufarvede doxycyclin chow i løbet af ugen forud for dag 1 (fig. 3b og 3 c).
For at bekræfte NEP rolle i plasma ekstravasation til i duodenum af FVBN mus, udtryk for NEP i duodenum FVBN WT og NEP (dobbelt transgene) overexpressor mus fodret doxycyclin chow blev bekræftet af vestlige analyse med en polyklonale antistof mod menneskelige NEP, (som cross-reacts med musen NEP)23. Denne analyse bekræftes at WT duodenums express moderate mængder af NEP protein, men NEP overexpressor duodenums express 2-3 x beløb af NEP udtrykt ved WT duodenums. NEP KO mus, udtryk pr. definition ikke enhver NEP i duodenum.
Figur 1: generelle skema af protokollen til måling af substans P-induceret plasma ekstravasation. Skematisk af protokollen til måling af substans P-induceret plasma ekstravasation fra organer af FVBN mus (alder 16-20 uger). Denne protokol omfatter måling af væv plasma ekstravasation af Evans blå farvestof metode gennem indsprøjtning halsfedt og inkorporerer eksogent administreret substans P, for at få augmented og let målte plasma ekstravasation værdier i enheder af OD620/g tørvægt. Den beskrevne protokol har vist sig for at resultere i sammenhængende substans P-induceret plasma ekstravasation værdier fra forskellige organer i FVBN mus, og tager et minimum af to dages arbejde. Dag 1 og dag 2 er adskilt af mindst 48 timer af tid at vente væv til tørre og uddrag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Substans P-induceret plasma ekstravasation fra urinblæren af WT og NEP KO mus. Urinblæren plasma ekstravasation fra FVBN mus (uden forudgående doxycyclin) augmented af substans P administration og udtrykt som OD620 nm/g tørvægt. Urinary blærer blev isoleret fra FVBN vildtype (WT; hvid bjælke, n = 12) eller FVBN NEP knockout (KO; sorte bjælke, n = 7) mus og underkastes protokol for plasma ekstravasation som beskrevet ovenfor. Individuelle værdier, som er givet i tabel 1. Linjer over søjlerne repræsenterer standard fejlen af middelværdien (SEM). Værdierne for WT og NEP KO trended mod en signifikant forskel p = 0.051 af t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Substans P-induceret plasma ekstravasation fra duodenum af WT, NEP KO og NEP overexpressor mus. (A-C) Duodenal plasma ekstravasation augmented af substans P administration og udtrykt som OD620/g tørvægt. (A) Duodenums blev isoleret fra FVBN WT mus uden forudgående doxycyclin (-; hvid bar, n = 5), NEP KO mus uden forudgående doxycyclin (-; lys grå bar, n = 5), NEP ovexpressor dobbelt Transgene mus uden forudgående doxycyclin (DT-; mørk grå bar, n = 5) eller NEP ovexpressor dobbelt Transgene mus med forudgående doxycyclin (DT +; sorte bjælke, n = 4) og underkastes protokol for plasma ekstravasation som beskrevet ovenfor. Linjer over søjlerne repræsenterer SEM. Selv om NEP KO (-) værdier trended højere end WT (-) eller DT (-) værdier, var denne forskel ikke statistisk signifikant. Duodenal plasma ekstravasation værdier var faldet betydeligt kun med gruppen af doxycyclin fodret, NEP ovexpressor dobbelt Transgene mus (DT +), i forhold til alle andre (* p < 0,05, analyse af varians). (B, C) Duodenal plasma ekstravasation værdier fra WT og NEP KO mus blev ikke påvirket væsentligt af doxycyclin administration (p < 0,05). (B) WT mus uden doxycyclin (WT-; hvid bjælke, n = 5) og WT mus med doxycyclin (WT +; mellemstore grå bar, n = 7). (C) NEP KO mus uden doxycyclin (KO-; lysegrå linje, n = 5) og NEP KO med doxycyclin (KO +; mellemstore grå bar, n = 2). Individuelle værdier vist som en sammensat i A, B og C, er givet i tabel 2. Gengivet med mindre ændring fra Springer journal artikel23 med tilladelse fra Springer videnskab + Business Media. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Genotype | Køn | våd/tør vægtforhold af urinblæren | våd vægt af urinblæren halvt (g; i 85 μL formamid) | beregnet tørvægt af urinblæren halvt (g) | OD 620 nm - tom | OD 620 nm/g tørvægt (urinblæren) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28,000 |
| WT | F | 4,625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 4.798 +/-0.105 | 0.0088 + / 0.0014 | 0.0018 +/-0,0003 | 0.0336 +/-0.0056 | 19.228 + / 2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4,600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 4.503 +/-0.062 | 0.0144 +/-0.0032 | 0.0032 +/-0.0007 | 0.1020 + / 0.0233 | 33.061 +/-4.065 |
Tabel 1: substans P-induceret plasma ekstravasation fra urinblæren af individuelle WT og NEP KO mus. Plasma ekstravasation værdier fra FVBN mus (uden forudgående doxycyclin) var individuelt udtrykt som OD620 nm/g tør vægt, fra FVBN WT (n = 12) eller NEP KO (n = 7) mus og underkastes protokol for plasma ekstravasation som beskrevet ovenfor. Ingen kønsforskelle var tydelige i plasma ekstravasation værdier. Urinary blærer blev isoleret; individuelle værdier, som er givet for den beregnede våd/tør vægtforhold af urinblæren, vådvægt af urinblæren halvdelen i formamid, den beregnede tør vægt af urinblæren halvdelen i formamid (angivet i g), den korrigerede OD620 nm (prøve OD620 nm minus meanOD620 nmof tør tomme (ren formamid) og den beregnede plasma ekstravasation værdi i OD620 nm/g vægt (den korrigerede OD620 nm, divideret med den beregnede tørvægt). De resulterende plasma ekstravasation værdier blev brugt til at konstruere figur 2.
| Genotype og doxycyclin chow, uden (-) eller (+) | Køn | våd/tør vægtforhold af duodenum | våd vægt af duodenum halvt (g; i 85 μL formamid) | beregnet tørvægt af duodenum halvt (g) | OD 620 nm - tom | OD620 nm/g tørvægt (duodenum) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0,0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 5.157 +/-0.105 | 0.0284 +/-0.0033 | 0.0055 + / 0.0006 | 0.0700 + / 0.0122 | 12.805 +/-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 5.527 +/-0.075 | 0.0422 + / 0.0049 | 0.0076 +/-0.0009 | 0.0943 +/-0.0175 | 11.797 + /-1.142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 5.133 +/-0,282 | 0.0228 +/-0,0035 | 0.0044 + / 0.0005 | 0.0764 +/-0.0078 | 18.362 +/-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Betyde +/-vifte (af poster i kolonne ovenfor) | 5.079 + / 0.049 | 0.0326 +/-0.0133 | 0.0065 +/-0.0027 | 0.1290 + / 0.0690 | 18.819 + / 2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 5.038 + / 0.229 | 0.0288 +/-0.0028 | 0.0059 +/-0,0008 | 0.0780 + / 0.0198 | 13.003 + / 2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Betyde +/-SEM (af poster i kolonne ovenfor) | 5.121 +/-0.159 | 0.0621 +/-0.0034 | 0.0122 + / 0.0010 | 0.0413 +/-0.0147 | 3.729 +/-1.478 |
Tabel 2: substans P-induceret plasma ekstravasation fra duodenums af enkelte WT, NEP KO og NEP overexpressor mus. Plasma ekstravasation værdier fra FVBN mus (med eller uden forudgående doxycyclin) var individuelt udtrykt som OD620 nm/g tør vægt, fra FVBN WT mus (n = 5 uden, og n = 7 med doxycyclin), NEP KO mus (n = 5 uden, og n = 2 med doxycyclin), og NEP overexpressor dobbelt Transgene mus (n = 5 uden, og n = 4 med doxycyclin). Mus blev udsat for protokollen til plasma ekstravasation som beskrevet ovenfor. Ingen kønsforskelle var tydelige i plasma ekstravasation værdier. Duodenums var isolerede; individuelle værdier, som bruges til beregning af plasma ekstravasation var som beskrevet i tabel 1. De resulterende plasma ekstravasation værdier blev brugt til at konstruere figur 3A-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som omtalt ovenfor, kan studiet af plasma ekstravasation i sidste ende føre til ny viden om årsagerne til eller nye måder at hæmme eller behandle plasma ekstravasation. Vellykket brug af plasma ekstravasation protokollen (ovenfor), er ved hjælp af Evans blå farvestof, blevet påvist i det aktuelle manuskript. Selv om de viste data tilbage den hypotese, at NEP kan beskytte Vaskulaturen mod plasma ekstravasation, dette er en sekundær mål i øjeblikket, med det primære mål er at præsentere en optimeret protokol, som let kan anvendes i det gennemsnitlige laboratorium for den fremtidige undersøgelser af plasma ekstravasation. Protokollen rapporteret heri er fokuseret på tilpasningsevne til fremtidige undersøgelser med forskellige mål, dyr, organer og andre betingelser, og er især nyttig, fordi denne protokol er enkel at anvende, pålidelig, økonomisk, og tager hensyn til generelt tilgængeligheden af fælles materialer, reagenser og kompetent personale. Det bemærkes imidlertid, at denne protokol vil kræve en hel del af gentagelser pr. gruppe dyr (8-12 gentagelser foreslog) at opnå statistisk gyldige resultater.
Der har været mange undersøgelser og rapporter beskriver forsøg på at måle vaskulær permeabilitet og plasma ekstravasation. Langt de fleste af disse rapporter detaljer permutationer af metoder, der anvendes sammen med metoden Evans blå farvestof for at undersøge plasma ekstravasation og vaskulær permeabilitet2,3,6,11, 12,13. Der har været færre rapporter af vaskulær permeabilitet metoder, som ikke indbefatter Evans blå på alle3,13,15,24; disse andre metoder er generelt mindre tilgængelige for den gennemsnitlige laboratorium, der kræver komplicerede metoder, specialiseret udstyr og personale, og er generelt dyre.
Udviklingen af Evans blå protokollen ovenstående involveret afprøvning af mange forskellige permutationer og ændringer. Tidlige eksperimenter blev fokuseret på forsøg på at injicere Evans blå gennem mus hale vene. Men halen vene injektioner viste sig at være teknisk udfordrende og resulterede i inkonsistente resultater, nødvendiggør medtagelsen af halsfedt injektioner og terminal kirurgiske teknikker beskrevet ovenfor. Mange indledende forsøg blev også gjort forsøger at finde passende koncentrationer af Evans, blå og stof P. Det nøjagtige beløb af Evans blå fandtes ikke for at være afgørende, så længe det var omkring 200 mg/kg (i forhold til 50 mg/kg anvendes i øjeblikket), men mængden af substans P anvendes i disse eksperimenter var vigtigt. Efter megen eksperimenteren, 1 nmole/kg blev fundet for at være den ideelle koncentration af eksogent ekstra substans P, hvilket resulterer i en 1.5-fold forøgelse af (og dermed mere let målelige) plasma ekstravasation værdier. Desuden blev det konstateret, at tilstrækkelig tid må for Evans blå til Reagensglasset (> 10 min). Perfusion af blodkarrene til at fjerne overskydende Evans blå, efter ofringen af musen men forud for orgel isolation, fandtes for at være en væsentlig bestanddel af denne protokol, i modsætning til andre protokoller, ikke omfatter dette perfusion trin4. Perfusate (leveres af en blid alvor gradient) er 50 mL af pH 3,5 opløsning (som tilskynder bindingen af Evans blå og albumin); PARAFORMALDEHYD, udbredt i mange andre Evans blå protokoller6,10,25, er udeladt i denne protokol. En anden faktor, der er blevet løst i denne protokol er at farvestoffet anvendes i doxycyclin chow forstyrrer OD620 nm måling af Evans blå i væv fra forbrugsstederne sporet. Således var det nødvendigt at bruge ufarvede doxycyclin chow i de ovennævnte eksperimenter. En vigtig og nyttig konstatering er også, at næsten ethvert organ af musen tilfredsstillende er isoleret og undersøgt via denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Andy Poczobutt og Dr. Jori Leszczynski til deres værdifulde hjælp og redigeringer til dette håndskrift. Støttet af tilskud modtaget fra det nationale hjerte, lunge og Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 og RO3 HL095439) og Department of Veterans anliggender (Merit anmeldelse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
