Summary
Cette méthode permet la génération des tétraploïdes et triploïdes nématodes Caenorhabditis de toute souche diploïde. Les souches polyploïdes générées par cette méthode ont été utilisés pour étudier les interactions de chromosomes en prophase méiotique, et cette méthode est utile pour l’examen des questions de base importantes dans, développement, évolution, biologie cellulaire et cancer.
Abstract
Mécanismes qui impliquent tout le génome polyploïdie jouent un rôle important dans le développement et l’évolution ; en outre, une génération anormale de cellules tétraploïdes a été associée à la progression du cancer et le développement de la résistance aux médicaments. Jusqu'à présent, il n’a pas été possible de facilement manipuler la ploïdie d’un animal multicellulaire sans générer pour la plupart des descendants stériles. Présenté ici est un protocole simple et rapid pour générer des tétraploïdes Caenorhabditis elegans animaux de toute souche diploïde. Cette méthode permet à l’utilisateur de créer un biais dans la ségrégation des chromosomes durant la méiose, en fin de compte accroître ploïdie chez c. elegans. Cette stratégie repose sur la diminution transitoire de l’expression du gène rec-8 pour produire des gamètes diploïdes. Un mutant de rec-8 produit des gamètes diploïdes capables de produire tétraploïdes dès la fécondation. Ce régime tractable a été utilisé pour générer les tétraploïdes souches porteuses de mutations et réarrangements chromosomiques de mieux comprendre la dynamique chromosomique et les interactions lors de l’appariement et synapsis en méiose. Cette méthode est efficace pour générer des souches tétraploïdes stables sans marqueurs génétiques, peut être appliquée à n’importe quelle contrainte diploïde et peut être utilisée pour dériver les triploïdes c. elegans. Cette méthode simple est utile pour étudier les autres questions biologiques fondamentales se rapportant à l’instabilité du génome, dosage des gènes, mise à l’échelle biologique, signalisation extracellulaires, adaptation au stress, développement de la résistance aux médicaments, et mécanismes de spéciation.
Introduction
Du génome entier polyploïdie existe tout au long de la nature et est souvent une étape nécessaire dans l’adaptation, la spéciation, organogénèse, la cicatrisation des plaies et biologique mise à l’échelle ; Il est également connu pour favoriser des cancers et la résistance aux médicaments1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. génèrent des industries agricoles et de pêche plantes polyploïdes, poissons et crustacés par traitement chimique (p. ex., colchicine et orzalin) pour obtenir des taux de croissance plus rapides et plus volumineux récoltes et au bétail13, 14,,15. Production expérimentale et inefficace des tétraploïdes existe pour la souris et le poisson-zèbre modèle systèmes16,17. Cependant, la plupart ou tous les polyploïdes animaux multicellulaires générées sont embryonnaire létal ou stérile et donc pas idéal pour des études de laboratoire sur les effets de la polyploïdie chez un organisme multicellulaire. Par conséquent, toute compréhension de polyploïdisation du génome chez les organismes multicellulaires a été limitée aux espèces étroitement apparentées du évolutive récente polyploïdisation événements18,19,20 . Un chemin pour faire avancer les questions du rôle biologique ou conséquences de polyploïdisation est l’utilisation du système modèle c. elegans . Ce qui est important, c. elegans est un système génétique docile qui normalement existe sous la forme diploïde, contient seulement cinq autosomes (A) et un seul chromosome sexuel (X) par génome, est transparent ce qui permet en vivo l’observation des processus biologiques, et a un court cycle de vie de 3-4 jours (à partir de le œuf à l’adulte sexuellement mature). C. elegans a été démontré pour être capables de se reproduire comme un tétraploïde, qui est le type le plus commun de tout le génome polyploïdie dans la nature. Triploïdes animaux peut être générés en croisant des tétraploïdes avec diploïdes, mais leur ploïdie n’est pas stable, et les souches devenues diploïdes au bout de quelques générations.
Dans les dernières décennies qu’une poignée de viables et fertiles c. elegans , souches de tétraploïdes ont été isolées en laboratoire, en utilisant une stratégie qui est laborieux et génère uniquement des types limités de souches21,22, 23. cette stratégie génère des elegans de Caenorhabditis tétraploïdes par des traitements de choc thermique, qui affecte probablement la ségrégation des chromosomes dans les gamètes, suivie de la projection pour des animaux polyploïdes putatifs à l’aide de marqueurs génétiques. Ces tétraploïdes ont été extrêmement utiles dans l’enquête de comment ce nématode détermine s’il faut devenir mâle ou hermaphrodites. Des études ultérieures utilisé les souches disponibles pour enquêter sur la croissance, dose de gène et régulation de la synapsis au cours de la méiose chez ce nématode21,24,25,26. Malheureusement, ces études ont été limitées par la difficulté à produire de nouvelles souches tétraploïdes et l’arrière-plan des marqueurs génétiques ces souches contenues. Montré ici est un protocole simple et rapid pour générer des tétraploïdes stables, qui a été utilisé pour générer des souches pour étudier la régulation de la synapsis au cours de la méiose,27.
Comme dans la nature, la polyploïdisation peut survenir par la formation de diploïde au lieu de gamètes haploïdes. Nous avons conclu qu’un mutant du composant spécifiques à la méiose cohesin rec-8 génère diploïdes sperme et ovocytes a indiqué que faire tomber le gène rec-8 se traduirait par la production de descendants tétraploïdes (Figure 1),27, 28,29. Générant des souches tétraploïdes implique simplement renversant rec-8 par l’interférence ARN (ARNi) depuis deux générations dans l’ordre à cause du rec-8 des gamètes diploïdes mutants. Putatifs polyploïdes sont facilement reconnaissables par leur plus longue que la taille normale du corps. Polyploïdes sont confirmées comme tétraploïdes complet ou partiels en comptant le nombre de chromosomes par noyau une fois établies les lignes stables.
La stratégie décrite ici permet la génération de stables souches nématodes Caenorhabditis tétraploïdes d’un bagage génétique diploïde initiale ou caryotype sans l’utilisation de marqueurs génétiques. Étant donné que ce protocole est plus efficace, polyvalent et simple que le système utilisé précédemment, il développera les outils nécessaires pour interroger les rôles de polyploïdisation dans les processus fondamentaux de développement, stabilité du génome et évolution en multicellulaires organismes. La limitation seulement prévisible dans l’utilisation de ce protocole est dans les antécédents génétiques résistantes à Arni.
Protocol
1. mise en rec-8 Arni (jour 1-3 dans la Figure 2)
Ce protocole est modifié de Kaya et Ahringer30.
- Pour l’induction de l’expression de dsRNA rec-8 chez Escherichia coli, préparer le nématode à croissance moyenne (NGM) agar plaques31 additionné à une concentration finale de 1 mM isopropyl-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) et 100 µg/mL ampicilline. Conserver à l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’utilisation, jusqu'à 4 semaines.
- Bactéries HT115 strie transportant le clone de rec-8 (W02A2.6) du clone de rec-8 30 Ahringer laboratoire bibliothèque sur des plaques de bouillon Luria (LB) additionné de 100 ampicilline µg/mL et 50 µg/mL de tétracycline. Croître durant la nuit dans un shaker à 37 ° C.
- Le jour 1, inoculer des colonies individuelles des colonies unique fraîchement striées des bactéries e. coli de la HT115 transportant le clone de RNAi rec-8 en 4 mL LB contenant 100 µg/mL ampicilline et la 50 µg/mL tétracycline. Développer la culture de bactéries du jour au lendemain dans un shaker ou un tambour de rouleau à 37 ° C.
- Le lendemain matin (jour 2), induire la production de double brin (ds) RNA pour rec-8 W02A2.6 dans le HT115 de culture bactérienne en ajoutant une concentration finale de 1 mM IPTG et secouer pendant 40 min à 37 ° C.
- Après l’induction, plaques NGM/IPTG 100-200 µL de HT115 rec-8 bactéries de graines et stocker les plaques à température ambiante dans la sombre nuit (jour 3).
- Le lendemain matin (jour 4), ajouter la souche nématode désirée sur la plaque de bactéries induite HT115 rec-8 tel que décrit à l’étape 2.1 ci-après.
2. générer et isoler les tétraploïdes (jour 4-16 à la Figure 2)
- Le jour 4, placer 3-4 petits hermaphrodites (quatrième stade larvaire) L4 de la souche diploïde désirée sur les plaques NMG/IPTG ensemencées avec des bactéries de rec-8 HT115 qui avaient été incités la veille (1.5, l’étape ci-dessus). Cultiver des nématodes à 15 ° C dans l’obscurité.
- Répétez les étapes 1.3 et 1.4 à partir de 3 jours après l’étape 2.1, qui seront trois jours avant la première descendance (F1s) de cette étape devenue L4s. Le timing de cette étape dépend à quelle vitesse une souche nématode pousse à 15 ° C. Certaines souches mutantes diploïdes sont producteurs lentes, et cette cadence sera besoin fine tuning afin d’isoler les tétraploïdes.
- Sur 8 jours (après 4 jours de traitement alimentaire de RNAi rec-8 ), 20 (2 hermaphrodites/boîte de Pétri) des F1 (première génération filiale) L4 hermaphrodites cultivés dans les bactéries de rec-8 HT115 sur fraîchement induite HT115 rec-8 RNAi de transfert et permettre collez-les dans auto-fécondent.
- Par ailleurs, transfert 20 des F1 L4 hermaphrodites cultivé dans les bactéries de rec-8 HT115 sur fraîchement induit HT115 rec-8 Arni bactéries avec des mâles non traitées de la même souche (2 hermaphrodites avec 4 à 6 hommes/plaque).
- Le jour 13, départ préalable pour F2 (filial de deuxième génération) progéniture apparaissant longue (Lon) ou dans l’ensemble plus grand que le type sauvage ; puis transfert des animaux de Lon sur régulières OP50 ou HB101 souches de la bactérie e. coli . Continuer le dépistage F3 (troisième filiale) progéniture ; Cependant, descendance F3 dans la même assiette ne peut être considéré indépendants souches si elles sont établissent, car ils pourraient être frères et sœurs d’un même déjà mis en place F2 mère.
NOTE : Tétraploïdes putatifs sont facilement identifiables car ils sont nettement plus longs que les diploïdes. Hermaphrodites de type sauvage sont deux tiers plus courte que les tétraploïdes. Parce que c’est plus long, un corps tétraploïde fait un tour supplémentaire lorsqu’il se déplace vers l’avant en générant des ondes sinusoïdales corps-flexion de la tête à la queue (Figure 3 a). - Permettre à Lon vers auto-fécondent et propager en choisissant Lon descendants jusqu'à ce que seulement les descendants de Lon sont engendrés en l’absence de rec-8 traitement Arni. Cela peut prendre deux ou trois générations supplémentaires. Lon vers souvent sont stériles et ne donnent pas de descendance.
3. vérification des souches tétraploïdes (film 1 et la Figure 3 a, B)
Remarque : Les souches tétraploïdes peuvent être validés en comptant le nombre de chromosomes dans leurs ovocytes non fécondés. Microscopie de fluorescence peut être utilisée pour dépister le nombre de paires de chromosomes dans les ovocytes non fécondés diploïdes (avant les divisions méiotiques), si la souche a un marqueur fluorescent pour les chromosomes. En l’absence de marqueurs fluorescents chromosome, nématodes tétraploïdes peuvent subir par les nématodes de fixation et coloration avec un colorant ADN ; Voir ci-dessous pour un protocole pour la fixation de l’éthanol et animaux entiers 4′, 6-diamine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) coloration.
- La coloration DAPI animaux
NOTE : Tétraploïdes souches porteuses de 12 paires de chromosomes connecté peuvent être validés par DAPI souillant ces animaux et compter le nombre de corps DAPI dans ses ovocytes non fécondés.- Déposer 5 à 10 µL de tampon de M931 sur une lame de microscope, puis transférer nématodes 6-10 à la baisse.
- Sous un microscope à dissection, tirer la plupart du M9 dans la liste déroulante sans enlever les nématodes avec un tissu de nettoyage non pelucheux. Puis, ajouter immédiatement une baisse de 10 µL d’éthanol à 90 % sur les vers. Laissez les vers sécher complètement, mais pour pas plus de quelques secondes.
- Dès que l’éthanol s’évapore (cela peut être considéré comme ce qui se passe sous le microscope à dissection), ajouter une supplémentaire de 10 µL d’éthanol à 90 % sur les vers.
- Répétez l’étape 3.1.3 trois fois plus.
- Une fois la dernière goutte d’éthanol s’est évaporé, ajoutez 6 µL de DAPI ou Hoechst colorant à la concentration finale recommandée dans les supports de montage de choix (par exemple, une dilution de 1 : 1 000 d’une concentration de stock de DAPI 2 ng/µL à M9). Pour le stockage à long terme des diapositives, 0,5 % p-phénylènediamine dissous dans 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, dans 90 % de glycérol comme solution antifade, au lieu de M9 seulement, peut être utilisé.
- Couvrir les vers sur la diapositive avec une lamelle couvre-objet et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles. Score dans un microscope à fluorescence (étape 3.1.7) au moins 10 min après l’ajout de la lamelle. Diapositives sans antifade peuvent être conservés pendant quelques jours à 4 ° C avant de marquer, mais la qualité de la fluorescence commence à diminuer après quelques jours.
- À l’aide d’un microscope à fluorescence grossissement X 100, marquer le nombre de corps unique de DAPI (paires de chromosomes sans doute unique) dans l’ovocyte non fécondé plus mature, qui est juste à côté de la spermathèque et n’est pas encore entré la spermathèque ou l’utérus.
- Pour marquer des différents organes DAPI dans un noyau de l’ovocyte, utilisez mise au point fine du microscope pour déplacer du haut du noyau ovocytaire lentement vers le bas pendant le comptage. Puis, racontent le même noyau tout en déplaçant le focus dans la direction opposée (c'est-à-diredu bas vers le haut du noyau) pour confirmer le nombre compté des organes DAPI.
- Marquer l’ovocyte non fécondé plus mature dans chacune des deux gonades au moins dix hermaphrodites par souche Lon stable. Les ovocytes de type sauvage ont un corps DAPI 6 en moyenne, 5 paires d’autosomes et la paire de chromosomes sexuels. La présence de 12 corps DAPI dans l’ovocyte de souches stables de Lon indique que les animaux de cette souche sont partielles (4 séries de 3 chromosomes Autosomes) ou complètes (4 séries de 4 chromosomes Autosomes) tétraploïdes.
- Calculer le nombre moyen d’organes DAPI observée à partir de plusieurs ovocytes (au moins 10) par souche. Quelques paires de chromosomes se toucheront ou situé sur le haut de l’autre, donc le nombre de DAPI organes dans un ovocyte est souvent plus petit que le nombre de paires de chromosomes.
- (Facultatif) Valider les souches Lon stables où le nombre moyen d’organes DAPI est 12 pour vérifier si ils sont full (4 a, 4 X) ou partielle (4 a, 3 X) tétraploïdes par immunofluorescence souillant antiprotéines chromosome axe comme HTP-332. Cette coloration distinguera les paires de chromosomes en montrant un motif cruciforme à partir seul sans lien chromosomes présents dans les tétraploïdes partielle.
Representative Results
Insuffisance de la rec-8 Cohesin méiotique volet résultats de la fonction dans des gamètes diploïdes :
Des divisions méiotiques de le cohesin composant mutant rec-8 sperme et ovocytes révèlent des mécanismes possibles pour la génération des animaux tétraploïde (Figure 1)27,29,33. Mécaniquement, les défauts de la division méiotique de rec-8 mutant sperme et ovocytes sont différents ; Toutefois, des gamètes mâles et femelles diploïdes sont produites par le mutant rec-8 .
Type sauvage la méiose, les chromosomes homologues devenir temporairement reliés entre eux par une recombinaison crossover et entrez la première division méiotique comme une unité ou bivalent (Figure 1 a)34. Au cours de la première division, les chromosomes homologues (homologues) séparer loin un de l’autre, tandis que soeur chromatides dans chaque homologue restent ensemble jusqu’en deuxième division. Bien que le modèle de ségrégation des chromosomes est le même dans les gamètes mâles et femelles, ovocyte divisions sont asymétriques alors que les spermatocytes divisions sont symétriques et subissent une cytokinèse spécialisé. Dans chaque division, l’ovocyte rejette la moitié du produit de la division dans un petit globule polaire. Ainsi, chaque précurseur de l’ovocyte donne naissance à un seul ovocyte haploïde et deux corps polaires (Figure 1 b, C)35. À l’inverse, un précurseur unique spermatocyte donne naissance à quatre spermatides fonctionnelles en subissant deux divisions symétriques. La deuxième division se termine par quatre spermatides en herbe hors d’un corps résiduel. Cette cytocinèse est spécial car le modèle et le numéro de spermatides est déterminée par les centrosomes36.
Dans le précurseur pour les gamètes mutant rec-8 , recombinaison crossover entre les chromosomes homologues ne prend pas de place et homologues ne sont pas connectés comme un bivalent au début de la première division méiotique29,34. Les chromatides sœurs de chaque homologue séparer loin les uns des autres dans la première division au lieu de rester ensemble jusqu'à la deuxième division, comme ils le font dans les gamètes de type sauvage. Fait intéressant, le phénotype mutant rec-8 au cours de la deuxième division est différent dans les gamètes mâles et femelles que les ovocytes ne parviennent pas à subir la cytokinèse, tandis que les spermatocytes subissent une cytokinèse relativement normale (Figure 1 b– F) 27 , 28 , 29. diploïdes ovocytes proviennent du fait que dans la deuxième division, ils échouent tant ségrégation des chromosomes et la cytokinèse, d'où ils ne pas extruder le second globule polaire (Figure 1 b, C). Subir en herbe spermatides ou cytocinèse spermatocytes dans rec-8 germlines, mais souvent de séparer les deux ensembles de chromosomes à l’un des spermatides donne une spermatide diploïde et une spermatide manque la chromatine (Figure 1– F)27. Quantification de la proportion de spermatozoïdes rec-8 manque la chromatine est illustrée à la Figure 1F.
La formation de gamètes diploïdes mâles et femelles chez les mutants rec-8 a suggéré que ce phénotype mutant pourrait être potentiellement utilisé pour générer les tétraploïdes souches génome complet.
Génération des souches tétraploïde c. elegans :
La présence d’une mutation dans le gène de rec-8 chez toutes les souches tétraploïdes générés peut être évitée en abattant transitoirement rec-8 par ARNi29,37. Cela suppose que la réduction de la fonction rec-8 par ARNi générerait des gamètes diploïdes pouvant potentiellement donner lieu aux animaux tétraploïdes du génome entier, comme des mutants rec-8 font29,37. Essentielles au présent protocole est que les mutants rec-8 donnent lieu à des gamètes diploïdes et sire un nombre suffisamment important de jeunes, contrairement à d’autres mutants méiotiques, qui donnent naissance aux gamètes aneuploïdes et sont généralement stérile ou embryonnaire et larvaire létale.
Plusieurs souches tétraploïdes ont été générés en se nourrissant de bactéries de c. elegans exprimant dsRNA rec-8 à l’aide de l’une des deux stratégies (voir le protocole, Figure 2et tableau 1)27. Tétraploïdes peuvent être générés par autogame hermaphrodites pour deux ou trois générations en boîtes de Pétri avec bactéries exprimant dsRNA rec-8 . Par cette stratégie, un hermaphrodite est placé dans fraîchement fait rec-8 plaques de RNAi et sa descendance est transféré quelques jours plus tard sur les nouvelles plaques avec les bactéries exprimant Arni fraîchement induite rec-8 (voir le protocole). En outre, tétraploïdes peuvent être générés par le biais de franchissement de la première génération d’hermaphrodites nourri bactéries exprimant dsRNA rec-8 avec des mâles non traitées du même génotype dans les boîtes de Pétri avec bactéries exprimant dsRNA rec-8 ( Figure 2). Dans ce cas, les mâles dans les croisements sont exposés à la bactérie de RNAi rec-8 dès la phase L4, pendant l’accouplement. Les deux systèmes donnent lieu à tétraploïde animaux27. Le tableau 1 montre les souches tétraploïdes obtenus en utilisant le schéma présenté ici. Triploïdes et tétraploïdes c. elegans sont de plus grande taille que les diploïdes, mais les souches triploïdes sont instables et ont tendance à devenir diploïdes en une ou deux générations, alors que les souches tétraploïdes sont relativement stables22,23. Putatifs tétraploïdes souches ont été identifiées comme plus grand que l’original hermaphrodites de souche (Lon) qui a engendré une descendance de Lon (Figure 3 a) uniquement. Lon animaux est facilement identifiables - type sauvage animaux diploïdes est deux tiers de la longueur des tétraploïdes et leurs organismes ne font pas un pli supplémentaire, qui peut être remarqué au cours de son mouvement sinusoïdal vers l’avant (Figure 3 a).
Tétraploïdes souches ont été confirmés par le dépistage de la présence de 12 paires de chromosomes dans les ovocytes des hermaphrodites tétraploïdes comparées à six paires de chromosomes dans les ovocytes d’hermaphrodites diploïdes (Figure 3 b, Cet 1 film).
Tétraploïdes Classes :
Deux types d’hermaphrodites tétraploïdes ont été identifiés : un hommes voulue à des fréquences semblables comme hermaphrodites diploïdes et l’autre a les mâles à des fréquences beaucoup plus élevées (tableau 1). Ces deux types d’hermaphrodites tétraploïdes montrent diffèrent en ce que les fréquences de classe production semblables à celui des mâles diploïdes sont tétraploïdes pour tous ses chromosomes (4 a, 4 X), alors que les hautes fréquences de classe produisant des mâles sont hermaphrodites qui sont tétraploïdes pour les autosomes mais triploïde pour les chromosomes sexuels (4, 3 X). La classe plus tard des tétraploïdes est stable et produire des hermaphrodites de X 3, 4 a et 4 a, 2 mâles X.
Tétraploïdes souches croissent plus lentement et produisent des oisillons réduite par rapport à chez les diploïdes, qu'ils étaient issus, comme on le voit chez les souches générés avec la précédente méthode22,23. Madl et Herman22 a suggéré que la proportion accrue des embryons morts dans la variétés tétraploïde pourrait être due à une aneuploïdie dans l’ovocyte, mais une inspection superficielle des souches tétraploïdes n’a pas révélé suffisamment élevée nombre d’aneuploïde ovocytes ni des ovocytes anormaux ou des divisions spermatocyte pour tenir compte de la réduction observée de la taille des couvées (film 2et Figure 3, D).
Figure 1 : La gamétogenèse chez mutant rec-8 implique des mécanismes possibles pour générer des taches polyploïdes stables. (A) schéma du modèle d’organisation et ségrégation chromosomique dans le type sauvage et rec-8 divisions méiotiques mutants. Dans le type sauvage la méiose, les chromosomes homologues séparent dans la première division méiotique. Les chromatides sœurs de chaque homologue orientent vers le même pôle du fuseau et restent ensemble jusqu’en deuxième division. Chez les mutants rec-8 , homologues ne forment pas de filtres et donc ne sont pas connectés. En revanche à wild type, rec-8 soeur chromatides orientent loin un de l’autre et séparent dans la première division méiotique. (B) Diagramme de type sauvage et mutantes ovocytes montrant le pronucleus femelle et extrudés corps polaires (pronucléus mâle n’est pas représenté). Dans les ovocytes de type sauvage, deux divisions méiotiques asymétriques entraîner dans l’extrusion de deux corps polaires. Chez les mutants rec-8 cependant, second globule polaire extrusion échoue résultant dans un ovocyte diploïde. (C) des Images de type sauvage et rec-8 ovocytes mutants exprimant mCherry::histone H2B. Les flèches indiquent deux globules polaires dans l’ovocyte de type sauvage et un chez le mutant rec-8 . Barre d’échelle est de 5 µm. (D et E) en direct les Images des spermatides de type sauvage et rec-8 animaux mutants exprimant mCherry::histone H2B (magenta). Pointes de flèches indiquent anucléés spermatides. Barre d’échelle est en cours de la deuxième division (bourgeonnement) dans le type sauvage et le mutant rec-8 2 µm. (D) Spermatocytes. Les spermatocytes de type sauvage subissent des divisions symétriques entraînant quatre spermatides en herbe, chacun avec un complément chromosomique haploïde. Dans les spermatocytes mutant rec-8 , ségrégation des chromosomes est altérée en deuxième division. Le plus souvent, une seule masse de chromatine reste dans le corps résiduel (RB) ou dans l’un des deux sœur spermatides dans la seconde division méiotique. Cela donne lieu à anucléés rec-8 mutant (indiqué par les flèches) ovule ou spermatozoïde diploïde. (E) des images en direct de bourgeonnement des spermatides dans le type sauvage et rec-8 mutants visualisées à l’aide de contraste interférentiel différentiel (DIC) et la microscopie de fluorescence. Type sauvage spermatides tous ont des masses de chromatides sœurs similaires. REC-8 spermatides mutant forment anucléés sperme. (F) Quantification des spermatozoïdes anucléés mutant de type sauvage et rec-8 . mutants de REC-8 produit 38,5 % de spermatozoïdes anucléés comparée à moins de 1,6 % dans le type sauvage. Test Exact de Fisher indique qu’un mutant de rec-8 a une incidence significativement plus élevée de sperme anucléés (p ≤0.0001) par rapport à la souche sauvage. Barres d’erreur représentent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma de production et d’isoler les tétraploïdes c. elegans de toute souche. Flèche sur la droite représente la chronologie du protocole à partir de 1 jour et progresser vers le jour 17. Résultats similaires peuvent être obtenus par hermaphrodites de passage aux mâles non traités le jour 9. Supports de relier la représentation d’une étape à la chronologie. Animaux non traités est orange, animaux traités sont rouges, Lon animaux est de plus grande taille, rec-8 dsRNA exprimant des bactéries est dépeint comme des plaques transparentes avec fond rouge transparent et régulier OP50 bactéries est représentée sur fond gris transparent plaques de fond. Procédure se fait à 15 ° C, sauf indication contraire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : exemples de tétraploïdes. (A) image de champ lumineux d’un animal (MSC2) tétraploïde et la souche diploïde, qu'il a été dérivé (AV740). Tétraploïde c. elegans sont globalement plus gros et plus long (Lon), que l’espèce diploïde. Cette différence de taille se traduit par une courbe sinusoïdale supplémentaire du corps de la tétraploïde mobile et peut être utilisée comme un critère à l’écran pour les dérivés tétraploïdes. Barre d’échelle est de 0,1 mm. (B, C) les images de Fluorescence des diploïdes (AV740) et tétraploïdes (MSC1) plus mature ovocytes non fécondés nulcei, avant les divisions méiotiques. Criblage secondaire est effectuée en observant le nombre de paires de chromosomes dans les ovocytes non fécondés des souches Lon établis, tel qu’illustré dans le film 1 pour une souche MSC1 exprimer Mcherry::H2B et GFP::β-tubuline dans la lignée germinale. Barre d’échelle est de 5 µm. (D) les Images depuis un laps de temps (film 2) des divisions méiotiques oocyte tétraploïde dépeignant une méiose normale généralement. Têtes de flèche marquent corps polaires et une ligne pointillée marque le cortex de l’ovocyte à l’intérieur de la spermathèque et entouré de sperme ; t = temps expiré en minutes. Barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Génotype | Tétraploïde dérivé (définit des Autosomes : nombre de chromosomes) * |
Souche parentale (diploïde) |
| meIs16 [pie-1p::mCherry :: sa-58 + unc-119(+)] ; | MSC1 (4A:4 X) | MSC0 |
| ruIs57 [pie-1p::GFP ::b-tubuline + unc-119(+)] | MSC2 (4A:3 X) | |
| MSC3 (4A:4 X) | ||
| MSC5 (4A:3 X) | ||
| MSC6 (4A:4 X) | ||
| MSC8 (4A:4 X) | ||
| UNC-119(ED3) III ; ddIs6 ; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)] ; ltIs37 ; ltIs37 [pAA64 ; pie-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] IV | MSC14 (4A:3 X) | TMR17 |
| MSC15 (4A:3 X) | ||
| MSC16 (4A:4 X) | ||
| SPO-11 (me44) / nT1 IV ; + / nT1 [qIs51 [myo-2::gfp EPI-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V | AV800& | AV776 |
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II ; | AV809& | AV727 |
| ltIs37 [pie-1p::mCherry :: sa-58 + unc-119(+)] IV ; | ||
| ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)] | ||
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II ; mnT12 (X ; IV) | AV826& | AV695 |
| min-1 [dpy-10(e128) mIs14 [myo-2::gfp pes-10::gfp]] / | AV810& | DR2078 |
| BLI-2(E768) unc-4(e120) II | ||
| ruIs32 [pie-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III | AV822& | AZ212 |
| AV823& | ||
| C. briggsae - mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::DsRed] | AV824& | JU1018 |
Tableau 1 : tétraploïdes souches générées. * Déduit en marquant le nombre de bivalents (paires homologues connectés) et univalents (homologues individuels) dans les ovocytes avant les divisions méiotiques en plus de la proportion de mâles sired.
Movie 1 : dépistage pour confirmer si stable Lon souches sont pleines ou partielles tétraploïdes. Film démarre avec un diagramme de type sauvage hermaphrodite mettant en valeur la région imagés (ovocytes non fécondés) pour identifier les tétraploïdes en comptant les paires de chromosomes. En suivant le schéma, une série de films Z-pile et projections montrent des gonades animaux diploïdes et tétraploïdes fixes et DAPI teinté ou direct des images des souches exprimant histone Mcherry::H2B. Sélection se fait en comptant le nombre de paires de chromosomes homologues connectés dans les ovocytes non fécondés. Comptage de MCherry ou DAPI teintés corps se fait dans l’ovocyte non fécondé plus proche du sperme stockage spermathèque (l’ovocyte «-1 »). Chromosomes chez cette ovocytes sont plus condensées et séparés l’un de l’autre, permettant plus précis homologue paires chefs d’accusation. Plus de 10 animaux par souche ont été examinés pour s’assurer du nombre de chromosomes-1 ovocyte était exactes. Épaisseur de la pile est 0,2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2 : divisions de l’oocyte tétraploïde semblent normale. Laps de temps de diviser les ovocytes d’une souche tétraploïde exprimant histone Mcherry::H2B et GFP::β-tubuline. Calendrier et patron des divisions semblent normaux. Images prises chaque 2,5 min. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Discussion
Production des gamètes haploïdes (n) est essentiel pour produire un zygote diploïde (2n) à la fécondation. Cette réduction du génome est réalisée au cours de la méiose avec deux divisions cellulaires consécutives après une duplication du génome unique. Pour générer des haploïdes gamètes, c. elegans, comme avec la plupart des autres métazoaires, séparer et paternellement-maternels homologues en première division, tandis que soeur séparer les chromatides de chaque homologue en deuxième division. Un chemin que le génome entier polyploïdie se pose dans la nature est la génération des gamètes qui ne parviennent pas à la moitié de la taille de leur génome au cours de la méiose.
Il est connu depuis plus de 50 ans que tétraploïde c. elegans nématodes sont viables et fertiles. Nigon23et plus tard Madl et Herman22, générée et identifié une poignée de c. elegans tétraploïdes en perturbant la ségrégation méiotique des chromosomes à l’aide de traitements de choc thermique et à l’aide de marqueurs génétiques, respectivement. Un single supplémentaire souche tétraploïde c. briggsae a été dérivée en utilisant ce protocole 30 ans plus tard de24. Ces tétraploïdes ont été utilisés pour étudier comment le c. elegans déterminer s’il devenir mâle ou hermaphrodites, comment ploïdie régule la croissance et taille et d’analyser l’appariement et synapsis en méiose25,26, 38 , 39 , 40. mais ces et autres études impliquant l’utilisation de tétraploïdes spécifiques ou triploïdes souches étaient limitées par la difficulté à produire des souches tétraploïdes par cette méthode.
Le protocole décrit ici permet la génération de stable complet 4 a, 4 X et partielle 4 a, 3 X tétraploïde Caenorhabditis nématodes souches de n’importe lequel initial diploïde bagage génétique ou caryotype sans l’utilisation de marqueurs génétiques.
De plus un mécanisme chez c. elegans, tétraploïdie peuvent survenir :
Madl et Herman a proposé que les souches tétraploïdes qu’ils engendraient probablement dérivé d’un état intermédiaire triploïde. Leurs souches ont été obtenues par sélection sur plusieurs générations ou en croisant les triploïdes putatif intermédiaire avec mâles diploïdes22. Les vices du chromosome partitionnement dans rec-8 mutants qui donne lieu à diploïdes ovocytes et spermatozoïdes suggèrent un autre mécanisme possible par laquelle animaux tétraploïdes peut-être survenir avec le rec-8 Arni schéma27.
Les hermaphrodites de RNAi traité rec-8 pouvaient produire diploïdes oocytes et les spermatocytes, qui donneraient lieu à tétraploïde animaux lors de la fécondation. Conformément à cette possibilité est le fait que certains des cloné hermaphrodites F2 a donné lieu à stable Lon souches dans la prochaine génération, ce qui suggère que les hermaphrodites Lon F2 clonés où déjà tétraploïde. Dans le schéma de passage à niveau, la première génération de rec-8 Arni traité hermaphrodites est croisée avec les hommes non traités. Diploïdes spermatocytes pourraient se posent encore chez les hommes, parce que la Croix se faite en présence de bactéries exprimant dsRNA rec-8 et ainsi, les hommes sont exposés à rec-8 Arni pendant l’accouplement pendant au moins 3 jours. Par conséquent, les polyploïdes Lon dans le schéma interactif pourraient également ont formé de la fécondation des ovocytes diploïdes par spermatozoïde diploïde. Souches tétraploïdes stables peuvent survenir de soit la fécondation entre gamètes diploïdes ou du croisement triploïdes animaux contenant des ovocytes de ploïdie variable avec animaux diploïdes, production de spermatozoïdes haploïdes.
Considérations importantes :
Auto-par rapport aux régimes de fertilisation croisée :
Le schéma de fertilisation auto rec-8 Arni traités F1 hermaphrodites et le régime impliquant des passages d’hermaphrodites traitées avec des mâles non traités a donné naissance à 4 a, 4 X, 4 a, 3 variétés tétraploïdes de X. Bien que plus polyploïdes ont été initialement isolées du régime autogame, plusieurs de ces animaux polyploïdes sont stériles et les deux régimes sont donc de même efficaces dans la production de souches stables tétraploïdes. La raison de la réussite accrue et la stérilité dans le régime autogame reste inconnue. Bien que les deux régimes sont efficaces de la même façon, le régime autogame est plus facile car il ne nécessite pas l’isolement des mâles pour l’accouplement. En outre, lorsque la souche d’intérêt est inefficace ou défectueux à l’accouplement, le régime autogame serait préférable. Le schéma interactif peut être utilisé pour générer des tétraploïdes complexes contenant plus de deux versions d’un seul chromosome.
Modifications et restrictions :
Actuellement, ce protocole implique rec-8 Arni traitement en se nourrissant de bactéries exprimant l’ARNdb pour le gène rec-8 . Ainsi, ce protocole ne fonctionne pas dans l’espèce Caenorhabditis insensible aux ARNi en se nourrissant, ou chez les mutants défectueux en propagation environnementale ou systémique de l’ARNi entre tissus41,42,43. Ce problème pourrait potentiellement être résolu en introduisant Arni traitement par injection directe de l’ARNdb d’intérêt directement dans la lignée germinale.
Triploïdes animaux doit être généré en croisant un tétraploïde à un animal diploïde dont il est issu, parce que ce régime ne génère pas de souches triploïdes stable44,45. Seulement 15 % des oeufs engendré par triploïdes hatch, et leurs descendants sont principalement des descendants stériles en raison de l’aneuploïdie. En outre, la quelques survivants une descendance fertile ont tendance à être des complets ou près de diploïdes au bout de quelques générations. C’est probablement, au moins en partie, parce que les ovocytes sont partiellement corriger trisomie en séparant le troisième chromosome dans le globule polaire dans la première division méiotique.
Une limite infranchissable du présent protocole est qu’il ne fonctionne pas pour faire des tétraploïdes de mutants qui affectent les composants de la machinerie de l’ARNi parce qu’ils sont résistants aux Arni traitement46.
Dépannage :
Rec-8 Arni :
Quelques considérations sont cruciales pour que ce protocole soit réussie. La première consiste à utiliser l’IPTG frais et fraîchement IPTG NMG plaques pour l’induction de la production de dsRNA rec-8 dans les bactéries bactéries HT115 transportant le clone de rec-8 (W02A2.6). IPTG est sensible à la lumière, et il est important de réduire l’exposition à la lumière de plaques. Plaques d’IPTG peuvent être conservés jusqu'à un mois à 4 ° C dans l’obscurité. Deuxièmement, les souches bactériennes de HT115 d’Arni rec-8 (W02A2.6) de la bibliothèque Ahringer (Kaya et Ahringer, 2003) a produit un phénotype de rec-8 plus fort que les autres disponible rec-8 HT115 clones.
Entretien de la souche tétraploïde :
Tétraploïdes souches poussent très lentement et produisent au plus 50 descendants par génération47. Toutes les souches tétraploïdes identifiés sont relativement stables, mais ils peuvent se décomposent et deviennent quand diploïde a souligné (communication personnelle de Jonathan Hodgkin et nos observations non publiées). Par conséquent, il est important de noter que lorsque les variétés tétraploïdes sont cultivées à 25 ° C, un choc thermique, de faim, ou congelés et décongelés, ils peuvent rapidement revenir à diploïdie, il est donc important de continuer à prendre les animaux Lon quand ces souches de dégivrage ou lorsque exposer ces souches à des conditions stressantes qui pourraient les faire revenir.
Applications possibles :
Étude de l’effet ou le rôle de polyploïdisation du génome entier en évolution, cycle cellulaire, l’expression des gènes et le développement dans les organismes multicellulaires, s’appuyant sur des comparaisons entre : dans l’organisme, les cellules qui contiennent la ploïdie différente, la même cellule types dans étroitement lié espèces avec ploïdie différent, ou qui ont subi des événements de polyploïdisation évolutivement récents et isolement physique3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Bien que les tétraploïdes peuvent être dérivées de systèmes modèles de poisson-zèbre et de la souris, leur progéniture est stériles ou embryonnaire létal16,17. En outre, ces systèmes de modèles ont de longs cycles de vie par rapport à c. elegans, et les méthodes disponibles pour générer les animaux polyploïdes sont complexes et inefficaces. Les souches de c. elegans obtenues par cette méthode sera donc joué un rôle important pour faire avancer une enquête sur les effets et les rôles du génome entier polyploïdie chez les organismes multicellulaires.
Puisqu’un triploïde peut être dérivé d’un tétraploïde en traversant les tétraploïdes vers l’espèce diploïde original, une comparaison entre des diploïdes, triploïdes et tétraploïdes qui diffèrent seulement par le nombre de copies du génome, offre une occasion unique et sans précédent de évaluer les animaux/organes/cellules équivalentes, avec la taille du génome différent (ou dose de gène). La souplesse et la facilité du système décrit ici nous a permis de générer des dizaines de souches tétraploïdes de différents fonds génétiques de diploïdes ou caryotypes. Certaines de ces souches étaient déjà utilisés à des mécanismes d’appariement des chromosomes homologues et synapsis requête au cours de la méiose,27.
Type sauvage et mutant de tétraploïdes souches porteuses de marqueurs fluorescents fournira de nouvelles pistes d’enquête pour comprendre les relations entre le ratio de taille et nucléaire/cytosol génome sur animal intracellulaire/cellulaire/orgue et toute mise à l’échelle du génome entier polyploïdisation sur adaptation, spéciation, dose de gènes et expression et le développement des tissus et des organes. En plus de l’étude d’évolution biologique, la génération des souches tétraploïdes sera significativement plus les requêtes des questions biologiques fondamentales concernant extracellulaire signalisation, l’instabilité du génome, endoréduplication, l’ensemble du génome duplication, dosage des gènes, adaptation au stress, développement de la résistance aux médicaments et spéciation du mécanisme.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le centre de génétique de Caenorhabditis (financé par le National Institute of Health (NIH) Bureau de recherche Infrastructure programmes P40 OD010440) de souches. Les auteurs aimeraient remercier Baptiste Roelens et Eli Lessman, pour nous fournir une rétroaction constructive et le laboratoire de Mano CCNY, CUNY pour l’utilisation de leur laboratoire pour partie du tournage et pour leur aide. Ce travail a été soutenu par une bourse de la CFP-CUNY TRADB-46-113 et NIH grant 1SC2GM118275-01. M.S. a été partiellement pris en charge par un Institut canadien d’études postdoctorales en santé (ICRS) et E.K. a été appuyée par le NIH/NIGM RISE accorder GM062981.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM agar plates | |||
| 60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
| 35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
| Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
| Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Culture | |||
| LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar plates | |||
| LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics | |||
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAi Clones | |||
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |
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