Summary
Denna metod möjliggör generering av gräsart och triploid Caenorhabditis nematoder från någon diploida stam. Polyploida stammar som genereras av denna metod har använts för att studera kromosom interaktioner i meiotiska profas, och denna metod är användbar för att undersöka viktiga grundläggande frågor i cell, utvecklingsmässiga, evolutionär, och cancerbiologi.
Abstract
Mekanismer som involverar hela genomet polyploidi spelar viktiga roller i utveckling och evolution; också, en onormal generering av gräsart celler har associerats med både utvecklingen av cancer och utveckling av resistens. Hittills har det inte varit möjligt att enkelt manipulera skall ploiditeten flercelliga djur utan att generera mestadels steril avkomma. Presenteras här är ett enkelt och snabbt protokoll för generering av gräsart Caenorhabditis elegans djur från någon diploida stam. Denna metod tillåter användaren att skapa en bias i kromosomsegregering under meios, slutändan öka ploiditeten i C. elegans. Denna strategi bygger på en övergående minskning av uttryck av genen rec-8 att generera diploida könsceller. En rec-8 mutant producerar diploida könsceller som potentiellt kan producera tetraploids vid gödsling. Detta eftertraktansvärda system har använts för att generera gräsart stammar bär mutationer och kromosom rearrangements att få insikt i kromosomala dynamik och interaktioner under ihopparning och mås i meios. Denna metod är effektiv för att generera stabil gräsart stammar utan genetiska markörer, kan tillämpas på någon diploida stam och kan användas för att härleda triploid C. elegans. Denna enkla metod är användbar för att undersöka grundläggande biologiska frågor relevanta för genomet instabilitet, gen dosering, biologisk skalning, extracellulär signalering, anpassning till stress, utveckling av resistens mot läkemedel, och mekanismer för artbildning.
Introduction
Hela genomet polyploidi finns i naturen och är ofta ett nödvändigt steg i anpassning, artbildning, organogenes, sårläkning och biologisk skalning; Det är också känt att främja både cancer och motstånd mot droger1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. jordbruk samt fiske industrier generera polyploida växter, fisk och skaldjur genom kemisk behandling (t.ex.kolkicin och orzalin) att få snabbare tillväxttakt och skrymmande grödor och boskap13, 14,15. Experimentella och ineffektiv produktion av tetraploids finns för mus och zebrafisk modellen system16,17. Dock är de flesta eller alla polyploida flercelliga djur genereras embryonically dödliga eller sterila och således inte idealiskt för laborativa studier om effekterna av polyploidi i en multicellulär organism. Följaktligen, någon förståelse av hela genomet polyploidization i flercelliga organismer har begränsats till närbesläktade arter från evolutionära senaste polyploidization evenemang18,19,20 . En väg att avancera frågor av biologiska roll eller följder av polyploidization är användningen av C. elegans modell systemet. Ännu viktigare, C. elegans är ett fogligt genetiska system som normalt finns som en diploida, innehåller endast fem autosomer (A) och en kön kromosom (X) per genomet, är transparent vilket möjliggör i vivo observation av biologiska processer, och har kort livslängd på 3-4 dagar (från ägg till könsmogna vuxen). C. elegans har visat sig kunna reproducera som en gräsart, vilket är den vanligaste typen av hela genomet polyploidi i naturen. Triploid djur kan genereras genom att korsa tetraploids med diploider, men deras ploiditeten är inte stabil och stammar bli diploida inom ett par generationer.
Under de senaste decennierna bara en handfull av livskraftiga och fruktbara C. elegans tetraploids stammar isolerades i laboratoriet, använder en strategi som är mödosam och genererar endast begränsade typer av stammar21,22, 23. denna strategi genererar C. elegans tetraploids av heat-shock behandlingar, vilket förmodligen påverkar kromosomsegregering i könsceller, följt av en screening för förmodad polyploida djur med hjälp av genetiska markörer. Dessa tetraploids var extremt användbara i utredningen av hur denna nematod avgör om att bli manlig eller hermafrodit. Senare studier används de tillgängliga stammarna för att undersöka den tillväxt, gen dos och reglering av synapsis under meios i denna nematoder21,24,25,26. Tyvärr, dessa studier var begränsad av svårigheten att generera nya gräsart stammar och de bakgrunden genetiska markörerna dessa stammar som finns. Här visas en enkel och snabb protokollet att generera stabila tetraploids, som har använts för att generera stammar för att studera reglering av synapsis under meios27.
Som i naturen, kan polyploidization uppstå vid bildandet av diploida istället för haploida könsceller. Vår slutsats att en meios-specifika cohesin komponent mutant rec-8 genererar diploida spermier och äggceller indikerade att knacka ner rec-8 genen skulle resultera i produktionen av gräsart avkomma (figur 1)27, 28,29. Generera gräsart stammar helt enkelt innebär att knacka ner rec-8 av RNA-interferens (RNAi) för två generationer för att phenocopy den rec-8 mutant diploida könsceller. Förmodad polyploids lätt kan identifieras genom sin längre än normal kroppsbyggnad. Polyploids bekräftas som helt eller delvis tetraploids genom att räkna antalet kromosomer per kärna när stabil linjerna är etablerade.
Den strategi som beskrivs här möjliggör generering av stabil gräsart Caenorhabditis nematoder stammar från inledande diploida genetisk bakgrund eller karyotyp utan användning av genetiska markörer. Eftersom detta protokoll är mer effektiv, mångsidig och enkel än de system som tidigare använts, kommer att det expandera de verktyg som behövs för att fråga polyploidization i grundläggande processer av utveckling, genomet stabilitet och evolution i flercelliga roller organismer. Bara förutsebara begränsning i användningen av detta protokoll är i genetiska bakgrunder resistenta mot RNAi.
Protocol
1. ställa in rec-8 RNAi (dag 1-3 i figur 2)
Detta protokoll ändras från Kamath och Ahringer30.
- För induktion av rec-8 dsRNA uttryck i Escherichia coli, förbereda Nematoden tillväxt Medium (NGM) agar plattor31 kompletteras med en slutlig koncentration på 1 mM isopropyl-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) och 100 µg/mL ampicillin. Förvaras i mörker vid 4 ° C fram till användning, för upp till 4 veckor.
- Strimma HT115 bakteriebärande rec-8 (W02A2.6) klonen från Ahringer laboratorium bibliotek30 rec-8 klonen på Luria buljong (LB) plattor kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och 50 µg/mL tetracyklin. Växa över natten i en shaker vid 37 ° C.
- Dag 1, Inokulera enstaka kolonier från färska strimmiga enstaka kolonier av de HT115 E. coli -bakterier som bär rec-8 RNAi klonen till 4 mL LB innehållande 100 µg/mL ampicillin och 50 µg/mL tetracyklin. Odla bakterier kulturen över natten i en shaker eller en rulle trumma vid 37 ° C.
- Nästa morgon (dag 2), inducera produktion av dubbel stranded (ds) RNA för rec-8 W02A2.6 i HT115 bakteriella kulturen genom att lägga till en slutlig koncentration på 1 mM IPTG och skakar för 40 min vid 37 ° C.
- Efter induktion, utsäde NGM/IPTG plattor med 100-200 µL HT115 rec-8 bakterier och förvara tallrikar vid rumstemperatur i den mörka natten (dag 3).
- Nästa morgon (dag 4), lägga till önskad nematoder stammen inducerad HT115 rec-8 bakterier plattorna som beskrivs i steg 2.1 nedan.
2. generera och isolera Tetraploids (dag 4-16 i figur 2)
- På dag 4, placera 3-4 ung L4 (fjärde) larvstadium hermafroditer av önskad diploida belastningen på NMG/IPTG plattorna som ympats med HT115 rec-8 bakterier som hade inducerats dagen innan (steg 1,5, ovan). Odla nematoder på 15 ° C i mörker.
- Upprepa steg 1.3 och 1.4 3 dagar efter steg 2.1, som kommer att vara tre dagar innan den första avkomman (F1s) från det steget blir L4s. Tidpunkten för detta steg kommer att bero på hur snabbt en nematoder stam växer vid 15 ° C. Vissa diploida mutant stammar är långsam odlare, och denna tidpunkt kommer behöver fina tuning för att isolera tetraploids.
- Dag 8 (efter 4 dagar av rec-8 RNAi utfodring behandling), överföra 20 (2 hermafroditer/petriskål) av de F1 (första filial generationen) L4 hermafroditer odlas i HT115 rec-8 bakterier på nybakade inducerad HT115 rec-8 RNAi och tillåta dem till self-fertilize.
- Alternativt, överföring 20 av de F1 L4 hermafroditer odlas i HT115 rec-8 bakterier på nybakade inducerad HT115 rec-8 RNAi bakterier tillsammans med obehandlade hanar av samma stam (2 hermafroditer med 4-6 hanar/platta).
- På dag 13, start screening för F2 (filial understödjautvecklingen) avkomma som visas långa (Lon) eller totalt sett större än den vilda typen; sedan överföra enskilda Lon djur på regelbundna OP50 eller HB101 stammar av E. coli -bakterier. Fortsätt screening F3 (tredje filial) avkomma; dock F3 avkomma från samma platta anses inte oberoende stammar om de blir etablerade, eftersom de skulle kunna vara syskon från samma etablerade redan F2 mor.
Obs: Förmodad tetraploids identifieras enkelt eftersom de är klart längre än diploider. Vildtyp hermafroditer är två tredjedelar kortare än tetraploids. Eftersom det är längre, gör en gräsart kroppen en extra sväng när den rör sig framåt genom att generera kropp-bockning sinusvågor från huvud till svans (figur 3A). - Tillåta Lon maskar till self-fertilize och spridits genom att plocka Lon avkomma tills endast Lon avkomma är far i avsaknad av rec-8 RNAi behandling. Det kan ta två till tre ytterligare generationer. Lon maskar ofta är sterila och ger inte avkomman.
3. Verifiera gräsart stammar (film 1 och figur 3A, B)
Obs: Gräsart stammar kan verifieras genom att räkna antalet kromosomer i deras obefruktade äggceller. Fluorescerande mikroskopi kan användas till skärmen för antalet kromosom par i obefruktat diploida oocyter (före meiotiska divisioner), om stammen har en fluorescerande markör för kromosomer. I avsaknad av fluorescerande kromosom markörer, kan gräsart nematoder kontrolleras genom att fastställa nematoder och färgning med ett DNA färgämne; Se nedan för ett protokoll för fastställande av etanol och hela-djur 4′, 6-Diamidine-2 '-fenylindol dihydroklorid (DAPI) färgning.
- Hela djur DAPI färgning
Obs: Gräsart stammar bära 12 anslutna kromosom par kan verifieras av DAPI färgning dessa djur och räknar antalet DAPI organ i dess obefruktade äggceller.- Placera 5 till 10 µL av M9 buffert31 på ett objektglas, sedan överföra 6-10 nematoder till droppa.
- I dissekera Mikroskop, rita de flesta av M9 i listrutan utan att ta bort nematoder med en luddfri rengöring vävnad. Lägg sedan omedelbart till en 10 µL droppe 90% etanol på maskar. Låt maskarna torka helt, men för längre än ett par sekunder.
- Så snart etanolen avdunstar (detta kan ses som det händer under mikroskopet dissekera), lägga till ett ytterligare 10 µL av 90% etanol på maskar.
- Upprepa steg 3.1.3 ytterligare tre gånger.
- När den sista droppen av etanol har avdunstat, tillsätt 6 µL av DAPI eller Hoechst färgämne på rekommenderade slutliga koncentration i montering media val (till exempel en 1:1,000 spädning av en 2 ng/µL DAPI lager koncentration i M9). För långsiktig lagring av bilder, kan 0,5% p-fenylendiamin upplöst i 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, i 90% glycerol som antifade lösning, i stället för M9 bara, användas.
- Täcka maskar i bilden med ett täckglas och försegla kanterna på täckglaset med nagellack. Poäng i ett fluorescens Mikroskop (steg 3.1.7) minst 10 min efter tillägger täckglaset. Bilder utan antifade kan förvaras några dagar vid 4 ° C före scoring, men kvaliteten på fluorescens börjar avta efter några dagar.
- Med fluorescerande Mikroskop på 100 X förstoring, Poäng antalet enda DAPI organ (förmodligen enda kromosom par) i de mest mogna obefruktade äggcellen, som ligger omedelbart intill spermatheca och ännu inte har trätt i spermatheca eller i livmodern.
- För att Poäng enskilda DAPI organ inom en äggcell nucleus, Använd mikroskopets fina fokus rör sig långsamt från toppen av äggcell kärnan till botten under inventering. Sedan berätta samma kärnan medan du flyttar fokus i motsatt riktning (dvs.från botten till toppen av kärnan) att bekräfta räknade antalet DAPI organ.
- Poäng de mest mogna obefruktade äggcellen i varje två gonader i minst tio hermafroditer per stabil Lon stam. Vildtyp oocyter har 6 DAPI organ på genomsnittet, 5 autosome par och sex kromosomparen. Förekomsten av 12 DAPI organ i äggcellen stabil Lon stammar visar att djuren i denna stam är antingen partiell (4 uppsättningar av autosomer, 3 X-chromosomes) eller komplett (4 uppsättningar av autosomer, 4 X-chromosomes) tetraploids.
- Beräkna det genomsnittliga antalet DAPI organ observeras från flera (minst 10) ägg per stam. Några par med kromosomen kommer att röra eller rätt på toppen av en annan, så antalet DAPI organ i en äggcell är ofta mindre än det faktiska antalet kromosom par.
- (Valfritt) Ytterligare validera stabil Lon stammar där det genomsnittliga antalet DAPI organ är 12 för att testa om de är full (4A, 4 X) eller delvis (4A, 3 X) tetraploids genom immunofluorescens färgning mot kromosom axis proteiner såsom HTP-332. Denna färgning kommer att skilja kromosom par av visar en korsformad mönster från enda osammanhängande kromosomer förekommer i den delvis gräsart.
Representative Results
Nedskrivningar av rec-8 meiotiska Cohesin komponent funktion resultat i diploida könsceller:
Avbildning av divisionerna meiotiska cohesin komponent mutant rec-8 avslöjade spermier och äggceller möjliga mekanismer för att generera gräsart djur (figur 1)27,29,33. Slentrianmässigt, är meiotiska divisionen defekterna rec-8 mutant spermier och ägg olika; dock produceras både manliga och kvinnliga diploida könsceller av rec-8 mutant.
I vildtyp meios, homologa kromosomer blir tillfälligt anslutna till varandra genom crossover rekombination och anger den första meiotiska divisionen som en enhet eller tvåvärd (figur 1A)34. Under den första divisionen, segregera homologa kromosomer (homologs) ligger bredvid varandra, medan syster kromatiderna i varje homolog förblir tillsammans fram till den andra divisionen. Även om mönstret av kromosomsegregering är samma i kvinnliga och manliga könsceller, är äggcell divisionerna asymmetrisk spermatocyte divisioner är symmetrisk och genomgå en specialiserad cytokines. I varje division ignorerar äggcellen hälften av division produkten i en liten polar kropp. Således ger varje äggcell föregångare upphov till en enda haploida äggcellen och två polar organ (figur 1B, C)35. Omvänt, en enda spermatocyte föregångare medför att fyra funktionella spermatids med som genomgår två symmetriska divisioner. Den andra divisionen kulminerar med fyra spermatids spirande från en kvarstående kropp. Detta cytokines är speciella i att mönstret och antalet spermatids bestäms av den centrosomes36.
I föregångaren till rec-8 mutant könsceller, crossover rekombination mellan homologa kromosomer sker inte och homologs inte är anslutna som en tvåvärd i början av den första meiotiska division29,34. Syster kromatiderna av varje homolog segregera ligger bredvid varandra i första divisionen i stället för återstående tillsammans fram till den andra divisionen, som de gör i vildtyp könsceller. Intressant, är rec-8 mutanta fenotypen under andra divisionen annorlunda i manliga och kvinnliga könsceller i att oocyter misslyckas att genomgå cytokines medan spermatocyter genomgå en relativt normal cytokines (figur 1B– F) 27 , 28 , 29. diploida oocyter uppstå eftersom i andradivisionen de misslyckas både kromosomsegregering och cytokines, därmed de inte pressa den andra polar kroppen (figur 1B, C). Spermatocyter i rec-8 germlines genomgå spermatid spirande eller cytokines, men ofta segregera båda uppsättningar kromosomer till en av spermatids ge en diploida spermatid och en spermatid som saknar kromatin (figur 1 d– F)27. Kvantifiering av andelen rec-8 spermier saknas kromatin visas i figur 1F.
Bildandet av kvinnliga och manliga diploida könsceller i rec-8 mutanter föreslog att denna mutanta fenotypen potentiellt skulle kunna användas att generera fullständiga genomet gräsart stammar.
Generation av gräsart C. elegans stammar:
Förekomst av en mutation i genen rec-8 i alla de genererade gräsart stammarna kan undvikas genom övergående knackar ner rec-8 av RNAi29,37. Detta förutsätter att minskningen av rec-8 funktion av RNAi skulle generera diploida könsceller som potentiellt kan ge upphov till hela genomet gräsart djur, som rec-8 mutanter gör29,37. Viktigt att detta protokoll är att rec-8 mutanter både ge upphov till diploida könsceller och sire ett någorlunda stort antal ung, tvärtemot andra meiotiska mutanter, som ger upphov till aneuploid könsceller och är mestadels steril eller embryonala/larvformer dödliga.
Flera gräsart stammar genererades av utfodring C. elegans bakterier uttrycker rec-8 dsRNA använda endera av två strategier (se protokoll, figur 2och tabell 1)27. Tetraploids kan genereras av egen gödning hermafroditer i två till tre generationer i petriskålar med bakterier att uttrycka rec-8 dsRNA. Genom denna strategi en hermafrodit placeras i nymalen överförs gjorde rec-8 RNAi tallrikar och dess avkomma några dagar senare på nya plattor med nymalen inducerad rec-8 RNAi uttrycker bakterier (se protokoll). Dessutom kan tetraploids genereras genom passerar den första generationen av hermafroditer matas bakterier uttrycker rec-8 dsRNA med obehandlade hanar av samma genotyp i petriskålar med bakterier att uttrycka rec-8 dsRNA ( Figur 2). I detta fall utsätts hanarna i korset på rec-8 RNAi bakterier från L4 scenen och framåt, under parning. Båda systemen ger upphov till gräsart djur27. Tabell 1 visar gräsart stammar erhålls med det systemet som presenteras här. Triploid och gräsart C. elegans är större än diploider, men triploid stammar är instabila och tenderar att bli diploida i en eller två generationer, medan gräsart stammar är relativt stabil22,23. Förmodad gräsart stammar identifierades som större än de ursprungliga stam (Lon) hermafroditer som gör önskade endast Lon avkomma (figur 3A). Lon djur identifieras enkelt - vildtyp diploida djur är två tredjedelar av längden av tetraploids och deras kroppar gör inte en extra böj, vilket märks under dess sinusformad framåtskridande (figur 3A).
Gräsart stammar bekräftades av screening för förekomsten av 12 kromosom par i oocyter de gräsart hermafroditer jämfört med sex kromosom par i oocyter diploida hermafroditer (figur 3B, Coch film 1).
Gräsart klasser:
Två typer av gräsart hermafroditer identifierades: en Filbackupfönstret hanar vid liknande frekvenser som diploida hermafroditer och den andra gör önskade hanar vid mycket högre frekvenser (tabell 1). Dessa två typer av gräsart hermafroditer har visat sig skiljer sig då klassen producerar frekvenserna liknar de diploida män är gräsart för alla dess kromosomer (4A, 4 X), medan klass som producerar höga frekvenser av män är hermafroditer som är gräsart för autosomer men triploid för könskromosom (4, 3 X). Den sena klassen av tetraploids är stabila och producera 4A, 3 X hermafroditer och 4A, 2 X hanar.
Gräsart stammar växa långsammare och producera reducerad barnaskara storlek jämfört med de diploider som de härrör från, som sett för de stammar som genereras med den tidigare metod22,23. Madl och Herman22 föreslog att den ökade andelen döda embryon i den gräsart stammar kan bero på aneuploidi i en äggcell, men ytlig inspektion av gräsart stammar visade inte tillräckligt förhöjt antal aneuploid oocyter eller onormal äggcell eller spermatocyte divisioner att ta hänsyn till den observerade minskningen barnaskara storlek (Movie 2och figur 3 c, D).
Figur 1: Könscellsbildning i rec-8 mutant innebär möjliga mekanismer för att generera stabil polyploida fläckar. (A) Diagram av kromosom organisation och segregation mönstret i vildtyp och rec-8 mutant meiotiska divisionen. I vildtyp meios separat homologa kromosomer i den första meiotiska divisionen. Syster kromatiderna i varje homolog orientera mot samma spindel pole och förbli tillsammans till andra divisionen. I rec-8 mutanter, homologs utgör inte delningsfilter, och således inte är anslutna. I kontrast till vilda typ, rec-8 syster kromatiderna orientera ligger bredvid varandra och separat i den första meiotiska divisionen. (B) diagrammet av vildtyp och muterade oocyter visar de kvinnliga pronucleus och extruderad polar organ (manliga pronucleus inte avbildas). I vildtyp oocyter leda två asymmetriska meiotiska divisioner extrudering av två polar organ. I rec-8 mutanter misslyckas dock andra polar kroppen extrudering vilket resulterar i en diploida äggcellen. (C) bilder av vildtyp och rec-8 mutant oocyter som uttrycker mCherry::histone H2B. Pilarna visar två polar organ i den vilda typen äggcellen och en i rec-8 mutant. Skalstapeln är 5 µm. (D och E) livebilder av spermatids från vildtyp och rec-8 muterade djur uttrycker mCherry::histone H2B (magenta). Pilspetsar visar anucleate spermatids. Skalstapeln är 2 µm. (D) spermatocyter genomgår (blivande) understödjauppdelningen i vildtyp och rec-8 mutant. De vilda typen spermatocyter genomgå symmetriska divisioner vilket resulterar i fyra blivande spermatids, vardera med ett haploida kromosom komplement. I rec-8 mutant spermatocyter, är kromosomsegregering nedsatt i andradivisionen. Oftast kvar en enda massa av kromatin i övriga kroppen (RB) eller i en av två syster spermatids i andra meiotiska divisionen. Detta ger upphov till anucleate rec-8 mutant spermier (indikeras av pilspetsar) eller diploida spermier. (E) levande bilder av efter knoppar spermatids i vildtyp och rec-8 mutanter visualiseras med hjälp av differentiell störningar kontrast (DIC) och fluorescensmikroskopi. Vildtyp spermatids alla har liknande kromatida massorna. REC-8 mutant spermatids bildar anucleate spermier. (F) kvantifiering av vildtyp och rec-8 mutant anucleate spermier. REC-8 mutanter producerade 38,5% av anucleate spermier jämfört med mindre än 1,6% i vildtyp. Fishers exakta test indikerar att en rec-8 mutant har signifikant högre incidens av anucleate spermier (p ≤0.0001) jämfört med den vilda typen. Felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: System för generering och isolera gräsart C. elegans från någon stam. Pilen till höger representerar tidslinjen av protokoll från dag 1 och går vidare till dag 17. Liknande resultat kan uppnås genom korsning hermafroditer obehandlade män på dag 9. Parentes ansluta skildringen av ett steg till tidslinjen. Obehandlade djur är orange, behandlade djur är röda, Lon djur är större i storlek, rec-8 dsRNA uttrycker bakterier är avbildad som genomskinliga plattor med transparent röd bakgrund och regelbundna OP50 bakterier är avbildas på transparent grå Bakgrund plattor. Förfarandet sker vid 15 ° C om inte annat anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: gräsart exempel. (A) ljusa fältet bild av en gräsart (MSC2) djur och diploida stammen det härleddes från (AV740). Gräsart C. elegans är överlag större och längre (Lon) än diploida. Denna skillnad i kroppsstorlek resulterar i en extra sinusformad kurva av kroppen av den rörliga gräsart och kan användas som ett kriterium för att skärmen för gräsart derivat. Skalstapeln är 0,1 mm. (B, C) fluorescens bilder av diploida (AV740) och gräsart (MSC1) mest mogna obefruktade äggcellen nulcei, innan de meiotiska divisionerna. Sekundära screeningen utförs genom att observera antalet kromosom-par i obefruktade äggceller av etablerade Lon stammar, som visas i filmen 1 för en MSC1 stam att uttrycka Mcherry::H2B och GFP::β-Tubulin i könsceller. Skalstapeln är 5 µm. (D) bilder från en tidsfördröjning (Movie 2) gräsart äggcellen meiotiska divisioner som skildrar en allmänhet normala meios. Pilen huvuden Markera polar organ och en prickad linje markerar cortex av äggcellen inuti spermatheca och omgiven av spermier; t = tid förfallit i minuter. Skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Genotyp | Gräsart derivat (uppsättningar av autosomer: # av X-chromosomes) * |
Föräldrarnas stam (diploida) |
| meIs16 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)]; | MSC1 (4A:4 X) | MSC0 |
| ruIs57 [pie-1p::GFP::b-tubulin + unc-119(+)] | MSC2 (4A:3 X) | |
| MSC3 (4A:4 X) | ||
| MSC5 (4A:3 X) | ||
| MSC6 (4A:4 X) | ||
| MSC8 (4A:4 X) | ||
| UNC-119(ed3) III. ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64, pie-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] IV | MSC14 (4A:3 X) | TMR17 |
| MSC15 (4A:3 X) | ||
| MSC16 (4A:4 X) | ||
| SPO-11 (me44) / nT1 IV. +/ nT1 [qIs51 [myo-2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V | AV800& | AV776 |
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II. | AV809& | AV727 |
| ltIs37 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)] IV. | ||
| ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)] | ||
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II. mnT12 (X; IV) | AV826& | AV695 |
| mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [myo-2::gfp pes-10::gfp]] / | AV810& | DR2078 |
| bli-2(e768) unc-4(e120) II | ||
| ruIs32 [pie-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III | AV822& | AZ212 |
| AV823& | ||
| C. briggsae - mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::DsRed] | AV824& | JU1018 |
Tabell 1: gräsart stammar genereras. * Utläsas genom poängsättning antalet bivalents (anslutna homologa par) och univalents (individuella homologs) i oocyter före divisionerna meiotiska förutom andelen män som far.
Film 1: Screening att bekräfta huruvida stabil Lon stammar är full eller partiell tetraploids. Filmen börjar med ett diagram av vildtyp hermafrodit belyser regionen avbildas (obefruktade äggceller) att identifiera tetraploids genom att räkna kromosom par. Efter diagrammet, en serie Z-stack filmer och prognoser visar gonader diploida och gräsart djur fast och DAPI färgas eller live bilder av stammar som uttrycker Mcherry::H2B Histon. Screening sker genom att räkna antalet anslutna homologa kromosom par i obefruktade äggceller. Färgade organ sker i den obefruktade äggcellen närmast spermier lagra spermatheca (den ”-1 äggcellen”) och räkna av antingen MCherry eller DAPI. Kromosomerna i denna äggcellen är mest kondenseras och åtskilda från varandra, som möjliggör mer exakt homolog par räknas. Mer än 10 djur per stam screenades för att säkerställa-1 äggcellen kromosom räkningarna var korrekta. Bunttjocklek är 0,2 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: gräsart äggcellen divisioner verkar normala. Tidsfördröjning att dela upp äggcellen en gräsart stam som uttrycker Mcherry::H2B Histon och GFP::β-Tubulin. Timing och mönster av divisionerna verkar normala. Bilder tagna varje 2,5 min. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
Produktionen av haploida (n) könsceller är nyckeln till att generera en diploida (2n) zygot vid befruktning. Denna minskning av genomet sker under meios med två på varandra följande celldelningar efter en enda genomet dubbelarbete. För att generera haploid könsceller, C. elegans, som med de flesta andra metazoans, segregera maternellt - och flänga-härledda homologs i den första divisionen, medan syster kromatiderna från varje homolog segregera i andradivisionen. Ett sätt att hela genomet polyploidi uppstår i natur är genom generering av könsceller som misslyckas med att halva genomet storlek under meios.
Det har varit känt i över 50 år att gräsart C. elegans nematoder är livskraftiga och fruktbara. Nigon23, och senare Madl och Herman22, genereras och identifierade en handfull C. elegans tetraploids genom att störa meiotiska kromosomsegregering med heat-shock behandlingar och använda genetiska markörer, respektive. En enda ytterligare C. briggsae gräsart stam beräknades genom att använda detta protokoll över 30 år senare24. Dessa tetraploids utnyttjades för att undersöka hur C. elegans avgöra om att bli manlig eller hermafrodit, hur ploiditeten reglerar tillväxt och storlek, och att analysera ihopparning och mås i meios25,26, 38 , 39 , 40. men dessa och andra studier kräva användning av särskilda tetraploids eller triploid stammar begränsades av svårigheten att generera gräsart stammar av denna metod.
Protokollet beskrivs här möjliggör generering av stabil full 4A, 4 X och partiell 4A, 3 X gräsart Caenorhabditis nematoder stammar från någon initial diploida genetisk bakgrund eller karyotyp utan användning av genetiska markörer.
Tetraploidy kan uppstå med mer än en mekanism i C. elegans:
Föreslås att de gräsart stammar de genererat sannolikt härrör från en triploid mellantillstånd madl och Herman. Sina stammar erhölls genom urval över flera generationer eller genom att korsa den förmodade triploid mellanliggande med diploida män22. Defekter i kromosom partitionering i rec-8 mutanter som ger upphov till diploida ägg och spermier föreslår en annan möjlig mekanism genom vilken gräsart djur kan uppstå med rec-8 RNAi stödordningen27.
Rec-8 RNAi behandlas hermafroditer kunde producera diploida oocyter och spermatocyter, vilket skulle ge upphov till gräsart djur vid befruktning. Överensstämmer med denna möjlighet är det faktum att några av de klonade F2 hermafroditer gav upphov till stabil Lon stammar i nästa generation, vilket tyder på att de klonade Lon F2 hermafroditer där redan gräsart. I korsningen systemet korsas den första generationen av rec-8 RNAi behandlas hermafroditer med obehandlade hanar. Diploida spermatocyter kunde uppkomma hos män eftersom korset sker i närvaro av bakterier att uttrycka rec-8 dsRNA och således män utsätts för rec-8 RNAi under parning för minst 3 dagar. Därför kan de Lon-polyploids i korsbefruktande systemet också ha bildats från befruktning diploida oocyter av diploida spermier. Stabil gräsart stammar kan uppstå från antingen befruktning mellan diploida könsceller eller passerar triploid djur som innehåller oocyter från variabel ploiditeten med diploida djur producera haploida spermier.
Viktiga överväganden:
Self-kontra korsbefruktning system:
Systematiken i själv gödsling rec-8 RNAi behandlas F1 hermafroditer och systemet som inbegriper passage av behandlade hermafroditer med obehandlade hanar båda gav upphov till 4A, 4 X och 4A, 3 X gräsart stammar. Även om mer polyploids isolerades ursprungligen från systemet med egen gödning, mer av dessa polyploida djur var steril och således båda garantiprogrammen är likaså effektiva på att producera gräsart stabila stammar. Orsaken till ökad framgång och sterilitet i egen gödning systemet förblir okänd. Även om båda systemen är lika effektiva, är egen gödning systemet enklare eftersom det inte kräver isolering av hanar för parning. Dessutom, när stammen av intresse är ineffektiva eller defekt på parning, vore egen gödning systemet att föredra. Korsbefruktande systemet kan användas för att generera komplexa tetraploids som innehåller fler än två versioner av en enda kromosom.
Ändringar och begränsningar:
För närvarande innebär detta protokoll rec-8 RNAi behandling av utfodring bakterier uttrycker dsRNA för rec-8 gen. Detta protokoll fungerar således inte i Caenorhabditis arter svarar inte på RNAi av utfodring, eller i mutanter defekt i miljön eller systemisk spridning av RNAi mellan vävnader41,42,43. Detta problem skulle potentiellt kunna lösas genom att införa RNAi behandling genom direkt injektion av dsRNA sevärdheter direkt in i könsceller.
Triploid djur måste genereras genom att korsa en gräsart till en diploida djur från vilket det tagits, eftersom detta system inte genererar stabil triploid stammar44,45. Endast 15% av äggen efter triploids lucka, och deras avkomma mestadels steril avkomma på grund av aneuploidi. Dessutom tenderar några överlevande fertila avkomman att vara komplett eller nära diploider inom ett par generationer. Detta är sannolikt, åtminstone delvis, eftersom oocyter delvis rättar trisomi av segregerande tredje kromosomen i polar kroppen i den första meiotiska divisionen.
Ett oöverstigligt begränsning av detta protokoll är att det inte fungerar för att göra tetraploids av mutanter som påverkar komponenter av RNAi maskiner eftersom de är resistenta mot RNAi behandling46.
Felsökning:
REC-8 RNAi:
Några överväganden är avgörande för detta protokoll ska lyckas. Först är att använda färska IPTG och nygjorda IPTG NMG plattor för induktion av rec-8 dsRNA produktion i de bakterier HT115 bakteriebärande rec-8 (W02A2.6) klonen. IPTG är ljuskänsligt och det är viktigt att minska ljus exponering för plattor. IPTG plattor kan förvaras upp till en månad vid 4 ° C i mörker. För det andra gav de rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 bakteriestammar från Ahringer bibliotek (Kamath och Ahringer 2003) en starkare rec-8 fenotyp än andra tillgängliga rec-8 HT115 kloner.
Gräsart stam underhåll:
Gräsart stammar växer mycket långsamt och producera högst 50 avkommor per generation47. Alla identifierade gräsart stammar är relativt stabil, men de kan bryta ner och bli diploida när stressad (Jonathan Hodgkin personlig kommunikation och våra opublicerade observationer). Därför är det viktigt att notera att när gräsart stammar odlas vid 25 ° C, värme-chockad, utsvulten, eller fryst och tinad, de kan snabbt återgå till diploidy, så det är viktigt att fortsätta att plocka Lon djuren när avfrostning dessa stammar eller när utsätta dessa stammar till påfrestande förhållanden som kan orsaka dem att återgå.
Möjliga tillämpningar:
Undersökning av effekten eller rollen av hela genomet polyploidization i evolution, cellcykeln, genuttryck och utveckling i flercelliga organismer har förlitat sig på jämförelser mellan: celler i en organism som innehåller olika ploiditeten, samma cell typer i närbesläktade arter med olika ploiditeten eller arter som har genomgått evolutionärt senaste polyploidization händelser och fysisk isolering3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Även om tetraploids kan härledas från zebrafisk och mus modellsystem, är deras avkomma steril eller embryonically dödliga16,17. Dessutom, dessa modellsystem har långa livscykler jämfört med C. elegans, och tillgängliga metoder att generera polyploida djur är komplexa och ineffektiva. Därför, C. elegans stammar härstammar genom denna metod kommer att vara avgörande för att främja någon utredning på effekter och roller av hela genomet polyploidi i flercelliga organismer.
Eftersom en triploid kan härledas från en gräsart genom att korsa gräsart till den ursprungliga diploida, ger en jämförelse mellan diploider, triploids och tetraploids som endast skiljer sig i antalet genomet kopior, en unik och oöverträffad möjlighet att utvärdera motsvarande djur/organ/celler med olika genomet storlek (eller gen dos). Flexibilitet och användarvänlighet av systemet beskrivs här har tillåtit oss att skapa dussintals gräsart stammar från olika genetiska diploida bakgrunder eller karyotypes. Några av dessa stammar var redan brukade fråga mekanismer av homologa kromosom ihopparning och synapsis under meios27.
Vildtyp mutant gräsart stammar och bära fluorescerande markörer kommer att ge nya vägar för att förstå relationer mellan genomet storlek och kärn/cytosol baserat på intracellulära/mobilnät/orgel och hela djuret skalning, hela genomet polyploidization på anpassning, artbildning, gen dos och uttryck och vävnads- och utveckling. Förutom studien av biologisk skalning kommer generering av gräsart stammar avsevärt ytterligare frågor av grundläggande biologiska frågor relevanta för extracellulära signalering, genomet instabilitet, endoreduplikation, hela genomet dubbelarbete, gen dosering, anpassning till stress, utveckling av resistens mot droger och mekanism artbildning.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Caenorhabditis genetik centrum (finansierad av National Institute of Health (NIH) Office av forskning infrastruktur program P40 OD010440) för stammar. Författarna vill tacka Baptiste Roelens och Eli Lessman, för att förse oss med konstruktiv feedback och den Mano Lab vid CCNY, CUNY för användning av deras laboratorium för del av inspelningen och för deras hjälp. Detta arbete stöds av en PSC-CUNY award TRADB-46-113 och NIH bevilja 1SC2GM118275-01. M.S. stöddes delvis av en Canadian Institute of Health (CIHR) postdoktorsstipendium och E.K. stöddes av den NIH/NIGMS stiga bevilja GM062981.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM agar plates | |||
| 60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
| 35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
| Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
| Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Culture | |||
| LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar plates | |||
| LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics | |||
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAi Clones | |||
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |
References
- Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship. Trends Genet. 24, 457-466 (2008).
- Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L.
- Orr-Weaver, T. L. When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis. Trends Genet. 31, 307-315 (2015).
- Otto, S. P.
- Davoli, T., de Lange, T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Adams, K., Wendel, J. Novel patterns of gene expression in polyploid plants. Trends Genet. 21, 539-543 (2005).
- Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).
- Berman, J. Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress. FEMS Yeast Res. 16, (2016).
- Levy, D. L., Heald, R.
- Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O'toole, E. Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast. Nature. 443, 541-547 (2006).
- Kuznetsova, A. Y., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).
- Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. Genome duplication, divergent resolution and speciation. Trends Genet. 17, 299-301 (2001).
- Younis, A., Hwang, Y. -J., Lim, K. -B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding. Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).
- Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications. Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).
- Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B. Aquaculture. 23, 1-10 (1981).
- Eakin, G. S., Behringer, R. R. Tetraploid development in the mouse. Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).
- Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Arnold, B., Kim, S. -T., Bomblies, K. Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture. Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, 336-343 (2016).
- Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N.
- Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, Suppl . 5-16 (1987).
- Madl, J. E., Herman, R. K. Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans. Genetics. 93, 393-402 (1979).
- Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).
- Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -A., Haag, E. S. Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes. Genetics. 186, 997-1012 (2010).
- Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis. PLoS Genet. 9, e1003963 (2013).
- Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 16, 493-498 (2006).
- Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis. Genetics. 201, 1363-1379 (2015).
- Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
- Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
- MacQueen, A. J., et al. Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans. Cell. 123, 1037-1050 (2005).
- Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
- Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes. Genes Dev. 24, 219-228 (2010).
- Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. New York, NY. 277-320 (2013).
- Peters, N., et al. Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1. J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).
- Pasierbek, P. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).
- Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
- Flemming, A. J., Shen, Z. -Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).
- Meneely, P. M. Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans. Genetics. 137, 467-481 (1994).
- Whangbo, J. S., Hunter, C. P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 24, 297-305 (2008).
- Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 28198 (2016).
- Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 14, 111-116 (2004).
- Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes. Elife. 4, e06056 (2015).
- Vargas, E., et al. Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207, 911-922 (2017).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. , University of Oxford. (2005).
- Schoenfelder, K. P., Fox, D. T.
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166 (2015).
- Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish. Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).
