Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

Published: March 27, 2018 doi: 10.3791/57358
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina
* These authors contributed equally

Summary

רקמות מהונדסים בונה כליות לספק פתרון מצוקת איברים, השפעות מזיקות של דיאליזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מיקרו לנתח הכליות מאתר עבור בידוד של מקטעי מדולרי-cortico. מקטעים אלה מושתלים לתוך המבנים לגרדום ללא הסלולר, ויוצרים organoids כליות.

Abstract

השתלת כליה היא עכשיו טיפול המיינסטרים עבור מחלת כליות סופנית. עם זאת, עם 96,000 אנשים על רשימת המתנה, רק רבע מהחולים הללו להשגת השתלת, יש צורך בחלופות אלה עם כשל איברים איומים. כדי לצמצם את ההשלכות המזיקות של דיאליזה יחד עם עלויות הבריאות הכללית שזה כרוך, פעיל הריקחה בחיפוש אחר פתרונות חלופיים כדי השתלת איברים מושתלת רקמות מהונדסים כליות הסלולר בונה הם אחד גישה אפשרית כזו כדי החלפת בירידה בפונקציונליות כליות. כאן, תיאר בפעם הראשונה, זה microdissection של הכליות מאתר עבור בידוד של חיים corticomedullary מקטעים כליות. מקטעים אלה מסוגלים מהירה לצאר בונה לגרדום ללא אנדותל-פיברובלסט אשר עשוי לאפשר קשר מהיר עם המארח להערכת פעם מושתל. העכבר למבוגרים כליות היו רכש מתורמים חיים, ואחריו סטריאוסקופ microdissection להשיג מקטעי כליות 200-300 מיקרומטר בקוטר. בונה כליות מרובים היו מפוברק באמצעות ראשי מקטעי כליות שנקטפו רק כליה אחת. שיטה זו מדגים תהליך אשר יכול להושיע רקמה תפקודית כליות של איברים אחרת יימחקו.

Introduction

מחלת כליות כרונית (CKD) הוא אחד של הנוכחי מרכזית בבריאות הציבור אתגרים ברחבי העולם1. השכיחות של CKD בארצות הברית היא מעל 14% מכלל האוכלוסייה, עם מעל 600,000 אמריקאים הסובלים הצורה החמורה ביותר, בשלב הסופי מחלת כליות (ESRD)2. הנוכחי טיפול האפשרויות הזמינות עבור אלה עם ESRD כלול דיאליזה, כליות השתלת. למרות כ 25,000 חולים לעבור השתלת כליות מדי שנה, מספר משמעותי של חולים נוספים מדי שנה שמוביל פער גדול בין אלה ממתינים איבר מצילות חיים ואלה השתלת המקבל3. בנוסף השפעותיו השליליות רציני על תוחלת החיים ואת איכות החיים, דיאליזה משויכת נטל פיננסיים מדהימות. בשנת 2014, Medicare תשלום תביעות הסתכם מעל 30 מיליארד דולר עבור חולי ESRD2. עם היצע מוגבל איברים, אין downtrend לכאורה בחולים הזקוקים דיאליזה, מאמצי מחקר שמטרתו זיהוי פתרונות חלופיים דיאליזה, השתלת חשובים אי פעם. אפילו עיכוב קצר יחסית הצורך דיאליזה מגדילה מספר של מטופל שנים מנוכים איכות החיים ופרודוקטיביות באופן משמעותי תוך דחיית עלויות הקשורות דיאליזה-4,-5,-6.

פתרונות עבור אובדן רקמה תפקודית, כמו עם ESRD, נמצאים כיום נחקר ב הנדסת רקמות ומעבדות רפואה רגנרטיבית, עם גישות מגוון נרחב, החל ייצור מבוססי לגרדום תא צורב כל האיבר באמצעות הנדסה decellularized איברים מבנים הסלולר השרשה7,8,9,10,11. Recapitulating מבנים מורכבים כליות מן הכליות גבולית או שנמחקו באופן חלקי בלבד נחקר. למעשה, כמעט 20% של הכליות רכש עבור השתלת מתבטלים עבור סיבות שונות12,13. הרקמה כליות פונקציונלי של שתלי בשם אלה יכול להיות מנוצל, שולבו רקמות מהונדסים בונה אחד או רבים. מחקרים קודמים הראו את הכדאיות של עבודה עם האיברים האלה זרוקים, ניצול הכליות עבור המטריצה הסלולר במיוחד בשביל לרקמות הנדסה למטרות14,15. עם זאת, מעטים השתמשו ראשי nephronal רקמת הכליות בריא עבור הנדסת רקמות למטרות16,17,18.

שיטה אחת שתואר קודם לכן על ידי קים. ואח כרוך בידוד של כליות "מגזרים" מן הכליות, עכבר בריא, אשר היו אז נזרע על פיגומים (PGA) חומצה polyglycolic עבור ייצור לבנות16. עם זאת, מעט מידע ניתנת לגבי המתודולוגיה לנתיחה המדויק, ואת מקטעי התקבלו משילוב של הא בסדר ולסינון. אנו מתארים שינוי של פרוטוקול זה, אשר בדומה מייצרת מקטעי כליות דיסקרטית עם ארכיטקטורה nephronal ללא פגע, אבל במקום זה מסתמך על טכניקות microdissection. Nephrectomies מבוצעות על עכברים בוגרים חיים, אחרי אשר מועברים הכליות המיקרוסקופ ניתוח שבו הקפסולה כליות יוסר, הרקמה הוא גזור עוד יותר. מחטים 30½ G small-bore משמשים כלי חיתוך והיא גם כמו מנחה בסיוע ב לנתיחה, כמו המחט בקוטר שוות לקוטר היעד של המקטעים כליות. המקטעים מבודדות, במקרה זה מאתר, כליות לשמור על יכולת הקיום בתרבות ולשלב עם מבנים הסלולר לגרדום ללא אנדותל-פיברובלסט19. מבנים אלה שימשו בעבר להנדס איברים אחרים, כולל לבלב מלאכותי ביו20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים הניתוחים המתואר להלן היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים להשתמש הוועדה (IACUC)-הרפואה באוניברסיטת דרום קרוליינה לפני ניתוחים בבעלי חיים או שימוש של כל רקמות חיות.

1. מאתר כריתת כליה

  1. דון מסכה רפואית בעלת שיער נפוח כובע כדי למזער את הסיכון של זיהום. לשמור על עקרות במהלך ההקמה של אזור הניתוח.
    1. במקום וילונות כירורגי-fenestrated על שולחן הניתוחים.
    2. פתח את ה-pack של מכשירים בלוק על הווילונות סטרילי. הכלים הדרושים עבור כריתת כליה כוללים 3 ועוצרי דימום קטן, משובח מלקחיים עם השיניים, מלקחיים בסדר בלי שיניים מספריים איריס ישר.
    3. מניחים עוד בד כירורגי-fenestrated במרכז שולחן הניתוחים.
    4. להכין 5 מ"ל של Dulbecco פוספט Buffered מלוחים (DPBS) עם סידן ומגנזיום, בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין צינור חרוטי סטרילי 15-mL. במקום פתרון זה על הקרח ליד שולחן הניתוחים.
  2. להשיג את העכבר C57BL/6 8-12 שבוע (זכר או נקבה) מהמתחם מגורים בעלי חיים.
  3. הנח את העכבר בתוך תא אינדוקציה הרדמה, זירוז עם 3.5% בשאיפה איזופלוריין. במקום קונוס האף על העכבר, באמצעות איזופלוריין 2% עבור תחזוקה הרדמה.
    1. צג לעומק נאותה של הרדמה מעת לעת לאורך כל הליך כירורגי על-ידי הערכת עבור רפלקס פדלים (הבוהן המשרד צביטה).
  4. להסיר את כל השיער הטורסו הגחון באמצעות קרם להסרת שיער. יש לשטוף את האזור הזה עם מים מזוקקים כדי להבטיח שכל השיער הוסר מן הבטן.
  5. להעביר את העכבר לשולחן הניתוחים סטרילי במצב פרקדן תחת הכיסוי ותאבטחי הלא-fenestrated העליון. לגזור אשנוב2 של 2 x 2 ס"מ ב הכיסוי ותאבטחי רק המכסים את הבטן העכבר.
  6. החל povidone יוד ואחריו 70% אתנול בבטן באמצעות כדורים גזה או צמר גפן סטרילי.
  7. באמצעות מלקחיים בסדר עם השיניים איריס מספריים, עושים חתך אנכי בעור בטן 3-4 ס מ מקביל האמצע, 0.5 ס מ משמאל קו האמצע
    הערה: אם מנסה להסיר את הכליה הימנית, זו תהיה חתך 0.5 ס מ בצד ימין של קו האמצע.
    1. לתפוס את הצפק עם מלקחיים בסדר ללא שיניים, תחתכי עם מספריים איריס כדי להזין את חלל הבטן. חלות ועוצרי דימום הקצוות לרוחב לכוחו של העור, צפק למקם את המתח רוחבית ולשפר את החשיפה.
    2. להעביר את תוכן המעי בעדינות הצד הימני של הבטן כדי לחשוף את הכליה השמאלית. מניחים בעדינות המתיחה על הכליה כדי להגביה את זה מתוך הבטן.
    3. במקום עוצר דימום על פני hilum של הכליה השמאלית. להשתמש מספריים איריס transect שופכן וכלי כליות.
    4. למקם את הכליה השמאלית 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין DPBS על הקרח.
    5. העברת הצינור המכיל את הכליה מכסה המנוע תרביות רקמה סטרילי. העבר את הכליה מהצינור חרוט 15-מ ל 60 מ מ פטרי (איור 1). יש לשטוף פעמיים באמצעות 5 מ"ל DPBS עם סידן ומגנזיום. לשמור. על הכליה הושעו ב 5 מ ל DPBS בצלחת 60 מ מ
      1. להכין צלחת פטרי 60 מ מ נוספים 5 מ ל DPBS לשמש במהלך פרוטוקול microdissection.
    6. המתת חסד העכבר על ידי ניקור חזה ו דימום למוות בעקבות הרכש של הכליה, על-פי פרוטוקול מאושר של בעלי חיים IACUC.

2. מאתר כליות Microdissection לבידוד פלח כליות

  1. המשך שימוש סטרילי טכניקה על חלק זה של הפרוטוקול, כולל כפפות סטריליות, מסכה רפואית, ואת שיער נפוח כדי למזער את הסיכון לזיהום.
    1. המקום סטרילי וילונות על פלטפורמת סטריאו מיקרוסקופ כמו גם לגבי אזורים בדיוק עזב ולא זכות של המיקרוסקופ שדה סטרילי עבור מכשירים. במקום יריעות דבק פלסטיק על ידיות המוקד מיקרוסקופ, לרסס עם 70% אתנול. הפעל את אלומת האור מתכווננת כפולה כדי להאיר את הבמה.
    2. פתוח סטיריליים-כלי נגינה (מלקחיים בסדר בלי שיניים, ידית אזמל, להב סכין #15, טוב ישר שני, 30½ שני מד חלול נשא מחטים) על גבי תחבושות חיטוי המקום ה-#15 להב על גבי האזמל לטפל עכשיו וחבר אחד עוצר דימום כל מחט מתאם/רכזת כדי ליצור מחט לנתיחה מכשירים לשימוש מאוחר יותר, כפי שמוצג באיור1.
  2. הזז את צלחות פטרי 60 מ מ, אחד, המכיל את הכליה DPBS, את DPBS רק אחרים, מהשכונה תרביות רקמה לאזור מיקרוסקופ.
    1. מניחים על צלחת פטרי 60 מ מ תחת המטרה, להסיר את המכסה כדי לחשוף את הכליה. להשאיר את המנה המכילות DPBS לצד שדה סטרילי לשימוש מאוחר יותר.
    2. להעביר את המנה כך רק השטח הקדמיים או האחוריים של הכליה היא בתצוגה (קרי, פני השטוח גדול של הכליה, עם הפנים השני נוגע בתחתית של המנה). זום X 3.2-4 על חלק זה של ההליך. בעזרת היד האחרת, להשתמש מלקחיים בסדר ללא שיניים כדי לחדור ולהדק את הכליה נגד המנה ליד הפולנים נחות והסופריור הכליה.
    3. שמור את היד האחרת במקום להפיל. את הכליה. עם היד הדומיננטית, השתמש הלהב #15 כדי להסיר את שכבת שקוף דרכים לבידוד מפני השטח החשוף. לגלח את 0.5 מ מ השטחית ביותר מפני השטח החשוף של הכליה כדי להסיר את השארית של הקפסולה.
    4. השתמש הלהב #15 לנתח פירמידה הפוכה של רקמה מהאזור decapsulated, כ-2 מ מ3 בגודל. לאחזר את המנה 60 מ מ המכיל רק DPBS ומניחים הפירמידה של רקמה לתוך קערה נקייה. למחוק את השארית של הכליה.
    5. הפחתת ההגדלה ל- 1.5-2.0 X למשך שארית הקרע. באמצעות שני מכשירים עוצר דימום-מחט כמו כלי חיתוך, לחתוך לריקמה לחתיכות קטנות יותר בהדרגה עד מקטעי רקמת קטן או שווה לקוטר של העצות המחט. 2 מ מ עובי רקמת הכליה3 בגודל יהיה לייצר יותר מ-50 מקטעי גזור פעם אחת לחלוטין.
    6. להעביר את המנה 60 מ מ עם פלחי כליות למכסה תרביות רקמה. הסר DPBS עם 1000 µL פיפטה. הוסף 5 מ ל DMEM, בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    7. תרבות במשך 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה או שתל לתוך מבנים הסלולר מיד.

3. קטע כליות לבנות הסלולר ייצור

  1. תרבות רגיל האנושית עורי fibroblasts (NHDF), אדיפוז microvascular אנדותל תאים אנושיים (HAMEC) למשך מספר שבועות לקבל 7.2 x 105 fibroblasts ו- 1.8 x 105 תאי אנדותל לכל המבנה הרצוי. בשכונה תרביות רקמה, זרע את היחס המתאים בין fibroblasts לתאי אנדותל (4:1) לתוך בארות בצורת מוט ב agarose בתבניות כדי ליצור מבנים אנדותל-פיברובלסט לגרדום ללא מראש וסקולרית (SPEC) כפי שצוין בעבר שתואר על ידי Czajka ואח 19.
  2. להשיג עוצר דימום סטיריליים 30½ G, ומחט מרית סטרילי עם סוף שטוח.
    1. הסר את הרוב המכריע של התקשורת הצלחת 60 מ מ המכיל מקטעים כליות, נזהר שלא תשאף ולהסיר את מקטעי כליות.
    2. לצייד זכוכיות מגדלת כירורגי להמחיש השרשה המקטעים.
    3. לגרד סוף המרית בעדינות לאורך החלק התחתון של המנה 60 מ מ כדי לקבל 10-15 קטעים, שמתפזר לאורך קצה מאוד המרית. מניחים את קצה המרית קרוב ככל האפשר עד שפתו של הבאר שבו הרכיבים SPEC היה נזרע.
    4. השתמש מכשיר המחט עוצר דימום-30½ G וביד השנייה כדי להזיז כל אחד מהמקטעים בודדים מהקצה מרית לקצה הטוב. בעדינות להזיז כל אחד מהמקטעים לתוך היטב באמצעות קצה המחט עד מעט שקוע ההשעיה הסלולר בעבר הזריעה.
    5. תרבות פלח כליות-SPEC 2:1:1 יחס של FGM-2/EGM-2/DMEM בינוני (נפח 2.5 מ ל סה כ). שינוי תרבות המדיה כל 24 שעות במשך 3 ימים. הסר את בונה מתוך התבניות ב- 72 h לתקן או הקפאה לצורך עיבוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר מייצרת כ 50 מקטעי כליות לפי סעיף3 כפירמידה 2 מ מ של רקמת הכליה. הקטעים כליות מעובד, עם תמונה יש צינורי ורכיבים glomerular בפרופורציות שונות (ראה איור 2). במקטעים ללא פגע היו נענשים assay על מנת לקבוע את הכדאיות של חלקים שונים פעם כל 24 שעות במשך שלושה ימים. ירוק-פלורסנט calcein-אם קיים עם פעילות esterase תאיים, מעידה על תאים חיים. אדום-פלורסנט אתידיום homodimer-1 נתפסת עם הפסד של השלמות של קרום פלזמה. למרות מקטעים אלה הם מבנים שלמים, תלת מימדי, חדירה assay משמעותי הוא ניכר עם מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה איור 3).

מקטעי מאופיינים עוד יותר עבור גודל האחידות באמצעות וזמינותו הכדאיות באותו תא. באמצעות שקופיות זכוכית עם דיכאון, מקטעי הונחו תחת מחסה גולשת ללא שימוש בכוח מכני, מניחים על כל מימד של המקטעים. חינם צף, הקטעים היו שבעורך 30 דקות אחרי השמתם וזמינותו הכדאיות/הרעלה של התא. Z-תחזית עם גודל שלב 10-מיקרומטר נלקח דרך כל הקטע. הגדול 'X' ו- 'Y' מידות היו שהושג והקליט. הממד "Z" היה מתקבל על ידי חישוב המרחק בין הראשון ועד לאחרון fluorophore גלויה. בהתחשב בכך פלחי הינם קוב בערך, מדידה אחסון מעוקב פשוט היה מתקבל, להתוות להשוות בין מקטעי שנבחרו באקראי 10 מהניסוי microdissection אחד. המטרה נפח (300 מיקרומטר)3 = 0.027 מ מ3 מוצג עם סימון אדום על ההיסטוגרמה (איור 4). מדידות נציג 'X' ו- 'Y' מוצגים באיור 4B. למרות שיש ליניאריים, ישנם פלחים קרוב האחסון היעד. חזור על ניסויים הראו תוצאות עקביות (n = 20). המדידות raw (לא מוצג כאן) מראים כי ברוב המכריע של מקטעים, יש ממד אחד לפחות מדידה מיקרומטר 200-300. יש לזה השלכות חשובות על מגבלות דיפוזיה.

הקטעים כליות נעוץ לגרדום ללא אנדותל-פיברובלסט בונה, תרבותי במשך 3 ימים. המקטעים כליות לשלב עם המבנה הסלולר מבנים שלמים טופס על-ידי יום 3 (ראה איור 5א). המבנה לשמור על הרשת אנדותל טרום כלי הדם שלהם, המוצגת על-ידי תיוג עם פון Willebrand פקטור (איור 5E). עם זאת, לא נראה כי הרשת חודר החומר הסלולר כליות. תאים אפיתל כליות מסומנות עם Cytokeratin-18 (איור 5B, ירוק). מבנים אלו היו מודגרות עם התווית על-ידי FITC אלבומין (איור 5C, אפור) על מנת לבדוק במבחנה הפונקציונליות כליות. אמנם יש שיורית אלבומין נמצא רחוק מקטעי רקמת הכליה מוטבע, ישנם "נקודות חמות" באזור של כליות צינורי בתאי אפיתל, לאלה. תופסים אלבומין בתוך אינטרה-luminally. זה נחשב לייצוג אלבומין ספיגה חוזרת של הבונה הסלולר פלח כליות.

Figure 1
איור 1 : נציג תצלומים של כריתת כליה וכליות קטע Microdissection. כליה מאתר זה הוסר, שטף, מניחים בקערה 60 מ מ, ועברו לשלב מיקרוסקופ סטריאוסקופ. הקוטר של קצה המחט משמש מדריך לנתיחה. ועוצרי דימום מחוברים מחט טיפים הכלים לנתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : פלח כליות Microdissected. הקטעים כליות microdissected מכילים הפרופורציות משתנות של glomeruli (בפינה השמאלית התחתונה, מבנה basophilic), בקוריאנית (השארית של התמונה) בעיבוד מקורי שלהם. התמונה X 10, בר בהיקף כמצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : פלח כליות הכדאיות. הקטעים כליות microdissected מכילים חלקים של רקמה חיה ומתה. בעיקר, מקטעי החיים הינם להישאר כך גם התרבות ב ה 72 הערה מקטעים שונים שימשו את נקודות זמן שונות, כפי וזמינותו הכדאיות עצמו רעיל לתאים. תמונות X 10, סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : פלח כליות נפח אחידות. (א) קטע נפח מעוקב מ מ3 מהניסוי ניתוח אחד (n = 10). מקטעים בודדים מיוצגים על ידי כחול נקודות, לעומת נקודת היעד אדום (היעד נפח 0.027 מ מ3). (B) נציג X ו- Y ממד מידות וזמינותו חי-מת, התמונה X 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : רקמות מהונדסים לגרדום ללא כליות קטע לבנות. (א) ממוזג תמונת מראה שהשתלבה מקטעי כליות Cytokeratin (B) ואסתטיקה-18-חיוביות כליות צינורי בתאי אפיתל (ירוק). (ג) התווית על-ידי FITC אלבומין. (ד) Hoescht הכתם עבור גרעינים. (ה) Willebrand פון פקטור (vWF) חיוביות סימון הרשת prevascular. 10 X תמונות, סולם בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות השתמשו כדי להנדס הרקמות כליות מבנים קיימים הבדלים באשר הן סוג של תאים, biomaterials מנוצל, במקרים רבים, הם מיושנים או לא מאופיין היטב הספרות7. בעוד רבים משתמשים בתאי גזע גישות או recapitulating רכיבים בודדים של האדריכלות כליות בבידוד, זה הסיכוי באופן מלאכותי יצירה מחדש של איבר שלם עם סוגי התאים הבדיל 26 מ מ המתלים הסלולר מהמם לשקול21. זה כנראה למה אחרים עברו להתגורר גישות באמצעות מקטעי רקמת הכליה ברקמת יישומי הנדסה. כמתואר לעיל, העבודה הקודמת נעשתה בבידוד של קטעים כליות זריעה על פיגומים PGA16. אולם, המתודולוגיה המשמש לתיאור בידודו של מקטעי תוארה בפירוט הקטן, הקטעים היו לא תרבותי עבור כל פרק זמן כדי להעריך עבור הכדאיות. השיטה המתוארת כאן, לצד השימוש הכדאיות הסלולר וזמינותו, מראה כי לכל הפחות, שמירה חלקים של המקטעים כליות הכדאיות לסימן 72-h, אשר לא תואר קודם. השיטה גם יש את היתרון של הפקת מקטעים עם ממדים צפוי למדי. בנוסף, שיטות אלה מספקים גישה קלינית לתרגום משלים כשל תפקוד הכליות, בעיקר הממחיש שיטה ריאלי עבור בידוד של מקטעי רקמת הכליה העיקרי של איברים אחרת יימחקו.

בפיתוח השיטה, האתגרים הגדולים ביותר היו, ראשית, זיהוי אובייקט סטרילי של גודל המתאים, וכן שנייה, שמירה על עקרות כפי ההליך מעורב צעדים רבים מחוץ למכסה התרבות תאים. עצות מחט 30½ G הוכיחה להיות המדידה שימושיים, כמו גם התקנים לנתיחה. עקרות היה אתגר בראשית שנות ניסויים, שמרביתם קשורים פרווה מאתר השליטה הקמה כירורגי.

מגבלות של ההליך קשורים הטבע תלת מימדי של מקטעי רקמת הכליה. בתצוגה אחת מתחת למיקרוסקופ, הממדים של המקטע עשוי להיראות להיות בערך בגודל של קוטר מחט, 0.260 מ מ. עם זאת, Z-הממד אינה מוצגת בצד סטריאוסקופ. Microdissection נעשית בעבודת יד, אשר עצמו היא מגבלה אחרת. בעתיד, סטנדרטיזציה רובוטית יהיה אידיאלי. אם 2 מ מ3 כפירמידה החלק של רקמת הכליה נשמר לכיוון הנכון במהלך ניתוח, לנתח את nephrons שלם לא היה בלתי נתפס. לבסוף, השוואה בין אלה בונה על הלבלב המלאכותי ביו, איון אילו תאים היו מוטבעים בהרכיבים SPEC, אחד חייבים להכיר הבדלים20. הכליה היא יופי של ארכיטקטונית ייחודית מן הלבלב ניתן לטעון מורכבים יותר. בנוסף, תאי איון הם סוג אחד בלבד של תא פונקציונלי בתוך הלבלב, בניגוד קונצרן פונקציונלי תאים מבודדים עם פלחי כליות בשיטה זו. אדריכלות, במיוחד כיוון משחק תפקיד כזה גדול בפונקציה של הכליה, במיוחד סינון, חוסר התמצאות אחיד המקטעים בתוך הבונה היא חולשה נוספת של מתודולוגיה זו.

מחקר שוטף מכוונת הערכה של פלח כליות ופונקציונליות לבנות כליות, להבהיר את המידה שבה מתרחשת תפיסה אלבומין ולהעריך פונקציות אחרות של הכליות. ניסויים בבעלי חיים עתידיים מערבת ההשתלה של המבנה כליות בדופן השלפוחית. הטבעה הבונה במבנה הגוף מאוד כלי דם זה לאפשר השקה מהירה וכן ולייתר את מערכת איסוף, עם פילטרט של מפריש ישירות לתוך שלפוחית השתן. בהתחשב בעובדה במבחנה הפונקציונליות של רקמות הכליה היא מוגבלת מאוד, אין ויוו בדיקות היא חיונית. הבדיקות היחידה במבחנה כעת דיווחו בספרות הם התרכזו סביב אלבומין ספיגת ו אריתרופויאטין ביטוי17,22. מקטעים אלה חיים של רקמת הכליה שלם בארכיטקטורה מקורית שלו נעוץ בונה עם רשתות אנדותל פרימיטיבי, אשר אינם מסתמכים על כל biomaterials זרים, מבטיחים להעביר לקראת החלפת רקמות כליות פונקציונלי, מסתיימים .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מענק הכשרה פוסט-דוקטורט מוסדיים-NIH, NIH-HL-007260

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-fenestrated Sterile Field Busse Hospital Disposables 696
Fenestrated Sterile Field Busse Hospital Disposables 697
Halsted Mosquito Forceps 5 Curved Miltex Mil-7-4 "Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth Fine Science Tools 11155-10 Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) Fine Science Tools 11152-10 Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09 Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% Purdue Products L.P. 67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") Fisher Healthcare 22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered Solution Corning 21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-Cl
Isoflurane, USP Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson 2254845
Nair Hair Remover Nair 22600-23307 Hair Removal Cream in text
200 Proof Ethanol Decon Laboratories 2705 Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture Dish Themo-Scientific 130181
Press'n Seal Glad 12587-70441 Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX16
Fiber Optic Illuminator Cole Parmer 41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck Cole Parmer EW-41720-60
Scalpel Handle #3 Miltex Mil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 Bard-Parker 371115
31 1/2 Gauge Needle ThermoFisher Scientific 14-826F Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine Serum Atlas Biologicals FS-0500-AD
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza CC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells Sciencell Research Laboratories 7200
Surgical Loupes (2.5x) Orascoptic (N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) Lonza CC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) Lonza CC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells ThermoFisher Scientific L3224
Anti-Cytokeratin-18 Antibody Abcam ab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 ThermoFisher Scientific A-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher Scientific A-11010
Anti-Von Willebrand Factor Antibody Abcam ab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate Sigma Aldrich A9771-50MG
Hoescht 33342 BD Pharmingen 561908
Background Buster Innovex Biosciences NB306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
  2. 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
  3. Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).
  4. de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
  5. Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
  6. Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
  7. Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).
  8. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  9. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  10. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
  11. Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
  12. Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
  13. Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
  14. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  15. Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
  16. Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
  17. Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
  18. Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
  19. Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
  20. Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
  21. Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
  22. Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 133 Microdissection כליות רקמות מהונדסים לבנות לבנות כליות לגרדום ללא רקמות רקמת כליה ראשוני הנדסה
Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arbra, C. A., Nadig, S. N., Dennis,… More

Arbra, C. A., Nadig, S. N., Dennis, S. G., Pattanaik, S., Bainbridge, H. A., Rhett, J. M., Fann, S. A., Atkinson, C., Yost, M. J. Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology. J. Vis. Exp. (133), e57358, doi:10.3791/57358 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter