Summary
여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.
Abstract
캘리포니아2 + 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca2 + 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아2 + cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.
여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아2 + 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아2 + 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.
Introduction
캘리포니아2 + cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아2 + 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca2 + 코드4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독 . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인6,의 출시와 관련 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 7.
이질균, 세균성이 질의 원인이 되는 에이전트 유형 III 분 비 체계 (T3SS)8,9를 사용 하 여 호스트 셀에 이펙터를 주입 하 여 상피 세포를 침입 한다. Shigella 침공 호스트 세포의 지역 및 글로벌 Ca2 + 신호는 T3SS에 의해 elicited와 연결 됩니다. 기 공 형성에 관해서는 독 소, 호스트 세포 막에 삽입 하 고이 필요 T3SS 이펙터의 주입은 T3SS translocon PLC 및 이노 시 톨 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)의 활성화에 대 한 책임-종속 Ca2 + 릴리즈입니다. 지역화 된 PLC 자극과 생산 말라는 예외적인 오랫동안 InsP3 종속 Ca2 + Shigella 침공 결과의 사이트에서의 축적의 조합10을릴리스 합니다. 유형 III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2)-4-인산 가수분해 효소, 제한 지역 PIP2, 로컬 Ca2 + 의 감 금에 기여 하는 InsP3를 생성 하는 PLC에 대 한 사용 가능한 기판의 수량을 제어 함으로써 세균성 내 습 사이트11,12에 응답 합니다. 이러한 로컬 Ca2 + 응답 가능성이 Shigella 침공 사이트10걸 중 합에 기여 한다. 그러나 이질균에 의해, elicited 또한 글로벌 캘리포니아2 + 응답 세균성 내 습 프로세스에 불가결 하지만 플라즈마 막에서 connexin hemichannels의 열고는 세포 외에서 ATP의 릴리스 트리거 구획입니다. 출시 된 ATP paracrine 방식으로 행동, 캘리포니아2 + 진동 응답 감염된 셀 옆 셀에 자극. IpgD 글로벌 Ca2 + 응답을 형성 하는 느린 역학과 엉뚱한 고립 된 응답에 대 한 책임 이기도 합니다. 결국, 장기간된 세균 감염 시 IpgD InsP3 중재 Ca2 + 신호 억제에 지도 한다. 캘리포니아2 + 신호는 간섭를 통해 IpgD 지연 캘리포니아2 +-종속 calpain 활성화 초점 접착 구조의 해체와 조기 분리로 이어지는 셀13감염.
캘리포니아2 + 신호 병의 중요 한 측면에 관련 된, 하는 동안 미생물의 사용 다양을 한 클래식 주 작동 근 연구에서 발생 하지 않는 기술적인 문제를 발생 시킵니다. 프로토콜 설명 여기는 일반적으로 사용 되 형광 캘리포니아2 + 화학 표시기 Fluo-4 우리 Shigella 감염 시 로컬 Ca2 + 신호 특성 설계를 사용 합니다. 이러한 신호 검출을 위한 중요 한 단계는 캘리포니아2 + 신호에 세균성 이펙터의 역할을 특성화 하는 데 필요한 그들의 정량 분석에 대 한 구현 절차 뿐만 아니라 설명 합니다.
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Protocol
1입니다. 준비
-
박테리아 준비
- 박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어
참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문에, 1 주일 이내 사용 해야 합니다. - 조 흔 격판덮개에서 3 빨간 식민지를 수확 하 여 TCS 국물 사전 문화를 예방.
참고: 3 식민지와 접종 누구의 독성 플라스 미드 유전자 재결합을 겪고 있다 단일 클론 선택의 가능성을 제한 하 수행 됩니다. - 200 rpm에서 37 ° C에서 16 h 떨고 인큐베이터에서 액체 세균성 문화를 성장. 75 mg/mL의 최종 농도에 암 피 실린을 추가 합니다. 으로 항생제의 과잉 큰 독성 플라스 미드의 손실로 이어질 수 있습니다 항생제 농도가 최소 억제 농도, x 3를 넘지 말아야 한다.
참고: Shigella 독성 플라스 미드의 유지 보수는 도금 크롬 플레이트 적절 한 항생제 농도와 보완에 세균성 문화에 의해 확인 되어야 한다. 백색 식민지의 플라스 미드 손실을 나타냅니다. - TCS 문화 1: 100 희석에 세균성 사전 문화를 예방 200 rpm에서 2 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 그것을 품 어. 600에서 광학 밀도 확인 nm (OD600nm)는 0.2-0.4.
- 21 ° C에서 13000 x g에서 2 분 동안 세균성 문화를 원심 및 EM 매체 (120 mM NaCl, KCl 7mm, 1.8 m m CaCl2, 0.8 m m MgCl2, 5 mM 포도 당, 및 25 mM HEPES의 해당 볼륨에서 펠 릿 resuspend pH 7.3 =).
- 0.1의 최종 OD600nm 에서 EM 버퍼에 세균 현 탁 액을 희석 하 고 즉시 그것을 사용 하 여 또는 21 ° C에 저장 그것을 사용 하 여 다음 60 분 이내.
- 박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어
-
세포 준비
- 1 g/l 포도 당의 DMEM에 문화 HeLa 세포 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 보충 10% CO2와 37 ° C에서 그들을 성장 하 고. TC-7 포도 당의 4.5 g/L와 DMEM 성장 10 %FCS 및 비 본질적인 아미노산 10% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 포함 된 성장.
- 셀에 대 한 유지 보수, 성장 접촉 저해를 방지 하려면 정기적으로 셀 분할 confluent 상태로; 연결 이것은 높은 캘리포니아2 + 프로브 로딩/transfection 효율을 중요 합니다.
- 6 잘 플레이트 3 x 105 셀/잘 HeLa 세포에 대 한 실험 전날의 조밀도에 있는 살 균 25 m m 직경 원형 coverslips에 HeLa 세포를 플레이트.
- TC-7 셀, trypsinize 및 셀. 에 4 × 105 셀/잘 씨 및 그들에 품 10% CO2에서 37 ° C에서 5-7 일 어-인큐베이터는 극성이 있도록 실험 하기 전에.
- 세포 배양 실험의 날까지 매일 새로 고칩니다.
참고: 유리 하단 35 m m 직경 일회용 챔버 또한 포함 하는 coverslips 웰 스 하는 대신 사용할 수 있습니다. 후자는 사용, 열띤된 무대를 통해 온도 제어 또는 목표는 충분 한, 그리고 온도 인큐베이션 챔버에 장착 된 현미경 단계가 필요 합니다.
- 세포 배양 실험의 날까지 매일 새로 고칩니다.
- 실험의 주 매체를 제거 하 고 세척 3 셀 x 21 ° c.에 1 mL 안에 매체와
- 로드 3 m Fluo-4-오전14 21 ° c.에 30 분 안에 버퍼에 셀
참고: 하위 confluent HeLa 세포의 로드는 주요 문제를 발생 하지 않습니다, 하는 동안 편광된 TC 7 셀의 로드 자주 이기종 고 가난 하 게 효율적입니다. 이 셀에 대 한 우리가 로드 효율 분산 에이전트의 추가 의해 향상 됩니다 발견-pluronic 산-0.1%의와 20 µ M에의 최종 농도에서 음이온 운송업 자 억제 물 bromosulfophtalein의 최종 농도에 Fluo-4-오전-포함 된 Em입니다. 화학 비율을 사용 하 여 프로브 또는 유전자 인코딩-무서 워 프로브 필요한 듀얼 수집 수집 로컬 Ca2 + 응답의 이미징에 필요한 속도와 호환 되지 않습니다. - 워시 샘플 3 x EM와 버퍼 그리고 추가 EM buffer 오전 moiety의 가수분해 수 있도록 21 ° C의 1 mL에 그들을 품 어. 즉시 또는 다음 90 분 (21 ° C에서 유지 하는) 내 사용 Fluo-4 셀 로드.
2. 감염 및 로컬 Ca2 + 응답의 이미지 수집
- 이미징 챔버 또는 유리 하단 챔버 Fluo-4 로드 셀을 포함 하는 coverslip을 놓습니다. 영상 실에서 샘플을 세척 또는 유리 하단 일회용 챔버 EM 버퍼 잠재적으로 셀 세포에서 발생 하는 화합물을 제거 하는 3 배. 안에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- 장소는 거꾸로 형광 현미경 스테이지 챔버 33 ° c.에가 열
참고:이 온도 로컬 응답을 시각화 하기 위해 Shigella 침공 프로세스와 호환 최적의 온도 Ca2 + 응답의 둔화 사이 타협으로 선택 됩니다. 우리가 침수 기름 목표 X 63을 사용 하 여 (NA = 1.25) 단계 대조 고리를 장착. - 현미경 필드를 선택 하 고 설정 수집 매개 변수를 포함 하 여 노출 시간 및 binning Fluo-4 형광 신호를 최적화 하기 위해 필요한 경우.
참고: 로컬 Ca2 + 이미징의 주요 과제는 낮은 진폭 및 응답의 작은 기간 요구 수집 30 매 양 여러 상용 백 조명 EM CCD 또는 C-MOS 카메라 제시 필수 로컬 Ca2 + 응답 Fluo-4를 사용 하 여 검색에 감도. 검출 감도 photodamage 또는 높은 주파수에서 Fluo-4의 형광 여기에 연결 하는 자발적인 응답 같은 유물을 제한 하는 중요 한 문제 이기도 합니다. 여기, 470의 LED 기반 조명 nm, 480 ± 40 nm 대역 통과 여기 필터, 505 nm dichroic 필터와는 527 ± 30 nm 대역 통과 방출 1.0 중립 밀도 필터를 함께 최대 강도의 5%에서 사용 되는 이러한 문제를 최소화 하기 위해 사용 되었다 아래 제한 기간의 취득의 스트림입니다. 로컬 Ca2 + 120 s 스트림의 배치 하 여 신호 분석을 정기적으로 수행 되었다. 이러한 낮은 조명 조건에서 fluorophore photobleaching 하지 2 분-스트림 인수 동안 관찰 되었다. 다양 한 분야에 사용 됩니다 제공에 같은 샘플에 연속 인수를 수행할 수 있습니다. 일반적으로 첫 번째 인수 스트림 자발적인 응답의 부재를 보장 하기 위해 박테리아 자극의 부재에서 컨트롤 필드에서 수행 됩니다. 자발적인 응답을 관찰 하는 경우 응답 없음은 관찰 될 때까지 샘플 EM 버퍼와 세척 된다. - 박테리아 샘플을 추가 하려면 상공에서 EM 버퍼의 500 µ L을 제거 하 고 500 µ L 세균 현 탁 액 0.05, 선택한 현미경 분야; 이동 되지 않도록 적절 한 주의 함께 마지막 세600nm 를 단계 1.1.6에서에서 준비의 추가 볼륨은 박테리아와 세포 샘플에 박테리아의 균질 배급의 적당 한 혼합을 확인 합니다.
- 세균 이외에는 수집을 수행 합니다. 또는 인수 10 분 사용 조건 하에서 세포에 앙금을 박테리아에 필요한 시간에 해당 세균 또한 다음을 수행 합니다. 인수 스트림의 끝에 박테리아는 세포 막 주름 세균성 내 습 사이트와 관련 된 문의 시각화 하기 위해 선택된 된 필드의 위상 대조 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 인수, 파일 절감 및 전체 프로세스를 커버 하는 새로운 필드의 선택의 기간에 받을 간격 2.5, 단계와 인수 절차를 반복 합니다.
참고: 이질균, 우리 발견 수집 20 분, 5 분 마다 스트림 10 분 세균 침전, 침공 이벤트의 대부분을 커버 수 다음. - 인수 절차의 끝에, 캘리포니아2 + ionophore ionomycin 샘플의 Ca2 + 신호의 최대 진폭을 결정 하는 2 µ M의 최종 농도 추가 합니다. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s.
- 캘리포니아2 +의 부재에서 형광 신호를 확인 하기 위해 10 mM의 최종 농도에 캘리포니아2 + chelator EGTA를 추가 하 여 따라. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s.
참고: 글로벌 Ca2 + 유사의 상대적으로 느린 역학, 때문에 수행이 인수 (안에, 스트리밍 모드), 캘리포니아2 + 연속 치료 동안 같은 미세한 필드에 이미지에 대 한 수 있도록 모든 3-5 s.
3입니다. 분석
- 같은 투자 수익에 기준 형광 δ/F0, δ의 관심 (ROI)의 지역 평균 형광 강도의 변화를 나타냅니다 및 F0 의 비율으로 시간이 지남에 cytosolic 캘리포니아2 + 유사 익스프레스는 셀 없는 분야의 관련 없는 영역을 뺍니다.
- 해당 기준선 수준; 하 다양 한 분야에 각 셀에 대 한 기저 형광 수준 제거 이러한 수준 낮은 주파수 때문에 명확 하 게 결정 될 수 있다 고 상대적으로 짧은 기간 주어진된 스트림 수집에 로컬 Ca2 + 반응의.
참고: 계량 응답 질문에 관련 된 공부 하는 병원 성 모델의 눈에 띄는 기능. 고아 하 게, 다양 한 매개 변수는 고려 캘리포니아2 + 신호, 로컬 또는 전역 Ca2 + 응답으로 기간, 진폭, 및 이러한 응답의 빈도 보여주는 셀의 주파수를 포함 분석 하. 이질균 및 현지 응답, 분석의 다른 중요 한 측면 세균성 내 습 사이트와 응답의 공간 협회입니다.
- 해당 기준선 수준; 하 다양 한 분야에 각 셀에 대 한 기저 형광 수준 제거 이러한 수준 낮은 주파수 때문에 명확 하 게 결정 될 수 있다 고 상대적으로 짧은 기간 주어진된 스트림 수집에 로컬 Ca2 + 반응의.
- 전역 또는 로컬 응답을 보여주는 반응 세포의 비율, 척도를 그릴 ROIs 셀, 시계열 Fluo-4 강도의 변화에 해당.
- 가양성을 득점 하지 않으려면 로컬 Ca2 + 응답, 평균 형광 강도 셀 기준의 3 배 위의 배경 유사 또는 기간 적어도 200 ms의 진폭 등을 식별 하는 엄격한 매개 변수를 설정 합니다.
참고: 일반적으로 작은 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 어떤 배경 잡음에서 그들의 프로필. ROIs 지역 변이의 탐지에 대 한 허용 하도록 충분 한 형광 신호를 통합 하기에 충분 해야 합니다. Fluo-4 검출의 강도 따라 이러한 ROIs 2-5 m m에서 배열 하는 직경을 가진 원형에 해당할 수 있습니다. - 로컬 또는 글로벌 응답 인지 확인 하기 위해 동일한 셀의 고유 영역에 2 지역에서 평균 Fluo-4 형광 강도의 변화를 측정 합니다.
참고: 셀의 다 수의 분석 이미징 선택된 영역에 대 한 시간별 평균 형광 강도의 변이의 온라인 스크린 디스플레이 허용 하는 소프트웨어의 사용에 의해 촉진 된다. 상용 이미징 소프트웨어는 같은 옵션, 하지만이 또한 수행할 수 있습니다 투자 수익 강도 진화 플러그인을 사용 하 여 얼음 프리웨어를 사용 하 여. - 로컬 응답을 보여주는 셀의 비율을 결정 합니다.
참고:이 비율을 지원 하기 위해 충분 한 숫자에 있어야 현미경 분야에서 분석 하는 셀의 총 수에서 계산 되는 통계적으로 의미는 비-파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여. - 로컬 응답의 기간을 결정 합니다.
참고: 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 더 그들의 기간 범위에 따라 (즉, 5, 10 s 사이 또는 10 위, 500 밀리초 보다 작아야 s) Shigella 침공 사이트와 함께 그들의 협회.
- 가양성을 득점 하지 않으려면 로컬 Ca2 + 응답, 평균 형광 강도 셀 기준의 3 배 위의 배경 유사 또는 기간 적어도 200 ms의 진폭 등을 식별 하는 엄격한 매개 변수를 설정 합니다.
- 응답의 진폭을 수량화 합니다. 첫째, 최대 캘리포니아2 + 및 셀 배경 수준 단계 2.1.7에서 결정 보정. Fluo-4 부하 각 셀에 대 한 다를 수 있습니다 이후 필드에 개별 셀에 대 한 이러한 결정을 수행 합니다.
- 최대 응답의 상대적 비율로 응답의 진폭을 표현 한다.
- 통계 뒤에 잠재적인 차이 응답의 진폭에 샘플을 분석 하는 파라메트릭 테스트 정상 테스트를 사용 하 여 테스트를 수행 합니다.
- 시각 이미지는 해당 단계에서 세균을 이용한 막 주름을 각각 그들의 지 방화에 의해 세균성 내 습 사이트를 기준으로 이러한 반응의 협회를 확인 합니다.
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Representative Results
Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca2 + 응답:
위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca2 + 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 Fluo-4 프로브의 형광 강도의 시간 경과 이미지 시리즈 그림 1에 표시 됩니다. 패널)입니다. Shigella 침공 사이트 막 주름 위상 대비 이미지 (그림 1A, 화살표)에서 발견에 의해 특징입니다. 비정형 로컬 무료 cytosolic 캘리포니아2 + 는 다양 한 진폭과 2.5-5 s (그림 1A 및 1B, 화살표), 글로벌 증가 감염에 의해 뒤에서 배열 하는 기간 Shigella 침공 사이트에서 관찰 증가 셀 (그림 1B, 화살촉)입니다.
유형 III 이펙터 IpgD 조절 Shigella HeLa 세포에 의해 유도 된 세계적인 캘리포니아2 + 응답을 로컬에서 전환:
III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate 인산 가수분해 효소,이 후자의 긴장 더 글로벌 및 유도 표시 야생-타입 Shigella 와 형식에 대 한 isogenic 돌연변이 스트레인 결핍에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 11.3 ± 4.4 (SEM)와 긴 기간 (RATPs)와 비정형 로컬 응답 %, 40.3 ± 7.5 (SEM) 세포 WT와 ipgD 돌연변이, 각각 (그림 1D)15의 경우 글로벌 응답 반응의 %. 이 ipgD 돌연변이 WT 긴장으로 유사한 주파수에 현지 응답을 가져옵니다.
Shigella InsP3 종속 글로벌 캘리포니아2 + 장기간된 감염 활동 동안 HeLa 세포에서 증가 억제:
글로벌 캘리포니아2 + 확장된 감염 활동에 응답의 영상 응답 다음 야생-타입 이질균 (그림 2A)와 도전 하는 30 분의 주파수에 있는 감소를 지적 했다. Ca2 + 응답의 주파수에 있는 유사한 감소 야생-타입 Shigella1530 분 동안 감염 된 TC 7 셀에서 관찰 되었다. 캘리포니아2 + 주 작동 근 히 스타 민에 대 한 복용량 종속 셀 응답의 정량화 Shigella 감염의 늦은 단계에서 InsP3 종속 Ca2 + 릴리스의 억제를 보여 줍니다. WT Shigella 감염의 고 추가 잠복기, 진폭 및 주파수 캘리포니아2 + 응답의 급격 한 감소 (그림 2B)를 관찰 되었다 후 첫 30 분 동안 불규칙 고립 된 Ca2 + 응답에 지도 한다.
그림 1 . 로컬 및 전역 Ca2 + 응답 Shigella 침략. 헬러 세포 Fluo-4-오전 로드 되었고 WT Shigella도전. (A) 왼쪽된 패널 쇼 단계 대조 이미지. 오른쪽 패널 오른쪽에 그려진 컬러 코드 Fluo-4 형광 평균 농도의 시계열을 보여줍니다. 수집의 시작에서 시간 초, 세균성 도전 후 10 분에에서 표시 됩니다. 화살표 침공 foci 나타냅니다. 동그라미 그려져 어디 해당 색상으로 추적 대표 변이 Fluo-4 평균 형광 강도에서 기준선 이상 (B)에서 분석 하는 영역에 해당 합니다. 화살표는 로컬 응답을 나타냅니다. 화살촉 글로벌 응답을 나타냅니다. (C) Ca2 + 응답의 기간 결정을 묘사 하는 체계입니다. 수평 점선 나타냅니다 기저 Ca2 + 레벨 (0F); 세로 막대 배경 변화를 나타냅니다. 수직 점선; 응답의 최대 진폭을 나타냅니다. 수평 막대 절반 최대 진폭에서 결정 하는 반응의 기간을 나타냅니다. (D)이 로컬 응답을 보여주는 반응 셀 ± SEM의 백분율 이며 글로벌 캘리포니아2 + 응답 WT 이질균 (어두운 회색 막대) 또는 ipgD 돌연변이 (밝은 회색 바) 5 분 후 감염을 유발. RATPs은 로컬 Ca2 + 응답 마지막에 5 개 이상 s. N = 4; > 각 시간에 대 한 60 셀입니다. Wilcoxon 테스트 *P < 0.05; P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Shigella 감염의 확장된 활동 동안 글로벌 캘리포니아2 + 응답의 억제. (A) 위 파란색 화살표 표시 된 농도에서 박테리아 및 히 스타 민 도전의 시간 규모를 나타냅니다. 이 패널 표시 단일 셀의 대표적인 흔적 글로벌 캘리포니아2 + 유사 WT 이질균 (녹색)에 의해 감염 다음 와 ipgD 돌연변이 스트레인 (주황색). (B)이이 패널은 90 분 동안 표시 된 긴장으로 감염 된 세포의 0.5 μ M 히 스타 민에 자극에 최대한 응답 상대적인 캘리포니아2 + 응답의 진폭의 비율을 보여줍니다. 단단한 가로 막대는 평균 최대 비율을 나타냅니다. Wilcoxon 테스트 * *P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca2 + 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca2 + 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아2 + 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.
화학 대 유전자에 캘리포니아2 + 프로브 인코딩:
로컬 Ca2 + 유사 이미지, 우리는 그것의 높은 양자 수율 및 그것의 빠른 응답 역학 Fluo-4 화학 프로브를 사용 합니다. 듀얼 파장 수집을 수행할 수 없습니다 이후 인수에 필요한 속도 또한 비율 프로브를 사용 하 여를 걸로 하겠습니다. 그러나 병원 성 미생물의 사용, 캘리포니아2 + 화학 프로브를 사용 하 여 표준 절차 방해 수 있습니다. 예를 들어 장기 세포 감염 Shigella 여 60 분 이상 호스트 세포 플라즈마 막의 병원 체 유도 된 변경 때문에 아마도 화학 프로브, 로드 셀 수 없습니다. 일관 되 게, Fluo-4 형광 세포 관련의 감소는이 프로브의 세포질 손실로 인해 긴 감염 활동 동안 관찰 됩니다. 따라서, ionomycin 인수의 끝에 최대 캘리포니아2 + 농도에 형광을 확인 하기 위해 추가 같은 컨트롤을 구현이 반응 셀을 식별 중요 합니다. 또한, 편광된 장 상피 세포는 병원 체 감염에 대 한 관련 Ca2 + 프로브 로딩 내 화물 고 특정 선적 절차를 필요로 나타납니다. 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자 (GECR)를 사용 하 여 이러한 문제를 해결 하려면 도움이 될 수 있지만, 그것은 또한 다른 과제를 소개 합니다. 특히 가난한 감염 수익률 superimposes 경우 호스트 셀 시스템에서 transfection 효율 심각한 한계를 나타낼 수 있습니다. 또한, 대부분 GECRs의 캘리포니아2 + 변화에 응답의 특성 로컬 Ca2 + 분석에 필요한 빠른 속도와 호환 되지 않습니다. 마지막으로,는 GECR의 표현 병원 체 중재 프로세스를 방해할 수 있습니다. 우리 연구의 캘리포니아2 + 호스트 병원 체 상호 작용 하는 동안 신호에 대 한 GECR 사용 하 여를 설명 하지 것 이다. 다양 한 "빠른 응답" GECR의 최근 및가 공학 것 아마 연구원을 되짚어 미래의 연구에 그들의 사용을 받을 자격이.
세균 감염 시 로컬 Ca2 + 응답의 수집 타이밍:
로컬 Ca2 + 응답의 영상 이미지 수집 Fluo-4 프로브의 지속적인된 형광 여기 연루의 높은 속도가 필요 합니다. 높은-주파수 획득에 연결 photodamage에 때문에 그것은 중요 fluorophore 여기 빛의 강도 30 양 우리를 초과 하지 않는 노출 시간 충분 한 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 필요한 최소 유지 됩니다. 최대한의 강도의 5%에 LED 시스템을 사용 하 여 좋은 결과 수집 설정 단계 2.1.4에서에서 설명한 대로 1.0 광학 밀도 필터와 결합. 그러나 이러한 조건 에서도, 우리는 발견 스트림 모드 인수에 필요한 지속적인 조명 수집 기간 2 분 이상 허용 하지 않았다. 이 제한을 초과 하는 인수 기간 또는 강한 조명 일반적인 글로벌 캘리포니아2 + 응답 또는 아마도 photodamage에 연결 된 세균성 내 습 과정의 억제에서 발생할 수 있습니다. 동안 더 이상 활동을 통해 지역 캘리포니아2 + 응답의 영상 같은 영상만 15 분 Shigella 침공 과정의 한정 된 시간 일부를 통해 수행할 수 있습니다 현재 상태에서 더 민감한 탐지 방법으로 수 있습니다. 전체 과정을 충당 하기 위해 우리는 2 분 스트리밍 취득의 연속 시리즈 수행. 이 시간 간격 초기 로컬 및 글로벌 Ca2 + 응답 감염 프로세스의 개시에 따라 Shigella 야생-타입 스트레인 및 그것의 isogenic ipgD 돌연변이16에서 상당한 차이 설정 하 고 충분 하다. 매우 민감한 카메라의 개발 연구원 fluorophore 조명의 강도 줄이고 로컬 Ca2 + 확장된 기간 동안 이미지, 따라서 더 많은 과도 Ca2 +의 시간 분해능을 향상을 수행할 수 허용 수 있습니다. 신호.
로컬 Ca2 + 응답 및 세균성 내 습 사이트 사이 공간 상호 관계:
미생물에 의해 유도 된 신호 이벤트의 로컬 측면 이므로 로컬 Ca2 + 신호 병원 체-호스트 세포 상호 작용의 사이트와 함께 그들의 협회에 관하여 공부 하는 것이 중요. 이 두 가지 유형의 고려 사항 발생합니다. 첫째, 모든 세포는 감염 되지 않을 수 있습니다, 그리고 모든 미생물 신호 트리거되지. 이질균, 박테리아의 단지 소수 민족 침략, 트리거 및 모든 셀 감염 되었을 수 있습니다. 우리의 실험에는 나는 그래서 그 한 셀 형성 0.7-조정 했다 세균성 내 습의 1 초점. 포커스/셀 수가 개별 침공 이벤트의 분석을 위한 가능한 간섭으로 이어질 수 있습니다 그리고, 반대로, 낮은 숫자 수 있습니다 렌더링 분석 너무 복잡 하 고, 특히 뚜렷이 transfected 세포 공부를 할 때. 우리 transfection 효율 관리 번호로 복제 실험의 수를 셀의 적어도 30%에 도달 하는 데 필요한 발견. 둘째, Shigella 침공 사이트 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 쉽게 감지할 수 있습니다. 다른 프로세스에 대 한 다른 형광 기반 검색 메서드를 사용할 수 있습니다. 그러나 중요 한 부분,, 가장 실험적인 체제에 로컬 Ca2 + 영상에 필요한 수집 스트림 기간 동안 수집의 방해입니다. 이 연루는 분석 프로세스가이 스트림을 로컬 Ca2 + 신호 그들의 공간적 상호 관계를 허용 하는 동안 중요 한 움직임을 표시 해야 합니다. 이것은 몇 분 동안 동일한 셀 영역에 지역화 Shigella 침공 이벤트에 대 한 경우, 매우 운동 프로세스 관리 되지 않을 수 있습니다 또는 짧은 수집 스트림 필요 아마.
점수 및 로컬 Ca2 + 응답의 분석:
글로벌 Ca2 + 응답 쉽게 감지 하 고, 로컬 Ca2 + 응답의 작은 진폭 및 기간 검색 위에서 설명한 형광 신호 수집의 최적화를 합니다. 그것은 또한 중요 한 배경 변화 위에 신호를 차별화 하는 엄격한 기준을 적용 됩니다. 일반적으로 우리는 Ca2 + 신호 적어도 3 배 3 연속 30 ms 인수 기준 변화에 도달 하는 평균 Fluo-4 형광 강도의 증가 점수. 이 응답은 동일한 평균 형광 강도 보여주는 셀의 다른 영역에 이러한 증가 표시 되지 않으면 지역으로 간주 됩니다. 이러한 규칙은 체계적으로 적용 하는 경우 다양 한 샘플에 로컬 Ca2 + 응답 점수 주요 어려움을 발생 하지 합니다. 우리 손에 세균 침공과 관련 된 로컬 Ca2 + 신호의 낮은 주파수 그리고 주요 장애물이 표현 분석 셀의 5-20%에서 배열. 넘어 생물 유사 이전 단락, 또한 분석 된 침략 과정의 일부분으로 해당 스트림을이 낮은 주파수에 기여 하는 사실에에서 대 한 자세한. 이 낮은 주파수 때문에 샘플의 차이점을 수립 수 있습니다 연루 통계적 의미에 도달 샘플 크기를 예측 하려면 파일럿 실험에 전원 테스트를 수행.
미래의 응용 프로그램:
우리는 프로토콜 일 밖으로 신호를 분석 로컬 Ca2 + Shigella 침입 하는 동안 것입니다 공간에 남아 있는 모든 프로세스에 대 한 이미지 로컬 Ca2 + 응답 도움이 국한 수집 기간 동안 믿습니다. 캘리포니아2 + 신호 하는 것이 다재 다능 한 동안 로컬 Ca2 + 신호 플라즈마 또는 신호의 초기 포인트 소스 있는 세포내 막에서 발생 하는 프로세스에 대 한 가장 관련성이 높은 수 있습니다. 따라서, 미생물 호스트 세포 상호 작용 하는 동안 로컬 Ca2 + 신호 수 있습니다 원형질 막에 접착 또는 침략 적 프로세스에 관련 된 또는 포함 하는 병원 체의 세포 막에 발생 그들. 다른 한편으로, 우리가 확장된 감염 활동을 통해 글로벌 Ca2 + 신호를 분석 하도록 설계 된 프로토콜 transcriptional 프로그램의 규정 등 감염, 동안 일반 세포 생리학에 영향을 미치는 프로세스와 관련이 있을 수 있습니다. 또는 병원 체에 의해 세포 죽음 통로입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
원고 편집에 그녀의 도움에 감사 제니 리 Thomassin 하 고. 작품은 ANR에 의해 지원 되었다 MITOPATHO 및 PATHIMMUN를 부여, PSL IDEX Shigaforce Labex Memolife를 부여. Chunhui 태양은 중국 장학금 위원회에서 박사 그랜트의 받는 사람입니다. 로 랑 Combettes와가 트 란 반 Nhieu는 WBI 프랑스 exchange Tournesol 프로그램 N ° 31268YG의 받는 사람 (Wallonie Bruxelles 국제, Fonds 드 라 검색 과학, Ministère 프랑스어 데 레 아 페르 étrangères 등등 européennes, Ministère 데 l'Enseignement supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche dans le 간부 des Partenariats 휴버트 Curien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
