Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dell'imaging di singole molecole delle interazioni tra proteine del DNA, come la replicazione del DNA, la riparazione genica e il mantenimento della struttura cromosomica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può ottenere un alto contenuto di collagene di DNA lambda modificato e quindi polimerizzare rapidamente le proteine marcate. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di assemblaggio delle celle a flusso sono difficili da imparare.

Per pulire i vetrini, mettere 20 vetrini coprioggetti in quattro barattoli di colorazione, versarvi dell'etanolo e sonicare per 30 minuti in etanolo. Quindi sciacquare tre volte i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura. Quindi, sonicare i vetrini coprioggetti con un idrossido di potassio molare per 30 minuti e sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura tre volte.

Quindi ripetere una volta la sonicazione con etanolo e idrossido di potassio. Sonicare i vetrini coprioggetti con acetone per 30 minuti e poi risciacquare accuratamente con acqua ultrapura. Ora metti i vetrini coprioggetti nella soluzione Piranha e incuba a 95 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura cinque volte. Quindi lavare accuratamente ogni vetrino coprioggetti con acqua ultrapura. Usa la carta per asciugare il vetrino coprioggetti dal bordo e mettilo in un barattolo colorante.

Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetti in un forno a 110 gradi Celsius. Ora sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e poi rimettere il barattolo di colorazione nel forno a 110 gradi Celsius per asciugare il vetrino coprioggetti. Per eseguire la funzionalizzazione del vetrino coprioggetti, aggiungere 70 millilitri di soluzione di Silano in ogni barattolo, avvitare il tappo e lasciare il barattolo a temperatura ambiente per una notte.

Lavare i vetrini coprioggetti utilizzando tre bicchieri riempiti con acqua ultrapura. Asciugare accuratamente i vetrini coprioggetti con azoto gassoso. Sciogliere 150 milligrammi di metossi-PEG e sei milligrammi di biotina-PEG in un millilitro di bicarbonato di sodio molare 0,1 appena preparato.

Centrifugare a 17.000 volte g per un minuto per rimuovere i PEG insolubili. Pipettare ora 100 microlitri di soluzione PEG al centro del vetrino coprioggetti silanizzato e posizionare un altro vetrino coprioggetti silanizzato sulla parte superiore. Incubare i vetrini coprioggetti con soluzione PEG per almeno tre ore al buio.

Separare le coppie di vetrini coprioggetti e mantenere la superficie funzionalizzata rivolta verso l'alto. Sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura e asciugarli con azoto gassoso. Ora segna il lato funzionalizzato dei vetrini coprioggetti su uno degli angoli usando un pennarello.

Posizionare un vetrino coprioggetti in un tubo da 50 millilitri forato con un foro sul tappo. Metti il tubo in un sacchetto di plastica, sigilla il sacchetto con una sigillatrice sottovuoto e conservalo a meno 20 gradi Celsius. Per assemblare la cella di flusso, tagliare un canale al centro di un pezzo di nastro biadesivo utilizzando un perforatore.

Staccare il lato di carta del nastro biadesivo e incollarlo su un lato di vetro con due fori. È più facile rimuovere le bolle d'aria staccando il lato di carta rispetto al lato di plastica del nastro biadesivo. Premere il nastro per rimuovere le bolle d'aria.

Quindi tagliare un vetrino coprioggetti funzionalizzato in quattro pezzi utilizzando un graffietto di vetro con punta di diamante e rimuovere i detriti utilizzando azoto gassoso mantenendo il lato funzionalizzato rivolto verso l'alto. Staccare il lato in plastica del nastro biadesivo e incollare il vetrino sul vetrino coprioggetti funzionalizzato. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria tra il vetrino coprioggetti e il nastro.

La rimozione accurata delle bolle d'aria può proteggere la cella di flusso dalle perdite durante il pompaggio dei tamponi. Ora inserisci il tubo di ingresso nel foro piccolo e inserisci il tubo di uscita nel foro grande. Fissare il tubo utilizzando resina epossidica.

Pompare manualmente 20 microlitri di 0,2 milligrammi per millilitro di streptavidina nella cella di flusso utilizzando una siringa e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi pompare il tampone di blocco nella cella di flusso per sostituire la streptavidina e mantenerla a temperatura ambiente. Ottenere l'allineamento focale del rosso e del rosso lontano con A5 sul vetrino di prova numero uno del microscopio a fluorescenza mediante eccitazione simultanea utilizzando un laser a 532 nanometri e un laser a 640 nanometri.

Produci immagini a doppia lunghezza d'onda con ottica splitting. Posizionare la cella di flusso sul microscopio e collegare il tubo di uscita a un tubo più lungo collegato a una molla da 10 millilitri installata su una pompa programmabile per il prelievo automatico dell'infusione. Rimuovere le bolle d'aria nella cella di flusso iniettando il tampone di blocco e capovolgendo il tubo di uscita.

Aggiungere 0,5 microlitri di DNA lambda-ARS317 biotinilato in 80 microlitri di tampone bloccante. Pompare la miscela preparata nella cella di flusso a 25 microlitri al minuto per due minuti. Quindi lavare il DNA lambda-ARS317 utilizzando 200 microlitri di tampone bloccante a una velocità di 50 microlitri al minuto.

Ora pompare 200 microlitri di tampone legante a una velocità di 50 microlitri al minuto per rimuovere il tampone bloccante nella cella di flusso. Quindi, aggiungi due microlitri di ORC-Qdot705, un microlitro di DTT e un microlitro di ATP in 96 microlitri di tampone legante. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è 0,2 nanomolare.

Dopo aver pompato il tampone di legame come descritto nel protocollo di testo, pompare 20 microlitri della soluzione preparata di ORC-Qdot705 a una velocità di 10 microlitri al minuto nella cella di flusso. Eliminare l'eccesso di ORC-Qdot705 utilizzando 200 microlitri di tampone legante a una velocità di 100 microlitri al minuto. Quindi pompare il tampone di legame con 30 nanomolari SYTOX Orange nella cella di flusso per colorare i substrati di DNA a una velocità di 100 microlitri al minuto.

Infine, eccita il segnale ORC-Qdot705 utilizzando un laser a 405 nanometri ed eccita il segnale del DNA colorato con SYTOX Orange utilizzando un laser a 532 nanometri. Osservare i segnali contemporaneamente con un flusso di 100 microlitri al minuto utilizzando un filtro passa-banda quad band. Registra le immagini tramite EMCCD con 100 millisecondi per fotogramma.

L'illustrazione del substrato di DNA lambda-ARS317 è mostrata qui. L'ORC marcato con Qdot705 è stato eccitato da un laser a 405 nanometri. Il DNA colorato con SYTOX Orange è stato eccitato da un laser a 532 nanometri.

Il risultato unito suggerisce che l'ORC marcato Qdot705 si lega ad ARS317. Il risultato della distribuzione del legame ORC sul DNA lambda-ARS317 mostra che l'ORC si lega ad ARS317 con un'elevata abbondanza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la FRET a singola molecola per rispondere a ulteriori domande riguardanti le interazioni proteina-proteina e la dinamica delle proteine.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging fluorescente a singola molecola per esplorare le interazioni delle proteine del DNA nei sistemi ricostituiti di replicazione del DNA e riparazione del DNA in vitro. Non dimenticare che lavorare con la soluzione Piranha può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni come l'uso di maschere protettive per il viso devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.