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Chemistry

Formation de luminophore dans différentes Conformations de l’albumine sérique Bovine en se liant d’or

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58141
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Summary

Les protocoles pour l’étude de la liaison des cations or (Au(III)) à différentes conformations de l’albumine sérique bovine (BSA) ainsi que pour caractériser la fluorescence dépendante conformationnelle de la BSA-Au unique sont présentées.

Abstract

Les protocoles présentés vise à étudier le processus de liaison d’au (III) à BSA, rendement de fluorescence rouge induite par le changement de conformation (λem = 640 nm) des BSA-Au(III) complexes. La méthode permet d’ajuster le pH pour montrer que l’émergence de la fluorescence rouge est en corrélation avec les transitions d’équilibre induite par le pH des conformations BSA. Rouge fluorescent BSA-Au(III) complexes peuvent seulement être formés avec un ajustement du pH égale ou supérieure à 9,7, qui correspond à la conformation « A-form » de BSA. Le protocole d’ajuster la BSA au rapport molaire Au et de suivre l’évolution temporelle du processus de liaison d’au (III) est décrit. Le nombre minimal d’au (III) par BSA, à produire la fluorescence rouge, est inférieur à sept. Les auteurs décrivent le protocole en étapes pour illustrer la présence de plusieurs sites de fixation d’au (III) dans le BSA. Tout d’abord, par l’ajout de cuivre (Cu(II)) ou nickel (Ni(II)) cations suivies d’au (III), cette méthode révèle un site de liaison au (III) qui n’est pas le fluorophore rouge. Deuxièmement, en modifiant les BSA de thiol des agents de recouvrement, un autre site de liaison au (III) formant des nonfluorophore se révèle. En troisième lieu, les lieux possibles de liaison au (III) modifier la conformation de BSA par clivage et bouchage des liaisons disulfide, sont illustrées. Le protocole décrit, pour contrôler les conformations de la BSA et la liaison d’au (III), peut être généralement appliqué pour étudier les interactions entre d’autres protéines et les cations métalliques.

Introduction

Un BSA-Au composé présentant un rayonnement ultraviolet (UV)-excitable fluorescence rouge, avec remarquables déplacement de stokes, a été initialement synthétisé par Xie et al. 1. la fluorescence rouge unique et stable peut trouver diverses applications dans des domaines tels que la détection de2,3,4,5,6,7d’imagerie ou nanomédecine8 ,9,10,11,12,13. Ce composé a été étudié abondamment par de nombreux chercheurs dans le domaine des nano-sciences dans ces dernières années14,15,16. Le composé de BSA-UA a été interprété comme UA25 nanoclusters. L’objectif de la méthode présentée est d’examiner ce composé en détail et de comprendre l’origine de la fluorescence rouge. En suivant l’approche présentée, la présence de multiples sites de liaison Au et l’origine de la fluorescence, alternative à la nucléation de site unique d’UA25 nanoclusters, peuvent être illustrées. La même approche peut être utilisée pour étudier comment les autres protéines17,18,19 complexé au (III) peut changer leurs propriétés fluorescentes.

La synthèse du composé fluorescent rouge BSA-Au requiert un contrôle étroit des rapports molaires de BSA à UA (BSA:Au) afin de maximiser l’intensité de la fluorescence et la localisation des pics dans l’excitation-émission carte (EEM)20. Il peut être démontré que plusieurs sites de fixation existent pour au (III) lier, y compris le fragment de l’Asparagine (ou fragment de l’Asp, les quatre premiers résidus d’acides aminés à l’extrémité N-terminale de BSA)21,22. L’acide aminé le 34ème de BSA (Cys-34) montre aussi de coordonner au (III) et d’être impliquée dans le mécanisme de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rouge20. Dès coupant tous les ponts disulfures Cys-Cys et couvrant tous les fluorescence de thiols, rouge n’est pas produite ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Cela indique la nécessité de liaisons disulfide Cys-Cys comme le site de liaison au (III) pour produire la fluorescence rouge.

Techniques de chimie des protéines n’ont pas été couramment pour étudier les complexes BSA-Au(III) dans la communauté des nano-sciences. Toutefois, il serait utile d’employer ces techniques pour comprendre certains aspects de ces complexes, aussi bien quant à détaillée comprendre les sites de fixation d’au (III) dans la BSA. Cet article est destiné à montrer certaines de ces techniques.

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Protocol

1. synthèse du complexe BSA-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) dans un flacon de 5 mL réaction.
    Remarque : La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre or (III) chlorure trihydraté (acide chloraurique) à une concentration de 5 mM dans l’eau de qualité HPLC.
    Remarque : La solution doit apparaître jaune. Solution d’acide chloraurique préparée à cette concentration entraînera une BSA ratio Au 01:13.
    1. Vous pouvez également préparer une solution d’acide chloraurique avec une concentration de n’importe où entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) à 20 mM (BSA:Au = 01:50) en HPLC grade l’eau.
      NOTE : Différentes proportions de BSA à l’or seront traduira dans les profils de fluorescence rouge radicalement différente de la carte d’excitation-émission.
  3. Placez la cuvette de la réaction de BSA dans un bain-marie à 37 ° C et mélanger vigoureusement à 750 tr/min avec un agitateur magnétique.
  4. Immédiatement après le début de l’agitation, ajouter 1 mL d’acide chloraurique à la solution. La couleur de la solution devrait transformer de clair à jaune.
  5. Agiter le mélange pendant 2 min à 37 ° C et à 750 tr/min avec un agitateur magnétique.
  6. Dans le flacon de réaction, ajouter 100 μL de 1 NaOH M à la solution pour amener le pH à 12.
    NOTE : Immédiatement après l’ajout de NaOH, la solution devrait assombrir un peu au jaune-marron et ensuite retourner en arrière au jaune.
  7. Continuez à remuer à 750 tr/min pendant 2 h et 37 ° C. La solution devrait lentement passent du jaune au jaune/brun foncé. Ce changement de couleur indique la formation de la BSA-Au(III) de fluorescence rouge complexe.
  8. Laisser reposer à température ambiante pendant 2 jours, l’échantillon et la solution continuera à s’assombrir à un brun ambré et augmentera l’intensité de la fluorescence.
    1. Vous pouvez également laisser l’échantillon continuez à remuer à 37 ° C pendant 12 h de plus que la couleur de la solution évolue à un brun ambré.

2. synthèse des BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité HPLC. La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre le cuivre (II) dihydrate de chlorure dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM. La solution doit apparaître la lumière bleue.
  3. Ajouter 1 mL de la solution aqueuse de BSA dans un flacon de réaction de 5 mL et placer dans un bain-marie à 37 ° C. Incorporer le mélange à 750 tr/min.
  4. Immédiatement ajouter 0,5 mL de la solution de dihydraté chlorure de cuivre (II) dans le flacon de réaction et mélanger pendant 2 min. La solution restera la lumière bleue.
  5. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M pour amener le pH à 12 et de permettre de mélanger pendant 2 h. La solution va devenir pourpre.
  6. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM.
  7. Ajouter 0,5 mL d’acide chloraurique aqueux dans le flacon de réaction et ajuster le pH à 12 à l’aide de 1 NaOH M.
  8. Remuer le mélange réactionnel pendant 2 h.
    NOTE : La solution doit évoluer vers une couleur brune.

3. synthèse des BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité HPLC. La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre l’hexahydrate de chlorure de nickel (II) dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM. La solution doit apparaître la lumière verte.
  3. Ajouter 1 mL de la solution aqueuse de BSA dans un flacon de réaction de 5 mL et placer dans un bain-marie à 37 oC. remuer le mélange à 750 tr/min.
  4. Immédiatement ajouter 0,5 mL de la solution d’hexahydrate de chlorure de nickel (II) au flacon de réaction et mélanger pendant 2 min.
    Remarque : La solution reste lumière verte.
  5. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M pour amener le pH à 12 et de permettre de mélanger pendant 2 h.
    Remarque : La solution deviendra jaune foncé.
  6. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM.
  7. Ajouter 0,5 mL de l’acide chloraurique aqueux dans le flacon de réaction et ajuster le pH à 12.
  8. Remuer le mélange réactionnel pendant 2 h.
    NOTE : La solution doit évoluer vers une couleur brune.

4. synthèse du [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. Dissoudre 2 mg de N-éthylmaléimide (NEM) dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
  2. Dissoudre 2 mg de BSA dans 1 mL de solution de PBS-NEM.
  3. Transvaser la solution dans un flacon de 5 mL réaction et remuez à 20 ° C à 500 tr/min pendant 1 h.
  4. Dialyser la solution à l’aide de 12 tubes de dialyse kDa dans 500 mL de PBS, en remuant à 50 tr/min avec un agitateur magnétique pendant la nuit pour enlever le NEM n’ayant pas réagi.
  5. Dissoudre l’acide chloraurique dans du PBS à une concentration de 0,4 mM.
    Remarque : La solution sera un jaune pâle.
  6. Transférer le flacon de réaction dans un bain-marie à 37 ° C. Remuer à 750 tr/min.
  7. Ajouter 1 mL de solution d’acide chloraurique dans le flacon de réaction immédiatement et permettent de mélanger pendant 2 min.
  8. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M dans le flacon de réaction pour amener le pH à 12 et laissez pour mélanger pendant 2 h.

5. synthèse du [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. Préparer une solution de 2 M urée et 50 mM bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3, pH 8,0) dans l’eau de qualité HPLC.
  2. Dissoudre 3,3 mg de BSA dans 1 mL de la solution et le transfert à un flacon de 5 mL réaction ci-dessus.
  3. Préparer une solution stock de 0,25 M tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) en dissolvant 62,5 mg de TCEP dans 1 mL d’eau de l’HPLC.
  4. Verser la solution mère de TCEP dans la cuvette de réaction jusqu'à ce que la concentration finale de PTCE est 8 mM.
  5. Incuber la solution dans un bain-marie pendant 1 h à 50 ° C. Remuer à 500 tr/min avec un agitateur magnétique.
  6. Laisser la solution refroidir complètement à température ambiante.
  7. Préparer une solution de 100 mM NEM en dissolvant 12,5 mg de NEM dans 1 mL d’eau de qualité HPLC.
  8. Verser la solution mère de NEM dans la cuvette de réaction jusqu'à ce que la concentration finale de NEM est 16 mM.
  9. Laissez agir la solution combiner pendant 2 h à 20 ° C. Remuer à 500 tr/min.
  10. Dialyser la solution à l’aide d’un tube de dialyse de 12 kDa, agitant la solution à 50 tr/min avec un agitateur magnétique du jour au lendemain dans 500 mL de 50 mM NH4HCO3 pour éliminer les excès TCEP, NEM et urée.
  11. Déplacer le flacon de réaction à un bain d’eau à 37 ° C et mélanger à 750 tr/min.
  12. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 0,66 mM.
  13. Ajouter 1 mL de solution d’acide chloraurique dans le flacon de réaction immédiatement et permettent de mélanger pendant 2 min.
  14. Ajouter 1 NaOH M jusqu'à ce que le pH de la solution est de 12 et laisser la solution de continuer à mélanger pendant 2 h.

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Representative Results

De la fluorescence du complexe BSA-Au(III), il a été observé que la conversion de la fluorescence bleue intrinsèque du BSA (λem = 400 nm) à fluorescence rouge (λem = 640 nm) se produit à pH 9,7 grâce à un équilibre d’environ transition (Figure 1). ESEE de BSA-Au(III) à différent BSA à rapports molaires Au est illustré à la Figure 2, et ces données montrent comment modifier les rapports molaires donne la même longueur d’onde des émissions aux longueurs d’onde différentes d’excitation. Cu (II), ni (II) et au (III) compétitifs lient à un site connu (fragment Asp) BSA (Figure 3). La BSA diablotin Cys34 indique un changement dans les modes pic ESEE lors de la liaison au (III), et ces résultats montrent comment modifier des sites de liaison spécifiques modifie habitudes de fluorescence. La BSA all-thiol-plafonné ne montre aucune fluorescence rouge et révèle les disulfures Cys-Cys accepteurs possibles pour produire le fluorophore rouge (Figure 4).

Figure 1
Figure 1. Fluorescence de la BSA-Au(III) et la conformation induits par le changement du bleu au rouge (A) l’absorption et fluorescence (λex = 365 nm) de BSA-Au(III). (B) une fluorescence rouge des êtres à émerger autour de pH 9,7, qui change la conformation de la BSA. (C) bleu désintégrations de fluorescence, comme il ressort d’une fluorescence rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Mesures de carte (EEM) ratio métrique excitation-émission de BSA-Au(III). ESEE de BSA-Au(III) complexe synthétisé en utilisant le protocole standard tout en ajustant le ratio de BSA à l’or. (A) BSA à pH 12, (B) BSA:Au = 1:1, (C) BSA:Au = 1:7, BSA:Au (D) = 01:13, (E) BSA:Au = 01:26, BSA:Au (F) = 01:30, BSA:Au (G) = 01:40, (H) BSA:Au = 01:52. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Complexes de l’ESEE de BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III). Excitation-émission de cartes (excitation : 290-500 nm ; émission : 300 à 850 nm) de BSA complexé avec Cu(II)/Ni(II) à pH 12 (A et B), BSA complexé avec Cu(II)/Ni(II) puis avec au (III) à un pH de 12 (C et D) et l’absorption les spectres en comparant les BSA, BSA-UA, BSA-Cu(II)/Ni(II) et BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III) (E et F). La courbe 4 est comparée à la superposition des courbes 2 et 3. Ce chiffre a été modifié par Dixon, J. M. & Egusa, S. J. mod. Chim. SOC. 140 2265-2271, (2018). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. ESEE de Cys34 plafonné et tous les thiols plafonnés. EEM (excitation : 300-500 nm ; émission : 300-700 nm) de (A) diablotin Cys34 BSA a réagi avec UA à un pH de 12. (B), tous les ponts disulfures Cys-Cys BSA ont été clivés et puis le tout-thiol-capped-BSA a fait réagir avec UA à un pH de 12. Ce chiffre a été modifié par Dixon, J. M. & Egusa, S. J. mod. Chim. SOC. 140 2265-2271, (2018). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les composés de BSA-Au(III) préparés à pH 12 présentent une fluorescence rouge à une longueur d’onde d’émission de λem= 640 nm lorsqu’il est excité avec rayonnement ultraviolet (UV) légère λex= 365 nm (Figure 1 a). L’émergence de la fluorescence rouge est un processus lent et prendra quelques jours à température ambiante pour passer à une intensité maximale. À 37 ° C en cours d’exécution de la réaction produira les résultats optimales, même si une température plus élevée peut être utilisée pour produire la fluorescence rouge plus rapidement. Une dégradation irréversible de la protéine peut se produire à des températures supérieures à 45 ° C,23. L’ajustement du pH pour que BSA transforme son âge (pH > 10) conformation21 (« A-form ») est critique pour la fluorescence rouge ; pH est finement réglé de neutre à base de déterminer le seuil de l’occurrence de la fluorescence rouge (Figure 1 b, C). Pour l’intensité de fluorescence rouge maximale, le pH doit être ajusté au-dessus de 11. Pour la fluorescence rouge, le pH peut être ajusté au-delà de 11, bien qu’extrêmement les conditions de base (pH > 13) peuvent dénaturer BSA et provoquer une fluorescence rouge à disparaître.

Modifiant le rapport stoechiométrique de BSA et de l’UA peut illustrer la liaison de l’UA à BSA. Les spectres de fluorescence des composés BSA-Au(III) varient selon les rapports stoechiométriques de BSA à UA (Figure 2). La BSA ratio or est modifiée à 01:26, un maximum d’intensité de fluorescence rouge est observé à λex= 500 nm. En revanche, comme le ratio de BSA:gold est ajusté à fluorescence rouge 1:7, est observée principalement à λex= 365 nm. Aucune fluorescence rouge ne peut être détecté à un ratio de BSA Au moins 1:7 ou supérieure à 01:52. Le nombre minimal de cations or requis pour produire le rouge fluorescence est inférieur à 7 et plus de 1, et le nombre maximal de la perte de la fluorescence rouge est supérieur à 52 (Figure 2 b, C). En outre, la réduction de tous les exemples précités se produira sous le borohydrure de sodium excédentaire, élucider que tous les échantillons contiennent encore cationique au (III). En outre, l’ajout de quantités excessives d’or au-delà de 20 mM peut causer la solution de devenir trop acide et dénaturer les protéines. En cas de dénaturation des protéines en raison de la forte acidité, réduire la concentration de BSA et UA relativement à la médiation de cette question.

Liaison compétitive de l’Union africaine et d’autres cations métalliques de BSA peut illustrer les sites de fixation dans la BSA. Il est connu que les Cu (II) et ni (II) les deux se lient à l’AEP fragment à l’extrémité N de BSA24,25,26,27. Grâce à l’ajout de Cu (II), une reliure solide à l’Asp-fragment, suivie par l’ajout d’au (III), les spectres d’absorption des BSA-Cu(II)-Au(III) et les spectres d’absorbance de BSA-Au(III) et BSA-Cu(II) sont les mêmes - indiquant qu’or et cuivre n’ont pas se disputent le même site de liaison à l’Asp-fragment (Figure 3). Ni (II) se lie faiblement à l’Asp-fragment et donc au (III) est en concurrence avec ni (II) que l’or est ajouté ; Il a été observé que les spectres d’absorbance de BSA-Ni(II) et de BSA-Au(III) n’est pas corrélée avec celle de BSA-Ni(II)-Au(III) (Figure 3F). Via le protocole ci-dessus, on peut montrer comment au (III) se lie à l’accepteur connus de BSA. Cette technique requiert également l’ajustement de pH supérieur à 11 et la technique est modifiée en ajoutant deux fois la concentration de BSA, mais à la moitié du volume, donc cela devrait être effectué aux BSA faible ratios UA pour maintenir la conformation de la protéine.

Modifier les résidus de cystéine sur BSA peut élucider davantage les sites de liaison Au. Or est connu pour avoir une forte affinité pour le thiol28 et BSA possède un surface thiol accessible sur (Cys34)21. Par le blocage de ce thiol, sites de liaison secondaire peuvent être élucidés. Le blocage de cette cystéine est effectué avant l’ajout au (III) de l’échantillon et montre un modèle de fluorescence altérée de BSA-Au(III), ce qui indique une voie de transfert possible impliquée dans le mécanisme de la fluorescence rouge (Figure 4 a). Il est impératif d’ajouter l’agent de blocage de thiol, dans ce cas NEM, à un pH neutre. Coupant tous les ponts disulfures et l’écrêtement ultérieure de leur révèle de groupes thiol libre aucune fluorescence rouge (Figure 4 b). Ces résultats indiquent qu’il faut pour produire un complexe fluorescent rouge un pont disulfure.

Nous avons démontré dans différents protocoles, par l’utilisation de spectroscopiques et techniques chimie des protéines, une méthode pour analyser les complexes BSA-Au(III). Techniques de chimie des protéines présentées ici n’ont pas été largement utilisés dans la recherche de nano-matériaux basés sur la protéine14. Ces techniques peuvent être généralement applicable et être utile pour comprendre le processus de liaison métallique et les sites de liaison possible dans d’autres, si pas tous, protéines comme la trypsine, la pepsine, lysozyme et la transferrine17,29. Les protéines sont « nanomatériaux » dynamique, pourtant très précises. Compréhension détaillée du site de fixation métallique pourrait ouvrir la voie vers nouveaux matériaux à base de protéines avec des propriétés optiques contrôlées avec la myriade d’applications potentielles.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

S.E. reconnaît l’appui du Fonds d’Initiative spéciale Duke Endowment, Wells Fargo fonds, Fondation de PhRMA, ainsi que des fonds de démarrage de l’University of North Carolina, Charlotte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% Sigma-Aldrich A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% Sigma-Aldrich 459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% Sigma-Aldrich 4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% Sigma-Aldrich C4706
Sodium hydroxide, >98.0% Sigma-Aldrich S8045
Urea, 99.5% Chem-Implex Int'l 30142
Phospate buffered saline (PBS) Corning MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5% Sigma-Aldrich 9830

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Chimie numéro 138 synthèse albumine de sérum BSA or UA fluorescence pH conformation
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