Summary
En ny kraft-klemme rheometry teknik bruges til at undersøge de mekaniske egenskaber af små mængder protein-baserede hydrogel prøver tøjret mellem en voice-coil motor og en force sensor. En analog proportional-integral-derivat (PID) system tillader 'klemmemekanismen' Force opleves at den ønskede protokol.
Abstract
Her, beskriver vi en kraft-klemme rheometry metode til at karakterisere de biomekaniske egenskaber af protein-baseret hydrogels. Denne metode bruger en analog proportional-integral-derivat (PID) system til at anvende kontrollerede gældende protokoller på cylindrisk proteinbaseret hydrogel prøver, som er bundet mellem en lineær voice-coil motor og en krafttransducer. Under drift justerer PID system udvidelse af hydrogel prøve at følge en foruddefineret force protokol ved at minimere forskellen mellem de målte og sætpunkt styrker. Denne unikke tilgang til protein-baserede hydrogels gør det muligt tøjring af ekstremt lav-volumen hydrogel prøver (< 5 µL) med forskellige protein koncentrationer. Under force-rampe protokoller, hvor den anvendte stress stiger og falder lineært med tid, systemet muliggør undersøgelse af elasticitet og hysterese adfærd forbundet med den (FN) foldning af proteiner og måling af standard elastisk og viskoelastiske parametre. Under konstant-kraft, hvor kraft puls har en trin-lignende figur, elastisk svaret grund til ændringen i kraft, er afkoblet fra viskoelastiske svar, der kommer fra protein domæne udfoldning og hvorved man genfolder. På grund af sin lav-volumen prøve og alsidighed ved at anvende forskellige mekaniske perturbationer, er kraft-klemme rheometry optimeret til at undersøge den mekaniske respons af proteiner under kraft ved hjælp af en bulk tilgang.
Introduction
Bortset fra at have unikke fysiske egenskaber, holde protein-baserede hydrogels løftet om revolutionerer kraft spektroskopi ved at aktivere måling af flere milliarder molekyler i en "pull", således at studiet af proteiner i overfyldte miljøer, svarende til dem fundet i huden og andre væv. Protein domæner forblive foldede inde i hydrogels, giver mulighed for undersøgelse af deres biomekaniske svar at tvinge, bindende partnere, og kemiske forhold. Derudover ligner den biomekaniske svar af protein domæner inde hydrogels den reaktion, set med enkelt-molekyle kraft spektroskopi teknikker. For eksempel, falde kemiske denatureringsmidler og oxidationsmidler stabilitet af den foldede stats både enkelt protein domæne niveau1,2,3 og på det makroskopiske niveau4,5 , 6 , 7. på samme måde, osmolytes øge stabiliteten i enkelt proteiner8,9, fører til et fald i viskoelastiske svar af hydrogels, for det samme gældende betingelser7,10.
Flere metoder er blevet gennemført for at syntetisere protein-baseret hydrogels, enten ved hjælp af fysiske vekselvirkninger11,12 eller kovalent tværbindingsmidler4,13. Kovalente reaktioner giver mulighed for fast tværbindingsmidler steder og disse hydrogels kan gendanne den oprindelige tilstand ved en fjernelse af de mekaniske eller kemiske perturbationer. En vellykket strategi for kovalente cross-linking afhængig danner kovalente carbon-carbon-bindinger mellem udsatte tyrosin aminosyrer ved hjælp af ammonium persulfat (APS) som en oxidant og en ruthenium (II) salt som en initiativtager (figur 1)14. Ved udsættelse for hvidt lys, kan en løsning af koncentreret proteiner omdannes til en hydrogel. Ved at styre når reaktion starter, protein-APS-mix kan injiceres i enhver form, støbning, såsom polytetrafluorethylen (PFTE) rør (figur 1B og 1 C), der tillader anvendelse af en ekstremt lille løsning bind15. Desuden brug af hvidt lys til at udløse den tværbindingsmidler reaktion resulterer i en begrænset blegning af fluorescerende proteiner og gør det muligt for formuleringen af komposit hydrogels med fluorescerende markører (figur 1). Andre proteinbaseret hydrogel dannelse metoder bruger cross-linking baseret på SpyTag-SpyCatcher kovalente interaktion16, Amin tværbindingsmidler via glutaraldehyd13eller biotin-streptavidin interaktioner17.
Dynamisk mekanisk analyse (DMA) er i øjeblikket en teknik flittigt brugt til at studere polymer-baserede hydrogels13,18. Mens DMA kan gælde biomaterialer konstant kraft protokoller, kræver det Youngs moduli over 10 kPa, og stor stikprøve mængder af mere end 200 µL19. På grund af disse begrænsninger er protein hydrogels generelt alt for blød til at blive undersøgt af denne teknik. Som manipuleret polyproteins er sværere at syntetisere end polymerer, da de kræver en levende system til at producere, er sådanne store mængder ineffektive på bedste4,15. Endvidere, de fleste biologiske væv er blødere end 10 kPa. Flere metoder blev udviklet for biologiske prøver, navnlig i studiet af muskel elasticitet20,21. Disse teknikker kan også operere under feedback til at anvende konstant kraft, men er optimeret til prøver med små diametre (i rækken micron) udsat for at tvinge for meget kort tid (typisk mindre end 1 s).
Protein-baserede hydrogels blev med succes undersøgt med modificerede rheometry teknikker. For eksempel, tillader støbning hydrogel i en ring form brug af ekstensionelle rheometry at måle ændringen i den erfarne kraft som en funktion af udvidelse4,22. Andre metoder til at studere de rheologiske egenskaber af protein-baserede hydrogels bruge kontrolleret shear-stress rheometry. Disse teknikker kan også opnå lav sample volumen og tolerere bløde materialer. Men disse metoder manglende evne til at efterligne den trække styrker denne årsag protein udfoldelsen i vivo, og Young's modulus er beregnet på grundlag af komplekse teorier, der kræver forskellige antagelser og korrektioner23.
Vi har for nylig rapporteret en ny tilgang, der bruger en lille mængde proteiner, polymeriserede indeni rør med diametre < 1 mm. Vores første gennemførelse af denne teknik, der opererer i længde-clamp tilstand, hvor gelen blev forlænget efter den ønskede protokol15. I denne metode opleve proteiner en kontinuerlig ændring i både udvidelsen og kraft mens domænerne udfolde sig, gør data fortolkning besværlige. Vi har for nylig rapporteret en ny kraft-klemme rheometry teknik, hvor en feedback-sløjfe kan udsætte små mængder protein hydrogels til en foruddefineret force protokol7 (figur 2). En analog PID system sammenligner styrken målt af force sensor med sætpunktet sendes fra computeren og justerer gel udvidelse ved at flytte voice coil at minimere forskellen mellem de to indgange. Denne 'fastspænding' Force giver nu mulighed for nye typer af eksperimenter til at måle biomekanik af protein hydrogels.
I tilstanden force-rampe oplever en tøjret protein hydrogel en konstant stigning og fald af force med tiden. PID kompenserer for eventuelle viskoelastiske deformation af skiftende forlængelsen i en ikke-lineær måde, afhængigt af protein og hydrogel formulering. Den største fordel ved kraft rampe er at det giver mulighed for kvantificering af standardparametre, som Young's modulus og energi varmeafledning, på grund af en udfoldning og hvorved man genfolder af protein domæner.
I konstant-kraft-tilstand skifter den kraft i en trin-lignende måde. I denne tilstand, gel udvider og kontrakter gravitoner, når kraften er steget eller faldet, henholdsvis, efterfulgt af en tidsafhængig deformation. Denne viskoelastiske deformation, finder sted, mens gelen oplever en konstant kraft, er direkte relateret til domæne udfoldning/hvorved man genfolder. På en forenklet måde, kan denne udvidelse ses som svarer til adskillige milliarder enkelt molekyle spor sammen i gennemsnit og målt på én gang. Konstant-kraft protokoller kan bruges til at studere krybe og lempelse af protein hydrogels som en funktion af kraft og tid. Som en funktion af kraft, for BSA-baseret protein hydrogels, har vi for nylig vist, at der er en lineær afhængighed mellem elastisk og viskoelastiske udvidelse og rekyl med anvendt stamme7.
Her detalje vi driften af en kraft-klemme rheometer bruge composite gels fremstillet af en blanding af protein L (8 domæner24, afbildet som L8) og en protein L-eGFP konstruktion (L-eGFP), hvilket gør den samlede hydrogel fluorescerende og let at demonstrere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser løsning forberedelse
- Forberede en start protein løsning ved at opløse/fortynde protein af interesse for den ønskede koncentration, ved hjælp af en Tris buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane og 150 mM NaCl, pH 7,4].
Bemærk: Den mindste proteinkoncentration for som tværbindingsmidler fører til hydrogels afhænger af protein anvendes og er typisk > 1 mM. - Forberede bestande af ammonium persulfat (APS) (1 M) og tris(bipyridine)ruthenium(II) chlorid ([Ru(bpy)3]2 +) (6,67 mM) løsninger ved at opløse APS og [Ru(bpy)3]2 + pulver i Tris buffer.
2. proteinbaseret Hydrogel syntese
- Lave en 23 G nål på en 1 mL sprøjte med et pressede stemplet.
- Skåret en 10 cm polytetrafluorethylen (PTFE) tube (med en indre diameter på 0,022 i og en ydre diameter på 0.044 i) ved hjælp af et barberblad. Vedhæfte nål og sprøjte til den ene ende af PTFE-røret.
- Indsæt den anden ende af røret i en silan løsning og fylde røret af tilbagetrækningskraften sprøjte stemplet. Forlade tube for ~ 30 min.
- Fjerne silan løsning og tør glasset med trykluft.
Bemærk: Sørg for at alle silan løsning er tørret og at ingen rester i røret. - Bland opløsningen protein med APS og [Ru (bpy) 3]2 + i 1,5 mL rør ved hjælp af et konstant volumen ratio [f.eks.15:1:1 eller 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Vortex photoactive løsningen indtil det er blandet fuldstændigt.
- Der centrifugeres blandingen ved maksimal hastighed (fx, 14.000 x g) til at fjerne eventuelle bobler fra løsningen.
- Indsæt den åbne ende af behandlede PTFE-røret i photoactive blandingen og tegner løsningen ind i røret ved tilbagetrækningskraften sprøjte stemplet.
- Placer den indlæste tube ~ 10 cm fra en 100 W kviksølv lampe til at forhindre opvarmning det og holde det der for op til 30 min. ved stuetemperatur (figur 1B).
Bemærk: I nogle tilfælde kan eksponeringstiden til lys være så lav som 30 s. kortere gellation gange bruges her til fluorescerende geler, for at begrænse photobleaching. - Fjerne røret fra nålen og skær kanterne af tube nær hydrogel ender med et barberblad.
- Brug afrundede 24 G nål til at presse hydrogel oploesningen Tris (figur 1 c).
Bemærk: Afrundede nåle bruges til at undgå enhver hak eller beskadige hydrogel prøven. - Inspicér visuelt geler for eventuelle fejl, der kan danne under ekstrudering eller på grund af boblerne og kassér geler med defekter.
3. proteinbaseret Hydrogel vedhæftet fil og kraft-klemme Rheometer Set-up
- Starte programmet instrument kontrol. Aktiver voice-coil motor. Indstil coil position til en værdi i slutningen af rækken (fx, 7.5 mm).
Bemærk: Voice-coil position anbefales at være mod slutningen af den maksimale bevægelsesområde, at maksimere en eventuel udvidelse af hydrogel. - Fortrænge kroge i z-retning og justere dem i svinget i x-retning (som er den trække koordinat, se figur 2B). Registrere værdierne af mikrometer skruer til x-retning.
- Skær 2 sterilt suturmateriale i strenge af ens længde (2-3 cm; Se figur 3A og B).
- Binde en løs dobbelt overhånd knude i hver af trådene og placere de 2 løkker på krogen tilsluttet force sensor (figur 3 c og 3D).
- Fyld den eksperimentelle kammer med Tris buffer og overføre hydrogel prøven til fyldt kammeret ved hjælp af medicinsk pincet.
- Placer voice coil og tvinge sensor kroge tæt på løsning overfladen og justere kroge i alle retninger ved hjælp af x/y/z-positionering manipulatorer.
- Ved hjælp af medicinsk pincet, hænge begge sider af protein hydrogel prøven på krogene tilsluttet stemme spole og tvinge sensor (figur 3 c).
- Stramme 1 sutur løkke omkring hydrogel prøven på voice coil krogen ved at holde begge ender af sutur loop med medicinsk pincet og trække dem samtidigt (figur 3D).
- Gentag trin 3.8 til sløjfen tilsluttet force sensor (figur 3D).
Bemærk: Undgå en ekstrem stramning af suturer at forhindre eventuelle strukturelle skader og tværgående cutting hydrogel prøve. - Stramme sutur sløjfer på bøjninger af hver krog til at forhindre en glidning; Brug disse bøjninger som reference påpeger for at finde nul adskillelse mellem kroge i trin 3.2. Klip de overskydende længder af suturer ved hjælp af medicinsk saks (figur 3D).
- Flytte den vedlagte hydrogel ved hjælp af z-manipulatorer langs z-aksen mod de eksperimentelle kammer at fordybe hydrogel i den eksperimentelle løsning.
- Juster hydrogel prøven i y-z ved hjælp af manipulatorer, således at gelen ikke er under nogen stress.
- Nul force sensor og adskille de to kroge ved hjælp af x-mikrometer stadier indtil gelen begynder at opleve kraft. Når dette sker, lidt vende tilbage mikrometer skrue i x-retning.
- Registrere placeringen af begge manipulatorer til voice coil motor og af sensor og bruge forskellen på disse værdier og dem målt i trin 3.2 til at beregne den nøjagtige adskillelse mellem de tethering kroge i begyndelsen af eksperimentet.
- Angive intervallet for den sløje kurve til ~1.5 - 2 mm og måle gel slæk (figur 4A).
Bemærk: For hver slæk måling, forsøge at holde start af den sløje regime nær den indledende voice coil holdning, giver mulighed for en optimal antallet af datapunkter til at passe de 2 ordninger (figur 4A). Gel længde kan bestemmes med en micron opløsning ved hjælp af adskillelsen mellem krogene og skæringspunktet mellem de 2 ordninger i sløje kurve (Se også trin 5.1). Som force sensor kan glider med tiden på grund af variationer i de eksperimentelle betingelser, tvinge del af den sløje kurve hvor gelen ikke er under rapporter på denne mulige afdrift. Programmet kontrollerer instrumentet kompenserer automatisk for denne forskel, når du sender kommandoen set-punkt til PID loop (figur 4A indsatser).
4. protein-baserede Hydrogel karakterisering ved hjælp af kontrolleret kraft-rampe og konstant-kraft målinger
-
Kraft-rampe eksperimenter
- For at udføre en kraft-rampe cyklus ved at øge styrken på den ønskede belastningsgraden (fx, 0,01 mN/Sørensen), input de starte- og endelig styrker og varigheden af protokollen som et spejlvendt "V". Hold derefter, gel på 0 mN (eller lav kraft) > 200 s at tillade protein domæner til refold og gel elasticitet til at inddrive.
- Gemme sporingen.
-
Konstant-kraft eksperimenter
- Udføre en konstant-force protokol ved at anvende en lav kraft (fx, 0,1 mN) for 30 s og derefter øge kraften på en konstant kraft (f.eks. 1 mN) for et defineret tidsrum (f.eks.120 s), efterfulgt af quenching kraft tilbage til den samme lave værdi (fx, 0,1 mN) til > 300 s at tillade protein domæner til refold og gel elasticitet til at inddrive.
- Efter den første puls, justere indstillingerne PID til at maksimere responstid af feedback loop (Se figur 2D).
Bemærk: For stiv geler og små ændringer i kraft, responstid på løkken er begrænset af elektronik af force sensor og responstid på spolen, og kan være så lav som 5 ms7. For blødere geler og store ændringer i kraft, er svartiden dikteret af elasticiteten i hydrogels (figur 2D). - Gemme sporingen.
5. dataanalyse
- Udnytte den målte adskillelse mellem krogene og den beregnede coil holdning, når gelen begynder at opleve kraft (Δx i figur 4A Indsæt), beregne gel længde L ved hjælp af ligningen:
L = L0 + ∆x
Her er L0 adskillelsen mellem krogene, målt fra placeringen af mikrometer skruer før forsøget (trin 3.14).
Bemærk: For geler med lavt proteinindhold koncentrationer, der ikke resulterer i en komplet cross-linking, ændres den målte længde fra spor til spor. Også, over lange perioder, proteiner inde hydrogels kan opleve aging virkninger25, hvilket resultere i en generel forlængelse af gelen. - Normalisere den målte udvidelse til gel længde for at opnå stammen.
- Normalisere den målte kraft til den tværgående areal ved hjælp af den indvendige diameter af røret bruges til polymerisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser ordningen af photoactive reaktionen bruges til at syntetisere L-EGP/L8 hydrogel. Figur 1B viser hydrogel blandingen i PTFE-røret før og efter photoactivation. Figur 1 c præsenterer den ekstruderet L-eGFP-L8 hydrogel inde en Tris løsning. Eksemplet hydrogel har ingen strukturelle defekter som hak. Hydrogels med klart synlige skader skal kasseres.
Gengivelse af de forsamlede og adskilte visninger af kraft-klemme rheometer præsenteres i figur 2A og 2B. Figur 2 c viser den kraft-klemme rheometer ordningen, hvor eksemplet hydrogel er tøjret mellem krogene tilsluttet den lineære voice-coil og force sensor og nedsænket i en stødpudeopløsning. Den analoge PID system justerer hydrogel udvidelse ved at kontrollere den lineære-voice coil holdning for at følge gældende sætpunkt. Figur 2D viser tuning af PID bruger forskellige intervaller for de integrerende gevinst.
Figur 3 viser en typisk vedhæftede processen med en hydrogel prøve. Efter tethering hydrogel mellem justeret kroge, er sutur loops strammet omkring hydrogel nær bøjninger forhindrer prøven fra at glide og giver mulighed for præcis bestemmelse af hydrogel længde.
Kraft-rampe måling og analyse af Protein-baseret Hydrogels:
Repræsentative målinger af kraft-rampe-protokollen er vist i figur 4A - 4 C. Hver ny pull starter med en slap måling, som vist i figur 4A. Derefter, kraft kurve er opnået ved at anvende en omvendt "V" protokol som belastningen stiger og falder lineært med tid. Bagefter, hydrogel er holdt på et 0 mN kraft for 200 s, at protein domæner inde hydrogel prøven refold (figur 4B). Under stress ændrer PID system filtypenavnet hydrogel repræsenteret ved coil holdning til at følge det foruddefinerede kraft sætpunkt. For hver slæk kurve passer vi 2 linier (fig. 4 c). Den blå linje bruges til at passe det første styre Hvornår hydrogel recoils og den orange linje bruges til at passe regimet, når hydrogel bliver slæk. Skæringspunktet mellem de to linjer bruges til at beregne den sande gel længde med et mikrometer opløsning (figur 4A). Bagefter, er udvidelse af eksemplet hydrogel beregnet ved at fratrække den indledende coil holdning fra coil holdning trace (figur 4D). Figur 4F præsenterer stress-strain kurven. Stress er beregnet ved at dividere den kraft af tværsnitsareal af hydrogel prøven og stammen er beregnet ved at dividere forlængelsen (figur 4E) af den sande gel længde beregnes ud fra den sløje kurve, som præsenteres i figur 4A .
Konstant-kraft måling og analyse af Protein-baseret Hydrogels:
Repræsentative målinger af en konstant-force protokol er vist i figur 5A - 5 D. En konstant kraft af 0,1 mN påføres hydrogel prøve for 30 s, kraften er så ændret til 1 mN for 120 s, og endelig kraften er bratkølet tilbage til 0,1 mN for 300 s at tillade protein domæner til refold (figur 5A). I løbet af de første 30 s på lav kraft, der er ingen bemærkelsesværdige ændringer i filtypenavnet gel. Når stigende kraft til 1 mN, hydrogel viser en fast elastisk forlængelse. Efter denne første udvidelse, holder hydrogel strækker sig over tid, mens du holder kraft konstanten (1 mN). Bagefter, kraften er bratkølet tilbage til den oprindelige lav værdi (0,1 mN) og hydrogel genvinder sin oprindelige længde (figur 5B). Udvidelse af hydrogel prøven (figur 5 c) og kraften, der bruges til at beregne stamme (øverst) og stress (nederst) i en lignende måde som i kraft rampe målinger (fig. 5 d).
Figur 1: L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel syntese. (A) dette panel viser skemaer af en L-eGFP/(L)8 hydrogel proteinsyntesen ved hjælp af en photoactivated reaktion. Proteinet er blandet med APS og [Ru(bpy)3]2 + og udsat for hvidt lys, som fremmer dannelsen af kovalente bindinger mellem tilstødende tyrosin aminosyrer (indsatser). (B) Dette panel viser en L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- og APS-blanding indlæses i en PTFE-røret ved hjælp af en 23 G nålen før eksponering for hvidt lys (øverst) og efter (nederst). (C) Dette panel viser en ekstruderet L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel til en Tris løsning. Indsatsen viser et forstørret billede af en L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel. Diameter distribution er 552 ± 8 μm, i overensstemmelse med den indvendige diameter af PFTE røret bruges under polymerisation (558 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Force-klemme rheometer design og set-up. (A) gengivelse af samlet kraft-clamp hydrogel rheometer. Inset viser en protein-baseret hydrogel prøve knyttet til stemmen spole og tvinge sensor kroge inde løsning kammer. (B) gengivelse af sprængskitse af kraft-clamp hydrogel rheometer: (a - c) x-y-z manipulatorer til justering af voice-coil krog holdning, (d) den lineære voice coil motor, (e) gældende transducer, (f) gældende transducer indehaveren, (g) løsningen kammer, og (h - jeg) x-y manipulatorer for at justere positionen kraft transducer. (C) ordningen af kraft-clamp hydrogel rheometer set-up. Ordningen viser en protein-baseret hydrogel prøve knyttet til en force sensor og voice coil kroge ved hjælp af medicinsk suturer. Den analoge PID system ændringer hydrogel længde ved at justere positionen voice-coil at følge kraft sætpunkt. (D) PID system svar ved hjælp af forskellige integral-gain værdier, (jeg) at nå kraften sæt punkt (stiplet linje). De farvede spor repræsenterer den målte kraft (nederst) og stamme (top) afledt af PID system svar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel vedhæftet fil proces. (A) Close-up Se af en sutur løkke, bundet med en løs dobbelt overhånd knude bruges til at vedhæfte hydrogel prøve at kroge. (B) to sutur loops er placeret på force sensor krog bruges i protein-baserede hydrogel vedhæftet fil. (C) en L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel prøven er hang mellem krogene (angivet med pile). (D) suturen sløjfer på siden af voice coil (venstre) og force sensor krog (til højre) er strammet omkring hydrogel prøven på bøje af hver krog til forhindrer prøven fra at glide under målingerne. Bagefter, er de overskydende suturer trimmet ved hjælp af medicinsk saks (angivet med de røde pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ kraft-rampe måling og data analyse kurver for L-eGFP/(L)8-baseret hydrogel prøven. (A) typisk slæk måling kurve (rød) bruges til at bestemme den nul kraft af force sensor og rigtigt længden af hydrogel. To lineære kurver (blå og de orange linjer) bruges til at passe begge regimer: første, når gelen er under kraft (blå linje), og for det andet, når gel bliver slæk (plateau - orange linje). Skæringspunktet mellem de to linjer bruges til at beregne den sande hydrogel længde på nul kraft. Pilen viser retningen af bevægelse. Indsatsen viser placeringen af den nul kraft og korrektion af hydrogel længde. (B) repræsentative kraft-rampe kurve anvendes til hydrogel prøven. (C) spor der repræsenterer bevægelsen coil position som en funktion af tid. Spolen begynder fra den oprindelige position, defineret i protokol på trin 3.1 (7.5 mm). (D) repræsentative kurve af forlængelsen af hydrogel prøven som en funktion af tiden. Udvidelsen er beregnet som forskydning mellem den målte coil holdning og sin udgangsstilling. (E) repræsentant stamme -versus-tid kurven. Stammen, der beregnes ved at dividere forlængelsen af den sande gel længde beregnes ud fra den sløje måling. (F) repræsentative stress-strain kurven af en hydrogel prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: konstant-kraft måling og data analyse. (A) repræsentative spor af konstant-kraft-protokollen anvendes på en hydrogel. Hydrogel er udsat for 0,1 mN for 30 s, så styrken er øget til 1 mN for 120 s, og endelig kraften er bratkølet tilbage til 0,1 mN for 300 s. (B) dette panel viser en spole position trace versus den tid, der repræsenterer ændringen i længden af h ydrogel prøven efter den gældende protokol. (C) dette panel viser den gel forlængelse målt fra fordrivelse af voice-coil. (D) repræsentative figur af stress (nederst) og stamme spor (top) efter data analysen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri, beskriver vi en kraft-klemme rheometry teknik til at undersøge den biomekaniske svar af små mængder protein-baseret hydrogels. Derudover tilbydes en protokol til at syntetisere en ensartet cylindrisk små mængder protein hydrogel prøve. En protokol er også præsenteret som beskriver hvordan man kan binde forskellige typer af protein-baseret hydrogels med forskellige elasticiteter uden at forårsage nogen mekanisk deformation eller beskadigelse af protein-baserede hydrogel prøver eller forsinkelse af gel på krogene. Den analoge PID system, sammen med den lineære voice coil og force sensor, aktiverer anvendelsen af kontrolleret kraft protokoller såsom kraft rampe og konstant kraft. For nylig, denne teknik er blevet brugt til at studere den biomekaniske svar af forskellige krydsbundet koncentrationer af BSA-baseret hydrogels i forskellige eksperimentelle løsninger7.
Et vigtigt aspekt når formulere og arbejder med protein hydrogels er reproducerbarheden af målingerne. Hvis geler er formuleret med et for lavt proteinkoncentration eller ufuldstændig cross-linking, vises permanent plastisk deformation under forlængelse7. Disse plastisk deformation begrænser drastisk data fortolkning, som viskoelastiske virkninger ville komme fra både domæne udfoldelsen og den molekylære omrokering inde i gelen. En nem test for at se hvis der komplet cross-linking er at fordybe hydrogel i kemiske denatureringsmidler, såsom 6 M guanidinium chlorid1. I dette tilfælde, der ikke bør enhver viskoelastiske effekter i stress -versus-stamme kurver, som alle domæner er udfoldet kemisk, og molekylerne nu opfører sig som simpel polymerer4,7,26. Gel bør desuden genoprette sin oprindelige elasticitet når nedsænket tilbage i den oprindelige buffer7.
Hvis der er variationer i den målte reaktion mellem spor fås med forskellige geler, flere aspekter bør overvejes i forbindelse med fejlfinding: protein sammenlægning i opløsning, en ikke-homogen blanding af protein med den tværbinding kemikalier, tilstedeværelsen af bobler, binding af protein-baserede hydrogel til PFTE røret på grund af forkert silanisering. Restkoncentrationer af silan på tube vægge kan forurene hydrogel og føre til strukturelle mangler. Du kan undgå denne fejl, mere komprimeret luft er nødvendig for at sikre en total fjernelse af silan fra røret. Derudover kan bobler danne under suge af hydrogel photoactive mix i PTFE-røret. Disse bobler kan føre til prøve skader og påvirke hydrogel biomekaniske reaktion. For at forhindre enhver boble-dannelse, slutningen af PTFE-røret skal være inde løsning mix under lastningen og sprøjte stemplet skal trækkes langsomt. En anden typisk fejl er en over stramning af sutur sløjfer omkring hydrogel prøver undervejs vedhæftet fil, som kan føre til en hak dannelse og skæring af hydrogel. Den bevægelige række voice coil begrænser den maksimale forlængelse af vedlagte hydrogel prøven. Denne begrænsning må tages i betragtning ved måling af geler, der strækker sig flere hundrede procent af deres oprindelige længde. For eksempel, hen til forlænge en hydrogel til mere end 200%, er en indledende længde på mindre end 4 mm påkrævet.
Protein-baserede hydrogels er en unik klasse af biomaterialer på grund af deres biokompatibilitet og høj strækbarhed afledt af proteiner, deres hovedbygningen enheder og den iboende folde overgang, der er karakteristisk for proteiner. Derudover har disse hydrogels en fremragende potentiale for vævsmanipulering, drug delivery systems og biologiske blæk (bioink) til 3D udskrivning27. Kraft-clamp hydrogel rheometer kan bruges til at undersøge en lang række proteiner. Derudover muliggør kraft-klemme rheometer anvendelsen af konstant-kraft protokoller på lav-volumen hydrogel prøver. Disse eksperimenter giver mulighed for afkobling af de elastiske og viskoelastiske adfærd og studere (FN) folde mekanik i en bulk tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender finansiel støtte fra forskning vækst Initiative (Award No. 101 X 340), National Science Foundation, store forskning Instrumentation Program (Grant nr. PHY-1626450), større Milwaukee Foundation (Shaw Award) og University of Wisconsin System (anvendt forskning tilskud).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
