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Engineering

Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

Published: August 21, 2018 doi: 10.3791/58280
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

Summary

Eine neue Kraft-Clamp Rheometrie-Technik wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von geringem Volumen Protein-basierten Hydrogel Proben zwischen ein Voice-Coil-Motor und einen Kraftsensor angebunden zu untersuchen. Ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID) System ermöglicht das Spannen der Kraft erfahren, um das gewünschte Protokoll.

Abstract

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie Methode um die biomechanischen Eigenschaften des Protein-basierte Hydrogele zu charakterisieren. Diese Methode verwendet ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID)-System, kontrollierte Kraft Protokolle auf zylindrischen Protein-basierten Hydrogel Proben anwenden, die zwischen einem linearen Schwingspulen-Motor und ein Kraftaufnehmer angebunden sind. Während des Betriebs passt das PID System die Erweiterung der Hydrogel-Probe, eine vordefinierte Kraft-Protokoll zu folgen, durch die Minimierung des Unterschied zwischen der gemessenen und Sollwert. Dieser einzigartige Ansatz zur Protein-basierte Hydrogele ermöglicht das Anbinden der extrem leise Hydrogel Proben (< 5 µL) mit unterschiedlichen proteinkonzentrationen. Unter Kraft-Rampe Protokolle, wo die angelegten Spannung steigt und sinkt linear mit der Zeit, das System ermöglicht die Untersuchung von der Elastizität und Hysterese Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der (un) Faltung von Proteinen und die Messung der standard elastisch und viskoelastische Parameter. Unter konstanter Kraft, wo Kraft Puls eine Schritt-ähnliche Form, die elastische Reaktion aufgrund der Änderung in Kraft, hat ist von der Viskoelastische Antwort, stammt aus Protein-Domäne Entfaltung und umfaltung entkoppelt. Aufgrund seiner geringen Stückzahlen Probe und Vielseitigkeit bei der Anwendung der verschiedenen mechanischen Störungen ist Kraft-Clamp Rheometrie optimiert, um das mechanische Verhalten von Proteinen unter Kraft mit einem Masse-Ansatz zu untersuchen.

Introduction

Abgesehen von einzigartigen physikalischen Eigenschaften Versprechen Protein-basierte Hydrogele revolutioniert Kraft-Spektroskopie von ermöglichen mehrere Milliarden Moleküle in einem "pull", so dass die Untersuchung von Proteinen in überfüllten Umgebungen zu messen, ähnlich denen in Haut und anderen Geweben begegnet. Protein-Domains bleiben gefaltet innen Hydrogele, so dass die Studie ihrer biomechanischen Reaktion zu zwingen, Partner und chemischen Bedingungen verbindlich. Darüber hinaus gleicht die biomechanische Reaktion des Protein-Domänen innerhalb Hydrogele die Antwort mit der Kraft der Einzelmolekül-Spektroskopie Techniken gesehen. Z. B. verringern chemische Denaturierungsmittel und Oxidationsmitteln die Stabilität des zusammengeklappten Zustand, sowohl auf die einzelnen Proteins Domäne Ebene1,2,3 makroskopischen Ebene4,5 , 6 , 7. ebenso osmolyten erhöhen die Stabilität der einzelnen Proteine8,9, führt zu einem Rückgang der Viskoelastische Antwort der Hydrogele, für das gleiche Bedingungen7,10zwingen.

Mehrere Ansätze umgesetzt um synthetisieren Protein-basierte Hydrogele, entweder durch Verwendung von physikalischen Wechselwirkungen11,12 oder kovalente Vernetzung4,13. Kovalente Reaktionen ermöglichen festen Vernetzung Standorten und diese Hydrogele kann den ursprünglichen Zustand auf eine Entfernung von der mechanischen oder chemischen Störungen erholen. Ein erfolgreicher Ansatz für kovalente Vernetzung setzt auf bilden kovalente Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen exponierten Tyrosin Aminosäuren mit Ammonium Bleichen (APS) als Oxidationsmittel und Ruthenium (II) Salz als ein Initiator (Abbildung 1)14. Bei Kontakt mit weißem Licht kann eine Lösung der konzentrierten Proteine in einem Hydrogel verwandelt werden. Durch die Kontrolle bei der Reaktion beginnt, den Protein-APS-Mix in irgendeiner Form Gießen injiziert werden können erlaubt wie Polytetrafluorethylen (CF) Rohre (Abbildung 1 b und 1 C), die Verwendung von eine extrem kleine Lösung Band15. Darüber hinaus die Verwendung von weißem Licht die Vernetzungsreaktion auslösen führt zu einer begrenzten Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und erlaubt die Formulierung von zusammengesetzten Hydrogele mit fluoreszierenden Marker (Abbildung 1). Andere Protein-basierten Hydrogel-Bildung-Methoden verwenden Vernetzung basierend auf dem SpyTag-SpyCatcher kovalenten Wechselwirkungen16, Amin Vernetzung über Glutaraldehyd13oder Biotin-Streptavidin Interaktionen17.

Dynamische mechanische Analyse (DMA) ist derzeit eine Technik intensiv genutzt, um Polymer-basierte Hydrogele13,18zu studieren. Während DMA Konstante Kraft Protokolle auf Biomaterialien anwenden kann, bedarf es Youngs Moduli über 10 kPa und große Probenvolumina von mehr als 200 µL19. Aufgrund dieser Einschränkungen sind in der Regel Protein Hydrogele zu weich, um durch diese Technik untersucht werden. Veränderter Polyproteins sind schwerer als Polymere zu synthetisieren, da sie ein lebendes System zu produzieren erfordern, sind solche hohen Volumina ineffizient, am besten4,15. Darüber hinaus sind die meisten biologischen Gewebe weicher als 10 kPa. Verschiedene Ansätze wurden für biologische Proben, vor allem in der Studie von Muskel Elastizität20,21entwickelt. Diese Techniken können auch arbeiten unter Feedback, um konstante Kraft anwenden, sondern sind optimiert für Proben mit kleinen Durchmessern (im Mikrometerbereich) erzwingen für sehr kurze Zeit ausgesetzt (in der Regel weniger als 1 s).

Protein-basierte Hydrogele wurden erfolgreich mit modifizierten Rheometrie Techniken untersucht. Das Hydrogel Gießen, in eine Ringform ermöglicht zum Beispiel die Verwendung von extensionalen Rheometrie, den Wandel in der erfahrene Kraft als Funktion der Erweiterung4,22messen. Andere Ansätze zur Untersuchung der rheologischen Eigenschaften der Protein-basierte Hydrogele verwenden kontrollierte Schubspannung Rheometrie. Diese Techniken können auch erreichen geringen Probenvolumen und weiche Materialien zu tolerieren. Allerdings zwingt diese Methoden fehlt die Fähigkeit, das ziehen zu imitieren, dass Ursache Protein entfaltet in Vivound Elastizitätsmodul errechnet sich anhand von komplexen Theorien, die verschiedene Annahmen und Korrekturen23erfordern.

Wir haben vor kurzem berichtet, einen neuen Ansatz, der eine kleine Menge von Proteinen, die im Inneren der Rohre mit Durchmessern polymerisiert nutzt < 1 mm. Unsere erste Umsetzung dieser Technik war im Dauer-Clamp-Modus Betrieb wo das Gel nach der gewünschten Protokoll15erweitert wurde. Bei dieser Methode erleben die Proteine eine kontinuierliche Veränderung im Erweiterung und Kraft, während die Domains entfalten, macht die Interpretation der Daten umständlich. Vor kurzem haben wir eine neue Kraft-Clamp Rheometrie Technik, berichtet, wo eine Feedback-Schleife Low-Volume Protein Hydrogele, eine vordefinierte Kraft Protokoll Nr.7 (Abbildung 2) verfügbar gemacht werden können. Ein analoges PID-System vergleicht die Kraft gemessen an dem Kraftsensor mit den Sollwert vom Computer gesendet und passt die Gel-Erweiterung durch die Bewegung der Schwingspule, den Unterschied zwischen den beiden Eingängen zu minimieren. Diese "spannen" der Kraft ermöglicht nun neue Arten von Experimenten, die Biomechanik des Proteins Hydrogele zu messen.

Eine gefesselte Protein Hydrogel Erfahrungen in der Kraft-Rampen-Modus eine Konstante Zunahme und Abnahme der Kraft mit der Zeit. Die PID kompensiert Viskoelastische Verformung durch die Erweiterung auf nichtlineare Weise, je nach Art des Proteins und Hydrogel Formulierung ändern. Der Hauptvorteil der Kraft Rampe ist, dass es erlaubt die Quantifizierung der Standardparameter wie des Elastizitätsmoduls und Energiedissipation durch eine Entfaltung und umfaltung von Protein-Domains.

In konstanter Kraft-Modus ändert die einwirkende Kraft in einem Schritt-wie Mode. In diesem Modus erstreckt sich das Gel und elastisch zusammenzieht, wenn die Kraft erhöht oder, beziehungsweise verringert, gefolgt von einer zeitabhängigen Verformung. Diese Viskoelastische Verformung, statt, während das Gel eine konstante Kraft Erfahrungen bezieht sich direkt auf Domäne Entfaltung/umfaltung. Diese Erweiterung ist auf vereinfachte Weise als das Äquivalent von mehreren Milliarden Einzelmolekül Spuren im Durchschnitt zusammen und auf einmal gemessen zu sehen. Konstanter Kraft Protokolle können verwendet werden, die kriechen und Entspannung des Proteins Hydrogele als Funktion der Zeit und Kraft zu studieren. Als Funktion der Kraft, für BSA-basierte Protein Hydrogele haben wir vor kurzem gezeigt, dass es eine lineare Abhängigkeit zwischen den elastischen und Viskoelastische Ausdehnung und Rückstoß mit dem angewandten Druck7.

Hier zeigen wir den Betrieb einer Kraft-Clamp-Rheometer mit zusammengesetzten Gele, hergestellt aus einer Mischung von Protein L (8 Domänen24, dargestellt als L-8) und ein Protein L-eGFP-Konstrukt (L-eGFP), wodurch die gesamte Hydrogel fluoreszierende und leicht zu zu demonstrieren.

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Protocol

(1) Reagenzien Vorbereitung der Lösung

  1. Bereiten Sie ein Ausgangspunkt Proteinlösung durch Auflösen/verdünnen das Protein des Interesses auf die gewünschte Konzentration, mit einem Tris-Puffer [Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane 20 mM und 150 mM NaCl, pH 7.4].
    Hinweis: Die kleinste Proteinkonzentration für die Vernetzung führt Hydrogele hängt das Protein verwendet und ist in der Regel > 1 mM.
  2. Bereiten Sie Vorräte an Ammonium Bleichen (APS) (1 M) und tris(bipyridine)ruthenium(II)-chlorid ([Ru(bpy)3]2 +) (6,67 mM) Lösungen durch Auflösen von APS und [Ru(bpy)3]2 + Pulver in der Tris-Puffer.

(2) Protein-basierten Hydrogel Synthese

  1. Befestigen Sie 23 G Nadel auf eine 1 mL Spritze mit einer gedrückten Kolben.
  2. Geschnitten Sie ein 10 cm Polytetrafluorethylen (PTFE) Rohr (mit einem Innendurchmesser von 0,022 in und einen Außendurchmesser von 0,044 in), mit einer Rasierklinge. Legen Sie die Nadel und Spritze an einem Ende des PTFE-Schlauch.
  3. Legen Sie das zweite Ende des Rohres in einem Silan-Lösung und füllen Sie das Rohr durch zurückziehen des Spritzenkolbens. Lassen Sie den Schlauch für ~ 30 min.
  4. Die Silan-Lösung entfernen und das Rohr mit Druckluft trocknen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle die Silan-Lösung getrocknet ist und keine Rückstände im Rohr gelassen wird.
  5. Mischen Sie die Proteinlösung mit APS und [Ru (MPJ) 3]2 + in einem 1,5 mL Röhrchen mit einem konstanten Volumen-Verhältnis [z. B.15:1:1 oder 15:0.5:0.5 (V: V: V)].
  6. Wirbel die photoaktiven Lösung, bis es vollständig vermischt ist.
  7. Zentrifugieren Sie die Mischung mit maximaler Geschwindigkeit (z.B. 14.000 x g), eventuell Luftblasen aus der Lösung zu entfernen.
  8. Stecken Sie das offene Ende des behandelten PTFE-Schlauch in die photoaktiven Mischung und zeichnen Sie die Lösung in das Rohr durch zurückziehen des Spritzenkolbens.
  9. Legen Sie die geladene Röhre ~ 10 cm entfernt von einer 100 W-Quecksilber-Lampe zu verhindern, erhitzen und halten ihn dort für bis zu 30 min bei Raumtemperatur (Abbildung 1 b).
    Hinweis: In einigen Fällen kann die Belichtungszeit um Licht werden so niedrig wie 30 S. kürzere Gelierung Mal hier für fluoreszierende Gele eingesetzt, um Immunofluoreszenz begrenzen.
  10. Entfernen Sie den Schlauch von der Nadel und Schnittkanten Sie die des Rohres in der Nähe der Hydrogel endet mit einer Rasierklinge.
  11. Verwenden Sie eine abgestumpften 24 G-Nadel um zu extrudieren Sie das Hydrogel in der Tris-Lösung (Abbildung 1).
    Hinweis: Stumpfen Nadeln sind zu vermeiden, Kerben oder Schäden an der Hydrogel-Probe verwendet.
  12. Überprüfen Sie die Gele für Mängel, die während der Extrusion oder durch Luftblasen bilden und die Gele mit Mängeln zu verwerfen.

(3) Protein-basierten Hydrogel Anhaftung und Kraft-Clamp Rheometer Set-up

  1. Starten Sie das Instrument-Kontroll-Programm. Schalten Sie die Voice-Coil-Motor. Setzen Sie die Spule Position auf einen Wert am Ende des Bereichs (z.B. 7,5 mm).
    Hinweis: Die Schwingspule Position empfiehlt sich gegen Ende des Bereichs maximale Bewegungsfreiheit, um eine mögliche Erweiterung der Hydrogel zu maximieren.
  2. Verdrängen die Haken in der Z-Richtung und richten Sie sie an der Biegung in X-Richtung (das ist die Zugkraft Koordinate; siehe Abb. 2 b). Zeichnen Sie die Werte der Mikrometer Schrauben für die X-Richtung.
  3. 2 sterile Fäden in Strängen gleicher Länge geschnitten (ca. 2-3 cm; siehe Abbildung 3A und B).
  4. Binden Sie eine lose doppelten Überhandknoten in jeden der Stränge und legen Sie die 2 Schlaufen auf der Kraftsensor (Abbildung 3 und 3D) verbunden.
  5. Füllen Sie die experimentelle Kammer mit Tris-Puffer und übertragen Sie die Hydrogel-Probe in die gefüllte Kammer Medizinische Pinzette zu.
  6. Die Schwingspule und Sensor-Haken in der Nähe der Oberfläche der Lösung zu erzwingen und Ausrichten der Haken in alle Richtungen mit dem X/y/Z-Positionierung Manipulatoren.
  7. Pinzette medizinische, hängen beide Seiten der Protein Hydrogel Probe auf die Haken verbunden, die Stimme Spule und Kraftsensor (Abbildung 3).
  8. 1 Naht Schleife um das Hydrogel-Sample auf den Voice Coil-Haken mit beidseitig der Naht-Schleife mit medizinischen Pinzette halten und ziehen sie gleichzeitig anziehen (Abbildung 3D).
  9. Wiederholen Sie Schritt 3,8 für die Schleife mit dem Kraftsensor (Abbildung 3D) verbunden.
    Hinweis: Vermeiden Sie eine extreme Verschärfung der Nähte zu strukturellen Schäden und transversalen Schneiden der Hydrogel Probe zu verhindern.
  10. Ziehen Sie die Naht-Schleifen in den Kurven der einzelnen Haken zu jedem Verrutschen zu verhindern; Verwendung dieser Kurven als Referenz verweist auf um die NULL Trennung zwischen den Haken im Schritt 3.2 zu finden. Schneiden Sie die Überlängen der Nähte mit medizinische Schere (Abbildung 3D).
  11. Verschieben Sie die angefügte Hydrogel mit Z-Manipulatoren entlang der Z-Achse in Richtung der experimentellen Kammer Hydrogel in der experimentellen Lösung eintauchen.
  12. Richten Sie die Hydrogel-Probe im y-Z die Manipulatoren verwenden, so dass das Gel nicht unter Stress.
  13. Den Kraftsensor auf NULL und trennen die beiden Haken mit dem X-Mikrometer inszeniert, bis das Gel beginnt zu Kraft zu erleben. Sobald dies geschieht, etwas zurückdrehen die Mikrometer-Schraube in X-Richtung.
  14. Erfassen Sie die Position der beiden Manipulatoren für die Voice-Coil-Motor und dem Sensor und des Unterschied zwischen diesen Werten und den in Schritt 3.2 gemessen um die genaue Trennung zwischen die Anbindehaltung Haken zu Beginn des Experiments zu berechnen.
  15. Legen Sie den Bereich für den slack Kurve, ~1.5 - 2 mm und Messen Sie die Gel-Flaute (Abb. 4A).
    Hinweis: Für jede schlaffe Messung versuchen Sie, Beginn des locker-Regimes in der Nähe der ersten Stimme Spule Position ermöglicht eine optimale Anzahl von Datenpunkten, die 2 Regime (Abb. 4A) passen. Die Gel-Länge ermittelt werden, mit einer Mikrometer Auflösung über die Trennung zwischen den Haken und den Schnittpunkt zwischen den 2 Regime in den Durchhang Kurve (siehe auch Punkt 5.1). Wie der Kraftsensor mit der Zeit aufgrund von Schwankungen in der experimentellen Bedingungen treiben könnte, die Teil der locker Kurve, wo das Gel nicht unter ist, zwingen Berichte über diese mögliche Drift. Das Programm steuert das Gerät gleicht automatisch für diesen Unterschied beim Senden des Sollwert Befehls an die PID-Schleife (Abbildung 4A Einschub).

(4) Protein-basierten Hydrogel Charakterisierung mittels Kraft-Rampe gesteuert und Konstante Kraftmessungen

  1. Kraft-Rampe Experimente
    1. Um einen Kraft-Rampe Zyklus durch die Erhöhung der Kraft auf die gewünschte raumbelastung (z.B. 0,01 mN/s), geben Sie die Ausgangs- und abschließenden Kräfte und die Dauer des Protokolls als umgedrehten "V". Dann halten Sie das Gel auf 0 mN (oder geringer Kraft) für > 200 s erlauben die Protein-Domänen, zurückfaltung und die Gel-Elastizität zu erholen.
    2. Speichern Sie die Ablaufverfolgung.
  2. Konstanter Kraft Experimente
    1. Ein konstanter Kraft-Protokoll durch eine geringe Kraft (z.B. 0,1 mN) für 30 s und erhöhen Sie dann die Kraft um eine konstante Kraft (z. B. 1 mN) für einen definierten Zeitraum hinweg durchführen (z.B.120 s), gefolgt von abschrecken die Kraft wieder zu den gleichen niedrigen Wert (z.B. 0,1 mN) für > 300 s erlauben die Protein-Domänen, zurückfaltung und die Gel-Elastizität zu erholen.
    2. Nach den ersten Impuls, die Einstellungen PID auf die Reaktionszeit des Feedbacks zu maximieren (siehe Abb. 2D)-Schleife.
      Hinweis: Für steife Gele für kleine Änderungen in Kraft, die Reaktionszeit der Schleife wird durch die Elektronik des Sensors Kraft und die Reaktionszeit der Spule begrenzt und kann so niedrig wie 5 ms7sein. Für weichere Gele und große Änderungen in Kraft wird die Reaktionszeit durch die Elastizität der Hydrogele (Abb. 2D) vorgeschrieben.
    3. Speichern Sie die Ablaufverfolgung.

(5) Datenanalyse

  1. Nutzen die gemessenen Trennung zwischen den Haken und die berechnete Spule Position, wenn das Gel beginnt zu erfahren Kraft (Δx in der Abbildung 4A einzufügen), die Gel-Länge L unter Verwendung der Gleichung zu berechnen:
    L = L0 + ∆x
    L0 ist hier die Trennung zwischen den Haken, gemessen von der Position der Mikrometer Schrauben vor dem Experiment (Schritt 3.14).
    Hinweis: Für Gele mit geringen proteinkonzentrationen, die nicht in eine vollständige Vernetzung führen, ändert sich die gemessene Länge von Spur zu Spur. Auch über lange Zeiträume hinweg könntet Proteine innen Hydrogele Aging Effekte25, führen eine allgemeine Verlängerung des Gels.
  2. Normalisieren Sie die gemessene Ausweitung auf die Gel-Länge, die Belastung zu erhalten.
  3. Normalisieren Sie die gemessene Kraft der transversalen Fläche mithilfe des Innendurchmessers des Rohres zur Polymerisation verwendet.

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Representative Results

Abbildung 1A zeigt das Schema der photoaktiven Reaktion verwendet, um die L-EGP/L8 Hydrogel zu synthetisieren. Abbildung 1 b zeigt die Hydrogel-Mischung in das PTFE-Rohr vor und nach der photoaktivierungen. Abbildung 1 zeigt die extrudierten L-eGFP-L8 Hydrogel innerhalb einer Tris-Lösung. Die Hydrogel-Probe ist keine strukturelle Mängel wie Kerben. Hydrogele mit deutlich sichtbaren Schäden sollten entsorgt werden.

Die Darstellung von den versammelten und Explosionszeichnungen der Kraft-Clamp Rheometer sind in Abbildung 2A und 2 bdargestellt. Abbildung 2 zeigt das Kraft-Clamp Rheometer Schema, wo die Hydrogel-Probe zwischen den Haken an die lineare Schwingspule und dem Kraftsensor angeschlossen und eingetaucht in eine Pufferlösung angebunden. Das analoge PID-System passt die Hydrogel-Erweiterung durch die Kontrolle der linear-Schwingspule Position um den Sollwert Kraft zu folgen. Abb. 2D zeigt das tuning der PID mit verschiedenen Schritten für den integralen Verstärkung.

Abbildung 3 zeigt einen typische Anlage-Prozess einer Hydrogel-Probe. Nach Anbindehaltung Hydrogel zwischen ausgerichteten Haken, sind die Naht Schleifen um das Hydrogel in der Nähe von den Kurven zu verhindern, dass die Probe abrutschen und ermöglicht die genaue Bestimmung der Hydrogel-Länge angezogen.

Kraft-Rampe Messung und Analyse von Protein-basierten Hydrogele:
Repräsentative Messungen des Kraft-Rampe-Protokolls sind in Abbildung 4A - 4 Cdargestellt. Jede neue ziehen beginnt mit einer locker-Messung, wie in Abbildung 4Adargestellt. Dann wird der Kraftverlauf durch ein umgekehrtes "V"-Protokoll anzuwenden, da die Last steigt und linear mit der Zeit sinkt gewonnen. Danach findet das Hydrogel bei einer 0 mN Kraft für 200 s, um die Protein-Domänen innerhalb der Hydrogel-Probe (Abbildung 4 b) Umfalten ermöglichen. Bei Stress ändert das PID-System die Hydrogel-Erweiterung durch die Spule Position zu den vordefinierten Kraft Sollwert folgen dargestellt. Für jede locker Kurve passen wir 2 Linien (Abbildung 4). Die blaue Linie wird verwendet, um das erste Regime passen wenn das Hydrogel schnauft und die orange Linie wird verwendet, um das Regime zu passen, wenn das Hydrogel schlaff wird. Die Kreuzung zwischen den beiden Linien wird verwendet, um die wahre Gel mit einem Mikrometer Auflösung (Abb. 4A) zu berechnen. Danach ist die Verlängerung der Hydrogel-Probe durch Subtraktion der ersten Spule Position aus der Spule Position Ablaufverfolgung (Abbildung 4) berechnet. Abbildung 4F präsentiert die Spannungs-Dehnungs-Kurve. Der Stress wird ermittelt, indem die einwirkende Kraft durch die Querschnittsfläche der Probe Hydrogel und die Belastung wird ermittelt, indem die Erweiterung (Abbildung 4E) durch die wahre Gel Länge berechnet aus der slack-Kurve wie in Abb. 4A präsentiert .

Konstanter Kraft Messung und Analyse von Protein-basierten Hydrogele:
Repräsentative Messungen ein konstanter Kraft-Protokoll erscheinen Abbildung 5A - 5 D. Eine konstante Kraft von 0,1 mN wird angewendet, um die Hydrogel-Probe für 30 s, die Kraft wird dann geändert auf 1 Mio für 120 s und schließlich die Kraft wird abgeschreckt zurück zu 0,1 mN für 300 s, um die Protein-Domänen zu entfalten (Abb. 5A) ermöglichen. Während der ersten 30 s bei geringer Kraft, gibt es keine nennenswerte Veränderung in der Gel-Erweiterung. Wenn die Kraft zu 1 mN zu erhöhen, zeigt das Hydrogel schnell elastische Dehnung. Im Anschluss an diese erste Erweiterung hält das Hydrogel im Laufe der Zeit, wobei die Kraftkonstante (1 mN) erweitern. Danach wird die Kraft zurück zu niedrigen Ausgangswert (0,1 mN) abgeschreckt und Hydrogel erholt sich auf seine ursprüngliche Länge (Abb. 5 b). Die Erweiterung der Hydrogel-Probe (Abbildung 5) und die Kraft dienen zur Berechnung der Belastung (oben) und Stress (unten) in ähnlicher Weise wie bei der Rampe Kraftmessungen (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: L-eGFP/(L)8-basierten Hydrogel Synthese. (A) dieses Panel zeigt die Schaltpläne der eine L-eGFP/(L)8 Hydrogel Proteinsynthese mit einer photoaktiviert Reaktion. Das Protein ist gemischt mit APS und [Ru(bpy)3]2 + und weißes Licht ausgesetzt, das fördert die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen benachbarten Tyrosin Aminosäuren (kleines Foto). (B) Dieses Panel zeigt ein L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- und APS-Mischung in einem PTFE-Schlauch mit einer 23 G Nadel vor der Exposition auf weißes Licht (oben) und nach (unten) geladen. (C) Dieses Panel zeigt eine extrudierte L-eGFP/(L)-8-basierten Hydrogel in einem Tris-Lösung. Der Inset zeigt ein vergrößertes Bild eines L-eGFP/(L)-8-basierten Hydrogel. Die Durchmesser-Verteilung ist 552 ± 8 µm, im Einvernehmen mit dem Innendurchmesser der CF-Röhre während der Polymerisation (558 μm) verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Kraft-Clamp Rheometer Gestaltung und Einrichtung. (A) Darstellung der versammelten Kraft-Clamp Hydrogel Rheometer. Der Ausschnitt zeigt eine Protein-basierten Hydrogel-Probe auf die Stimme beigefügt Spule und Sensor Haken im Inneren der Kammer Lösung zu erzwingen. (B) Darstellung der Explosionszeichnung des Kraft-Clamp Hydrogel Rheometer: (a - c) der X-y-Z -Manipulatoren für die Anpassung der Schwingspule Haken Position, (d) die lineare Schwingspule Motor, (e) die Kraft Wandler, (f) die Kraft Wandler-Halter, (g) die Lösung Kammer und (h - ich) der X-y -Manipulatoren für die Kraft-Wandler-Position einstellen. (C) Regelung des Kraft-Clamp Hydrogel Rheometer Set-up. Das Schema zeigt eine Protein-basierten Hydrogel-Probe an einen Kraftsensor befestigt und Schwingspule Haken mit medizinischen Nähte. Der analogen PID-System ändert die Hydrogel-Länge durch Anpassen der Schwingspule Position um den Sollwert Kraft zu folgen. (D) PID Systemantwort mit verschiedenen Integral-Gain-Werte (ich) um die Kraft zu erreichen-Sollwert (gestrichelte Linie). Die farbigen Spuren repräsentieren die gemessene Kraft (unten) und Stamm (oben) abgeleitet aus der PID-Systemantwort. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: L-eGFP/(L)8-Hydrogel-Anlage-Prozess basiert. (A) Nahaufnahme Anzeigen einer Naht Schleife, gebunden mit einem losen doppelten Overhand Knoten verwendet, um die Hydrogel-Probe an den Haken zu befestigen. (B) die beiden Naht Schleifen befinden sich an den Kraft-Sensor Haken in Protein-basierten Hydrogel Anlage verwendet. (C) ein L-eGFP/(L)8-basierte Hydrogel Probe wird zwischen die Haken (durch die Pfeile angedeutet) gehängt. (D) die Naht Schleifen an der Seite der Schwingspule (links) und der Kraft-Sensor-Haken (rechts) werden um die Hydrogel-Probe an der Biegung des einzelnen Haken an die Probe zu verhindern, dass während der Messungen angezogen. Danach werden die überschüssigen Nähte getrimmt mit medizinische Schere (gekennzeichnet durch den roten Pfeilen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Kraft-Rampe Messung und Daten Analyse Kurven für eine L-eGFP/(L)-8-basierten Hydrogel Probe. (A) typische schlaff Messkurve (rot) verwendet, um die NULL der Kraftsensor und die tatsächliche Länge des Hydrogel bestimmen. Zwei lineare Kurven (die blaue und die orangenen Linien) werden verwendet, um beide Regime passen: Erstens wird das Gel unter die Kraft (blaue Linie), und zweitens, wenn das Gel schlaff (Plateau - orange Linie wird). Die Kreuzung zwischen den beiden Linien wird verwendet, um die wahre Hydrogel bei Null Kraft zu berechnen. Der Pfeil zeigt die Richtung der Bewegung. Der Inset zeigt die Position der Null Kraft und die Korrektur von Hydrogel-Länge. (B) repräsentative Kraft-Rampe Kurve auf die Hydrogel-Probe angewendet. (C) Trace, die Spule Position Bewegung als Funktion der Zeit darstellt. Die Spule beginnt von der ersten Position der im Protokoll festgelegten bei Schritt 3.1 (7,5 mm). (D) repräsentative Kurve der Erweiterung der Hydrogel-Probe als Funktion der Zeit. Die Erweiterung wird als die Verschiebung zwischen dem gemessenen Spule Standpunkt und seine ursprüngliche Position berechnet. (E) Vertreter-Stamm -versus-Zeit-Kurve. Die Belastung errechnet sich durch Division der Erweiterungs durch die wahre Gel Länge aus der schlaff Messung berechnet. (F) repräsentative Spannungs-Dehnungskurve ein Hydrogel-Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: konstanter Kraft Messung und Datenanalyse. (A) repräsentative Spur des Protokolls konstanter Kraft auf ein Hydrogel angewendet. Das Hydrogel unterliegt 0,1 mN für 30 s, dann die Kraft erhöht sich auf 1 mN für 120 s und schließlich die Kraft wird abgeschreckt zurück zu 0,1 mN für 300 S. (B) dieses Panel zeigt eine Spule Spur im Vergleich zu der Zeit repräsentieren die Längenänderung des h position Ydrogel Probe nach dem Kraft-Protokoll. (C) zeigt dieses Fenster die Gel-Erweiterung, gemessen von der Vertreibung von der Schwingspule. (D) repräsentative Zahl von Stress (unten) und Stamm Spuren (oben) nach Analyse der Daten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie-Technik um die biomechanischen Antwort von geringem Volumen Protein-basierte Hydrogele zu untersuchen. Darüber hinaus ist ein Protokoll zur Verfügung gestellt, um eine einheitliche zylindrische Low-Volume-Protein Hydrogel Probe zu synthetisieren. Ein Protokoll wird ebenfalls dargestellt, die beschreibt, wie man verschiedene Arten von Protein-basierten Hydrogele mit unterschiedlichen Elastizitäten zu binden, ohne dass mechanische Verformung oder Beschädigung des Protein-basierten Hydrogel Proben oder Verrutschen des Gels an den Haken. Das analoge PID-System zusammen mit der linearen Schwingspule und dem Kraftsensor ermöglichen die Anwendung kontrolliert Kraft Protokolle wie Kraft Rampe und konstante Kraft. Vor kurzem hat diese Technik verwendet worden, um die biomechanischen Reaktion der vernetzten Konzentrationen von BSA-basierte Hydrogele in verschiedenen experimentellen Lösungen7zu studieren.

Ein wichtiger Aspekt beim formulieren und arbeiten mit Protein Hydrogele ist die Reproduzierbarkeit der Messungen. Wenn Gele mit einem zu niedrigen Proteinkonzentration oder unvollständige Vernetzung formuliert sind, erscheint die bleibende plastische Verformungen bei Verlängerung7. Diese plastischen Verformungen würde die Interpretation der Daten drastisch einschränken, da die viskoelastischen Effekte aus der Domäne Entfaltung und die molekulare Neuordnung innerhalb des Gels kommen würde. Ein einfacher Test, um festzustellen, ob es komplette Vernetzung ist es, das Hydrogel in chemische Denaturierungsmittel, z. B. 6 M Guanidinium Chlorid1einzutauchen. In diesem Fall es sollte keine viskoelastischen Effekte in der Stress -versus-Kurven, belasten, da alle Domains chemisch entfaltet sind, und die Moleküle sind nun als einfache Polymere4,7,26verhält. Darüber hinaus sollte das Gel seine ursprüngliche Elastizität wenn zurück in die ursprünglichen Puffer7eingetaucht erholen.

Gibt es Unterschiede in den gemessenen Reaktion zwischen Spuren erhalten mit verschiedenen Gels, verschiedene Aspekte berücksichtigt werden, für die Fehlersuche: die Proteinaggregation in Lösung, eine nicht-homogene Durchmischung des Proteins mit der Vernetzung Chemikalien, die Anwesenheit von Luftblasen, die Bindung von Protein-basierten Hydrogel mit dem CF-Rohr aufgrund falscher Silanisierung. Rückstände von Silan auf die Rohrwände können verunreinigen das Hydrogel und strukturelle Mängel führen. Um diesen Fehler zu vermeiden, wird mehr Druckluft benötigt, um eine vollständige Entfernung des Silans aus der Tube zu gewährleisten. Darüber hinaus können Luftblasen beim Ansaugen des photoaktiven Hydrogel-Mix in der PTFE-Schlauch bilden. Diese Bläschen können Schäden und beeinträchtigen die biomechanische Antwort von Hydrogel führen. Um eine Blasenbildung zu verhindern, muss zum Jahresende das PTFE-Rohr innen Lösung Mischung während des Ladevorgangs und der Spritzenkolben langsam eingefahren werden muss. Ein weiterer typischer Fehler ist ein überdrehen der Naht Schleifen um die Hydrogel-Proben während der Anlage-Prozess, eine Kerbe-Formation und das Schneiden von Hydrogel führen. Die beweglichen Bereich der Schwingspule begrenzt die maximale Ausdehnung der angehängten Hydrogel Probe. Diese Einschränkung muss berücksichtigt werden, bei der Messung von Gelen, die mehrere hundert erweitern Prozent ihrer ursprünglichen Länge. Zum Beispiel um ein Hydrogel für mehr als 200 % zu verlängern, ist eine Länge von weniger als 4 mm erforderlich.

Protein-basierte Hydrogele sind eine einzigartige Klasse von Biomaterialien aufgrund ihrer Biokompatibilität und hohe Dehnbarkeit abgeleitet Proteine, deren Hauptgebäude Einheiten und der inhärenten klappbare Übergang, die charakteristisch für Proteine. Darüber hinaus haben diese Hydrogele ein hervorragendes Potenzial für Gewebetechnik, Drug Delivery Systeme und biologische Tinte (Bioink) für 3D Druck27. Die Kraft-Clamp Hydrogel Rheometer kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die Kraft-Clamp-Rheometer Anwendungder konstanter Kraft Protokolle bei geringem Volumen Hydrogel Proben. Diese Experimente erlauben die Entkopplung der elastischen und Viskoelastische Verhaltensweisen und (un) Klapp Mechanik in einem Bulk-Ansatz zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir anerkennen die finanziellen Unterstützung von Wachstum Forschungsinitiative (Award Nr. 101 X 340), National Science Foundation, großer Instrumentierung Forschungsprogramm (Grant Nr. PHY-1626450), größere Milwaukee-Stiftung (Shaw Award) und University of Wisconsin System (angewandte Forschung Grant).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SI-KG4A force transducer World Precision Instruments (WPI) SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor Equipement Solutions LFA2010
Bovine serum albumin Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma Sigma-Aldrich T1503-1KG
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-1KG
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride Sigma-Aldrich 544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK Fisher Scientific NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip BD 309628
Silane, Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge Healthcare Supply Pros 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge KIMCO JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp ALB USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
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References

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Engineering Ausgabe 138 Kraft-Clamp Rheometrie Protein-basierte Hydrogele Protein entfaltet unter zwingen zwingen Spektroskopie Biomaterialien Elastizität intelligente Materialien
Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele
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Khoury, L. R., Nowitzke, J., Dahal, N., Shmilovich, K., Eis, A., Popa, I. Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (138), e58280, doi:10.3791/58280 (2018).

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