Summary
Uma nova técnica de rheometrie de força-pinça é usada para investigar as propriedades mecânicas das amostras de hidrogel à base de proteínas de baixo volume, amarradas entre um motor de bobina de voz e um sensor de força. Um sistema analógico de proporcional-integral-Derivativo (PID) permite a fixação da força experiente para o protocolo desejado.
Abstract
Aqui, descrevemos um método de rheometrie força-braçadeira para caracterizar as propriedades biomecânicas de hidrogel à base de proteínas. Esse método usa um sistema analógico de proporcional-integral-Derivativo (PID) para aplicar a força controlada-protocolos em amostras cilíndricas de hidrogel à base de proteínas, que são amarradas entre um motor de bobina de voz linear e um transdutor de força. Durante a operação, o sistema PID ajusta a extensão da amostra hidrogel para seguir um protocolo predefinido de força, reduzindo a diferença entre as forças medidas e set point. Esta abordagem única de hidrogel à base de proteínas habilita o tethering de hidrogel extremamente baixo volume de amostras (< 5 µ l) com concentrações diferentes da proteína. Em protocolos de força-rampa, onde a tensão aplicada aumenta e diminui linearmente com o tempo, o sistema permite o estudo dos comportamentos associados com a dobradura (un) de proteínas e a medição do padrão elástico elasticidade e histerese e parâmetros de viscoelástico. Sob constante-força, onde o pulso de força tem uma passo-como a forma, a resposta elástica, devido à mudança de força, é dissociado da resposta viscoelástica, que vem do domínio da proteína desdobramento e dobrar. Devido ao seu baixo volume de amostra e versatilidade na aplicação de várias perturbações mecânicas, rheometrie força-braçadeira é otimizado para investigar a resposta mecânica das proteínas sob força usando uma abordagem em massa.
Introduction
Além de ter propriedades físicas originais, baseados em proteína hidrogel segura a promessa de revolucionar a espectroscopia de força, permitindo a medição de vários bilhões de moléculas em um 'puxar', possibilitando assim o estudo de proteínas em ambientes aglomerados, semelhantes às encontradas na pele e outros tecidos. Domínios da proteína permanecem dobrados dentro de hidrogel, permitindo o estudo da sua resposta biomecânica para forçar, ligação parceiros e condições químicas. Além disso, a resposta biomecânica de domínios da proteína dentro de hidrogel assemelha-se a resposta vista com técnicas de espectroscopia de força único-molécula. Por exemplo, químicas desnaturantes e agentes oxidantes diminuem a estabilidade do estado dobrado, tanto a proteína único domínio nível1,2,3 e o macroscópico nível4,5 , 6 , 7. da mesma forma, osmólitos aumentam a estabilidade das proteínas único8,9, levando a uma diminuição na resposta de viscoelástico de hidrogel, para a mesma força condições7,10.
Várias abordagens têm sido implementadas para sintetizar hidrogel à base de proteínas, por qualquer um usando interações físicas11,12 ou covalente do cross-linking4,13. Reações covalentes permitam locais fixos do cross-linking e estes hidrogel pode recuperar o estado inicial após a remoção das perturbações mecânicas ou químicas. Depende de uma abordagem bem-sucedida para cross-linking ligações covalentes formando ligações covalentes carbono-carbono entre aminoácidos tirosina expostas, usando persulfato de amónio (APS) como um oxidante e um sal de rutênio (II) como um iniciador (Figura 1)14. Após a exposição à luz branca, uma solução de proteínas concentradas pode ser transformada em um hidrogel. Por meio do controle quando o começa a reação, a mistura de proteína-APS pode ser injetado em qualquer forma de fundição, tais como politetrafluoretileno (PTFE) tubos (figura 1B e 1C), permitindo o uso de uma solução extremamente pequeno volume15. Além disso, o uso de luz branca para desencadear a reação do cross-linking resulta em um branqueamento limitado de proteínas fluorescentes e permite a formulação de hidrogel composto com marcadores fluorescentes (Figura 1). Outros métodos de formação de hidrogel à base de proteínas usam cross-linking baseado na SpyTag-SpyCatcher interação covalente16, amina do cross-linking através do glutaraldeído13ou estreptavidina-biotina interações17.
Análise mecânica dinâmica (DMA) é atualmente uma técnica amplamente utilizada para o estudo baseados em polímeros de hidrogel13,18. Enquanto o DMA pode aplicar força constante protocolos de biomateriais, requer o módulo de Young sobre 10 kPa e amostra de grandes volumes de mais de 200 µ l19. Devido a essas limitações, hidrogel de proteína é geralmente muito mole ser investigado por esta técnica. Como polyproteins engenharia são mais difíceis de sintetizar do que os polímeros, desde que eles exigem um sistema vivo para produzir, tão elevados volumes são ineficientes, as melhores4,15. Além disso, a maioria dos tecidos biológicos são mais macios do que a 10 kPa. Várias abordagens foram desenvolvidas para amostras biológicas, especialmente no estudo do músculo elasticidade20,21. Essas técnicas também pode operar sob o gabarito para aplicar a força constante mas são otimizadas para amostras com pequenos diâmetros (na faixa de mícron) expostos para forçar para muito curto vezes (normalmente menos de 1 s).
Hidrogel à base de proteínas com êxito foram estudadas com técnicas rheometrie modificados. Por exemplo, lançar o hidrogel em forma de anel permite o uso de extensional rheometrie para medir a mudança na força experiente em função da extensão4,22. Outras abordagens para estudar as propriedades reológicas de hidrogel à base de proteínas usam rheometrie de tensão de cisalhamento controlado. Essas técnicas também podem atingir o volume de amostra baixa e tolerar materiais macios. No entanto, estes métodos falta a capacidade de imitar a puxar força que causa proteína desdobramento na vivo, e módulo de Young é calculado com base em teorias complexas que requerem várias suposições e correções23.
Recentemente informamos uma nova abordagem que utiliza um pequeno volume de proteínas, polimerizado dentro de tubos com diâmetros < 1 mm. Nossa primeira aplicação desta técnica estava operando no modo de comprimento-braçadeira, onde o gel foi prorrogado seguindo o protocolo desejado15. Neste método, as proteínas experimentam uma mudança contínua na extensão e força enquanto domínios de desdobram, fazendo a interpretação de dados complicado. Recentemente, informamos uma nova técnica de rheometrie força-braçadeira, onde um laço de realimentação pode expor hidrogel de baixo volume de proteína para um protocolo predefinido força7 (Figura 2). Um sistema PID analógico compara a força medida pelo sensor de força com o set point enviado do computador e ajusta a extensão do gel, movendo a bobina de voz para minimizar a diferença entre as duas entradas. Este 'aperto' da força agora permite novos tipos de experimentos para medir a biomecânica de hidrogel de proteína.
No modo de força-rampa, um proteína ancorada hidrogel experiências um constante aumento e diminuição de força com o tempo. O PID que compensa qualquer deformação viscoelástico alterando a extensão de uma forma não-linear, dependendo do tipo de formulação proteína e hidrogel. A principal vantagem da rampa de força é o que permite a quantificação dos parâmetros padrão, tais como o módulo de Young e dissipação de energia, devido a um desdobramento e dobrar de domínios da proteína.
No modo constante de força, a força aplicada muda de forma passo-como. Neste modo, o gel se estende e contratos elasticamente quando a força é aumentada ou diminuída, respectivamente, seguido por uma deformação dependente do tempo. Esta deformação de viscoelástico, ocorrendo enquanto o gel experimenta uma força constante, está diretamente relacionada ao domínio desdobramento/dobrar. De forma simplificada, esta extensão pode ser vista como o equivalente a vários milhares de milhões de vestígios de única molécula média juntos e medido de uma só vez. Constante-força protocolos podem ser usados para estudar a fluência e relaxamento de hidrogel de proteína em função da força e tempo. Em função da força, para proteína baseada em BSA hidrogel, recentemente mostramos que há uma dependência linear entre o elástico e viscoelástico extensão e recolhimento com a tensão aplicada7.
Aqui detalhamos a operação de um rheometer força-braçadeira usando géis compostos feitos de uma mistura de proteína L (8 domínios24, retratado como L8) e uma construção de proteína L-eGFP (L-eGFP), que torna o hidrogel global fluorescente e fácil demonstre.
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Protocol
1. reagentes preparação de solução
- Prepare uma solução de proteína a partida de dissolução/diluindo a proteína de interesse para a concentração desejada, usando um tampão Tris [20 mM tris (hidroximetil) aminometano e 150 mM de NaCl, pH 7,4].
Nota: A menor concentração de proteína para que leva do cross-linking de hidrogel depende da proteína usada e é tipicamente > 1 mM. - Preparar as existências de persulfato de amónio (APS) (1 M) e cloreto de tris(bipyridine)ruthenium(II) ([Ru(bpy)3]2 +) soluções (6,67 mM) pela dissolução de APS e [Ru(bpy)3]2 + pós no buffer Tris.
2. à base de proteínas Hydrogel síntese
- Corrigi uma agulha 23G em uma seringa de 1 mL com um atuador pressionado.
- Corte um tubo de politetrafluoretileno (PTFE) de 10 cm (com um diâmetro interno de 0,022 em e um diâmetro exterior de 0,044 em) usando uma lâmina de barbear. Anexe a agulha e seringa para uma das extremidades do tubo de PTFE.
- Inserir a segunda extremidade do tubo em uma solução de silano e encha o tubo por retraindo o êmbolo da seringa. Deixe o tubo para ~ 30 min.
- Remover a solução de silano e secar o tubo com ar comprimido.
Nota: Certifique-se que toda a solução de silano é seco e que nenhum resíduo é deixado no tubo. - Misturar a solução de proteína com APS e [Ru (bpy) 3]2 + em um tubo de 1,5 mL, usando uma proporção de volume constante [por exemplo, 15:1:1 ou 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Vórtice a solução fotoativa até é misturado completamente.
- Centrifugue a mistura na velocidade máxima (por exemplo, 14.000 x g) para remover quaisquer bolhas da solução.
- Introduza a extremidade aberta do tubo de PTFE tratada a mistura fotoativa e desenhar a solução no tubo, retraindo o êmbolo da seringa.
- Coloca o tubo carregado ~ 10 cm de uma lâmpada de mercúrio 100 W para evitar aquecê-lo e mantê-lo lá por até 30 min. à temperatura ambiente (figura 1B).
Nota: Em alguns casos, o tempo de exposição à luz pode ser tão baixo quanto 30 s. tempos de gelificação mais curtos são usados aqui para géis fluorescentes, para limitar o fotobranqueamento. - Remover o tubo da agulha e corte as bordas do tubo perto as extremidades de hidrogel com uma lâmina de barbear.
- Use uma agulha 24G embotadas para expulsar o hidrogel para a solução de Tris (Figura 1).
Nota: Blunted agulhas são usadas para evitar qualquer entalhes ou danificar a amostra de hidrogel. - Inspecione visualmente os geles para quaisquer defeitos que possam formar durante a extrusão, ou devido a bolhas e descartar os géis com defeitos.
3. baseados em proteína hidrogel apego e força-braçadeira Rheometer set-up
- Inicie o programa de controle do instrumento. Ligue o motor de bobina de voz. Defina a posição da bobina para um valor no final do intervalo (por exemplo, 7,5 mm).
Nota: Recomenda-se a posição da bobina de voz para ser no final do intervalo máximo movimento, para maximizar a possível extensão do hidrogel. - Deslocar os ganchos na z-direção e alinhá-los na curva no x-direção (ou seja, a coordenada puxa ver Figura 2B). Registre os valores dos parafusos micrômetro para o x-direção.
- Corte 2 suturas estéreis em fios de igual comprimento (2-3 cm; ver Figura 3A e B).
- Amarrar um nó de pescador duplo solto em cada um dos fios e coloque os 2 loops no gancho ligado ao sensor de força (Figura 3 e 3D).
- Encha a câmara experimental com tampão Tris e transferir a amostra de hidrogel para a câmara preenchida usando uma pinça médica.
- Coloque a bobina de voz e forçar ganchos sensor perto da superfície da solução e alinhar os ganchos em todas as direções usando o x/y/z-posicionamento manipuladores.
- Usando uma pinça médica, pendurar os dois lados da amostra hidrogel proteína nos ganchos ligados à voz da bobina e forçar o sensor (Figura 3).
- Aperte 1 laço de sutura ao redor da amostra de hidrogel sobre o gancho de bobina de voz, mantendo ambas as extremidades do laço sutura com pinças médicas e puxá-los simultaneamente (Figura 3D).
- Repita a etapa 3,8 para o loop conectado ao sensor de força (Figura 3D).
Nota: Evite um aperto extremo das suturas para evitar quaisquer danos estruturais e o corte transversal da amostra hidrogel. - Aperte os loops de sutura sobre as curvas de cada gancho para evitar qualquer deslizamento; uso essas curvas como referência aponta para encontrar a zero separação entre os ganchos no passo 3.2. Corte os excesso comprimentos das suturas usando tesouras médicas (Figura 3D).
- Mover o hidrogel anexado usando z-manipuladores ao longo do z-eixo na direção da câmara experimental para imergir o hidrogel na solução experimental.
- Alinhe a amostra de hidrogel em y-z usando manipuladores de tal forma que o gel não está sob algum stress.
- Zero o sensor de força e separar os dois ganchos usando o x-micrômetro estágios até o gel começa a experimentar a força. Uma vez que isso acontece, ligeiramente voltar o parafuso micrométrico no x-direção.
- Gravar a posição de ambos os manipuladores para o sensor e o motor de bobina de voz e usar a diferença entre estes valores e os medidos no passo 3.2 para calcular a exata separação entre os ganchos tethering no início do experimento.
- Defina o intervalo para a curva de folga para ~1.5 - 2 mm e medir a folga do gel (Figura 4A).
Nota: Para cada medição folga, tente manter o início do regime de folga perto da posição de bobina de voz inicial, permitindo um número ideal de pontos de dados para caber os 2 regimes (Figura 4A). O comprimento do gel pode ser determinado com uma resolução de micron usando a separação entre os ganchos e o cruzamento entre os 2 regimes na folga curva (ver também passo 5.1). Como o sensor de força pode ir com o tempo devido a variações nas condições experimentais, a parte da curva de folga, onde o gel não é sob força relatórios sobre essa possível deriva. O programa que controla o instrumento compensa automaticamente esta diferença ao enviar o comando set point para o loop PID (inserirFigura 4A ).
4. à base de proteínas hidrogel caracterização usando força controlada-rampa e medições de força constante
-
Experimentos de força-rampa
- Para executar um ciclo de força-rampa, aumentando a força em regime de carga desejada (por exemplo, mN/s 0,01), entrada de forças inicial e finais e a duração do protocolo como um "V" invertido. Em seguida, segure o gel em 0 mN (ou força baixa) para > 200 s permitir que os domínios da proteína para redobrar e a gel de elasticidade para recuperar.
- Salve o rastreamento.
-
Experimentos de força constante
- Executar um protocolo constante-força aplicando uma força baixa (por exemplo, 0,1 mN) durante 30 segundos e em seguida, aumento da força de uma força constante (por exemplo, 1 mN) para uma quantidade definida de tempo (por exemplo, 120 s), seguido por baixo que extingue a força de volta para o mesmo valor (por exemplo, 0,1 mN) para > 300 s permitir que os domínios da proteína para redobrar e a gel de elasticidade para recuperar.
- Após o primeiro pulso, ajustar as configurações de PID para maximizar o tempo de resposta de feedback loop (ver Figura 2D).
Nota: Para géis rígidos e pequenas alterações em vigor, o tempo de resposta do loop é limitado pela eletrônica do sensor de força e o tempo de resposta da bobina e pode ser tão baixo quanto 5 ms7. Para géis mais suaves e grandes mudanças na força, o tempo de resposta é ditado pela elasticidade do hidrogel (Figura 2D). - Salve o rastreamento.
5. análise de dados
- Utilizando a separação medida entre os ganchos e a posição da bobina calculada, quando o gel começa a experiência de força (Δx em inserção da Figura 4A ), calcular o comprimento de gel L utilizando a equação:
L = L0 + ∆x
Aqui, L0 é a separação entre os ganchos, medido a partir da posição dos parafusos micrômetro antes do experimento (passo 3.14).
Nota: Para géis com concentrações de baixa proteína que não resultam em um cross-linking completa, o comprimento medido mudará de traço a traço. Também, durante longos períodos de tempo, proteínas dentro de hidrogel podem experimentar efeitos de envelhecimento25, que resultam em um alongamento global do gel. - Normalize a extensão medida para o comprimento de gel para obter a tensão.
- Normalize a força medida para a área da superfície transversal usando o diâmetro interno do tubo usado para a polimerização.
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Representative Results
A figura 1A mostra o esquema da reação fotoativa usada para sintetizar o hidrogel de8 L-EGP/L. Figura 1B mostra a mistura de hidrogel no tubo de PTFE, antes e após a fotoativação. A Figura 1 apresenta o hidrogel de8 L-eGFP-L extrudado dentro de uma solução de Tris. A amostra de hidrogel tem sem defeitos estruturais como entalhes. Hidrogel com danos claramente visíveis deve ser descartados.
A renderização de montado e vistas explodidas de rheometer a força-braçadeira são apresentadas na Figura 2A e 2B. Figura 2 mostra o esquema de força-braçadeira rheometer, onde a amostra de hidrogel é amarrada entre os ganchos conectado a bobina de voz linear e o sensor de força e imersos em uma solução tampão. O sistema PID analógico ajusta a extensão de hidrogel, controlando a posição linear-bobina para seguir o ponto de ajuste de força. Figura 2D mostra a afinação do PID usando vários incrementos para o ganho integral.
A Figura 3 mostra um processo acessório típico de uma amostra de hidrogel. Depois de amarrar o hidrogel entre os ganchos alinhados, os loops de sutura estão apertados em torno do hydrogel perto nas curvas para evitar que a amostra deslize e para permitir a determinação precisa do comprimento do hidrogel.
Força-rampa medição e análise de hidrogel à base de proteínas:
Medições representativas do protocolo força-rampa são mostradas na Figura 4A - 4C. Cada novo puxar começa com uma medição de folga, como indicado na Figura 4A. Em seguida, a curva de força é obtida aplicando um protocolo de "V" invertido, já que a carga aumenta e diminui linearmente com o tempo. Depois, o hidrogel é realizada em uma força de 0 mN por 200 s, para permitir que os domínios da proteína dentro da amostra de hidrogel para redobrar (Figura 4B). Durante o estresse, o sistema PID modifica a extensão de hidrogel representada pela posição da bobina a seguir o ponto de ajuste predefinido de força. Para cada curva de folga, o que cabe 2 linhas (Figura 4). A linha azul é usada para ajustar o primeiro regime quando a hidrogel recua e a linha laranja é usado para ajustar o regime quando o hidrogel torna-se folga. A interseção entre as duas linhas é usada para calcular o comprimento de gel de verdade com uma resolução do micrômetro (Figura 4A). Depois disso, a extensão da amostra hidrogel é calculada subtraindo-se a posição inicial da bobina do rastreamento de posição de bobina (Figura 4). Figura 4F apresenta a curva de tensão-deformação. O stress é calculado dividindo-se a força aplicada pela área transversal da amostra hidrogel e a tensão é calculada dividindo-se a extensão (Figura 4E) pelo gel de verdadeiro comprimento calculado a partir da curva de folga conforme apresentado na Figura 4A .
Constante de força-medição e análise de hidrogel à base de proteínas:
Representante de uma força constante-protocolo estão indicadas as medidas em Figura 5A - 5 D. Uma força constante de 0,1 mN é aplicada para a amostra de hidrogel por 30 s, a força é então alterado para 1 mN para 120 s e finalmente, a força é saciada para 0,1 mN por 300 s para permitir que os domínios da proteína redobrar (Figura 5A). Durante os primeiros 30 s na força baixa, não há alteração notável na extensão de gel. Ao aumentar a força de 1 mN, o hidrogel mostra uma extensão rápido elástica. Após esta extensão inicial, o hidrogel continua estendendo ao longo do tempo, mantendo-a constante de força (1 mN). Depois disso, a força é saciada volta para o valor inicial de baixo (0,1 mN) e o hidrogel recupera seu comprimento inicial (Figura 5B). A extensão da amostra hidrogel (Figura 5) e a força são usados para calcular a tensão (em cima) e o stress (inferior) em uma forma similar como as medições de rampa de força (Figura 5).
Figura 1: L-eGFP/(L)8-com base de hidrogel síntese. (A), este painel mostra a planta uma L-eGFP/(L)8 hidrogel da síntese de proteínas usando uma reação fotoativados. A proteína é misturada com APS e [Ru(bpy)3]2 + e expostos à luz branca, que promove a formação de ligações covalentes entre aminoácidos adjacentes tirosina (inserir). (B) Este painel mostra uma L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +-, e APS-mistura carregado em um tubo PTFE usando uma agulha 23G antes da exposição a luz branca (topo) e depois (inferior). (C) Este painel mostra uma extrusão de L-eGFP/(L)8-com base de hidrogel em uma solução de Tris. A inserção mostra uma imagem ampliada de um L-eGFP/(L)8-com base de hidrogel. A distribuição de diâmetro é 552 ± 8 μm, de acordo com o diâmetro interior do tubo PFTE usado durante a polimerização (558 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: força-braçadeira rheometer design e set-up. (A) processamento do rheometer de hidrogel grampo-força montada. O baixo-relevo mostra uma amostra de hidrogel à base de proteínas anexada à voz da bobina e força o sensor ganchos no interior da câmara de solução. (B) processamento da vista explodida da rheometer de hidrogel a força-braçadeira: (a - c) x-y-z manipulators para ajustar a bobina de voz gancho posição, (d) da bobina de voz linear motor, transdutor de (e) a força, (f) a força suporte do transdutor, câmara (g) a solução, e (h - eu) o x-y manipuladores para ajustar a posição do transdutor de força. (C) esquema de afinação rheometer força-braçadeira hidrogel. O esquema mostra um exemplo de hidrogel à base de proteínas, ligado a um sensor de força e ganchos de bobina de voz usando suturas médicas. O sistema PID analógico altera o comprimento de hidrogel ajustando a posição da bobina de voz para seguir o ponto de ajuste de força. Resposta do sistema (D) PID usando diferentes valores de ganho integral (eu) para alcançar a força definir ponto (linha tracejada). Os traços coloridos representam a força medida (inferior) e tensão (topo) derivado a resposta do sistema PID. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: L-eGFP/(L)8-com base em processo de penhora de hidrogel. (A) close-up vista de um laço de sutura, amarrado com um nó de pescador duplo solto usado para anexar a amostra de hidrogel para os ganchos. (B) os dois loops de sutura são colocados sobre o gancho de sensor de força usado em anexo de hidrogel à base de proteínas. (C) um L-eGFP/(L)8-amostra com base de hidrogel é pendurada entre os ganchos (indicados pelas setas). (D) a sutura loops no lado da bobina de voz (à esquerda) e o gancho de sensor de força (à direita) estão apertados em torno da amostra de hidrogel na curva de cada gancho para evitar que a amostra deslize durante as medições. Depois, as suturas em excesso são aparadas com uma tesoura médica (indicada pelas setas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Força representativa-rampa medição e dados análise curvas para um L-eGFP/(L)8-com base em amostra de hidrogel. (A) curva de medição folga típica (vermelho) usada para determinar a força zero do sensor de força e o comprimento real do hidrogel. Duas curvas lineares (o azul e as laranja linhas) são usadas para caber os dois regimes: primeiro, quando o gel está sob força (linha azul) e segundo, quando o gel torna-se folga (linha planalto - laranja). A interseção entre as duas linhas é usada para calcular o comprimento de hidrogel verdadeira força do zero. A seta mostra a direção do movimento. A inserção mostra a localização da força de zero e a correção do comprimento do hidrogel. (B) curva de força-rampa representante aplicada à amostra de hidrogel. (C) Trace representando o movimento de posição de bobina em função do tempo. A bobina começa a partir da posição inicial, definida no protocolo a passo 3.1 (7,5 mm). (D) curva representativa da extensão da amostra hidrogel em função do tempo. A extensão é calculada como o deslocamento entre a posição da bobina medido e sua posição inicial. (E) representante estirpe -versus-curva de tempo. A tensão é calculada dividindo-se a extensão pelo gel de verdadeiro comprimento calculado a partir da medição de folga. (F) a curva de tensão-deformação representativos de uma amostra de hidrogel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: força constante-medição e análise de dados. (A) rastreamento representativa do protocolo constante-força aplicado a um hidrogel. O hidrogel é exposta a 0,1 mN por 30 s e, em seguida, a força é aumentada para 1 mN para 120 s e finalmente, a força é saciada para 0,1 mN para 300 s. (B), este painel mostra uma bobina posição rastreamento versus o tempo que representa a mudança no comprimento do h amostra de ydrogel seguindo o protocolo de força. (C) este painel mostra a extensão de gel, medida a partir do deslocamento da bobina da voz. (D) figura representativa de estresse (inferior) e vestígios de estirpe (topo) após a análise dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos uma técnica de rheometrie de força-braçadeira para investigar a resposta biomecânica de hidrogel à base de proteínas de baixo volume. Além disso, um protocolo é fornecido para sintetizar uma amostra de hidrogel uniforme proteína cilíndrica de baixo volume. Um protocolo também é apresentado o que descreve como amarrar tipos diferentes de hidrogel à base de proteínas com diferentes elasticidades sem causar qualquer deformação mecânica ou dano às amostras de hidrogel à base de proteínas ou deslizamento do gel nos ganchos. O sistema analógico PID, juntamente com a bobina de voz linear e o sensor de força, permitir a aplicação de protocolos de força controlada como rampa de vigor e força constante. Recentemente, esta técnica tem sido usada para estudar a resposta biomecânica de diferentes concentrações de reticulado de hidrogel BSA-baseado em diferentes soluções experimentais7.
Um aspecto importante ao formularem e trabalhando com hidrogel de proteína é a reprodutibilidade das medições. Se geles são formulados com uma concentração de proteína insuficiente ou incompleta do cross-linking, deformações permanentes de plástico serão exibida durante a extensão7. Estas deformações plásticas limitaria drasticamente a interpretação de dados, como os efeitos de viscoelástico é que veio o desdobramento do domínio e o rearranjo molecular dentro do gel. Um teste fácil para ver se lá completar cross-linking é imergir o hidrogel em químicas desnaturantes, como 6m guanidínio cloreto1. Neste caso, não deve haver quaisquer efeitos de viscoelástico no stress -versus-Coe curvas, como todos os domínios são desdobrados quimicamente, e as moléculas agora estão se comportando como polímeros simples4,7,26. Além disso, o gel deve recuperar sua elasticidade inicial quando imerso no buffer inicial7.
Se há variações na resposta medida entre traços obtidos com diferentes géis, vários aspectos devem ser considerados para solução de problemas: a agregação de proteínas em solução, uma mistura não-homogênea da proteína com o cross-linking produtos químicos, a presença de bolhas, a ligação do hidrogel à base de proteínas para o tubo PFTE devido a silanização incorreta. Resíduos de silano nas paredes do tubo podem contaminar o hidrogel e levar a defeitos estruturais. Para evitar esse erro, mais ar comprimido é necessária para garantir a total remoção do silano do tubo. Além disso, as bolhas podem se formar durante a aspiração da mistura fotoativa hidrogel no tubo de PTFE. Essas bolhas podem levar a danos da amostra e afetam a resposta biomecânica do hidrogel. Para evitar qualquer formação de bolha, a extremidade do tubo de PTFE deve estar dentro solução mistura durante o processo de carregamento e o êmbolo da seringa deve ser recolhido lentamente. Outro erro típico é um aperto excessivo das argolas sutura ao redor das amostras de hidrogel, durante o processo de penhora, que pode levar a uma formação de entalhe e corte do hidrogel. A gama movente da bobina de voz limita a extensão máxima da amostra hidrogel anexado. Essa limitação tem que ser levado em conta quando se mede o gel que se estendem a várias centenas por cento de seu comprimento inicial. Por exemplo, para estender um hidrogel para mais de 200%, um comprimento inicial de menos de 4 mm é necessário.
Hidrogel à base de proteínas é uma classe exclusiva de biomateriais, devido à sua biocompatibilidade e alta elasticidade derivados de proteínas, suas unidades do edifício principal e a transição de dobramento inerente que é característico para proteínas. Além disso, estes hidrogel tem um excelente potencial para a engenharia de tecidos, sistemas de distribuição de drogas e tinta biológica (bioink) para impressão 3D27. O rheometer de hidrogel de força-braçadeira pode ser usado para investigar uma grande variedade de proteínas. Além disso, o rheometer força-braçadeira permite a aplicação da força constante-protocolos em amostras de hidrogel de baixo volume. Estas experiências permitem a dissociação dos comportamentos elástico e viscoelástico e estudar mecânica de dobramento (ONU) em uma abordagem em massa.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio financeiro da iniciativa de pesquisa crescimento (prêmio n º 101 X 340), National Science Foundation, programa de instrumentação de pesquisa principais (Grant no. PHY-1626450), maior fundação de Milwaukee (prêmio Shaw) e o sistema de Universidade de Wisconsin (bolsa de pesquisa aplicada).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
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