Summary
새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.
Abstract
여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.
Introduction
독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 '당겨'에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준1,2,3 와 거시적인 레벨4,5 에서 안정성을 감소 , 6 , 7. osmolytes 단일 단백질8,9, 동일한 힘 조건7,10대 hydrogels의 점 탄성 응답 감소로 이어지는의 안정성을 증가 하는 유사 하 게.
중 합성 단백질 기반 hydrogels 구현 되었습니다 몇 가지 방법을 사용 하 여 물리적 상호 작용11,12 또는 공유 상호4,13. 화학식 반응 고정된 가교 위치에 대 한 허용 하 고 이러한 hydrogels 기계적 또는 화학적 섭의 제거에 따라 초기 상태를 복구할 수 있습니다. 화학식 cross-linking를 위한 성공적인 접근 초기자 (그림 1)14는 산화 제와 루 테 늄 (II) 소금으로 암모늄 persulfate (AP)를 사용 하 여 노출 된 티로신 아미노산 사이 화학식 탄소-탄소 유대 형성에 의존 합니다. 하얀 빛에 노출 되 면 집중된 단백질의 해결책은 하이드로 겔으로 설정할 수 있습니다. 제어 하 여 반응을 시작, 단백질-APS 믹스 어떤 주조 형태, 투입 될 수 있는 때 소계 (PFTE) 등 튜브 (그림 1B 및 1 C), 수 있도록 매우 작은 솔루션 볼륨15를 사용 하 여. 또한, 가교 반응을 방 아 쇠를 흰색 빛으로의 사용 제한 표백 형광 단백질의 결과 하며 복합 hydrogels의 정립 형광 마커 (그림 1) 다른 단백질 기반 하이드로 겔 형성 방법 SpyTag SpyCatcher 공유 상호 작용16, 아민 가교 를 통해 도13또는 biotin streptavidin 상호 작용17에 따라 교차 연결을 사용 합니다.
동적 기계적인 분석 (DMA)는 현재 광범위 하 게 폴리머 기반 hydrogels13,18를 공부 하는 기술입니다. DMA 생체 재료에 일정 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다, 하는 동안 10 kPa, 및 이상의 200 µ L19의 큰 샘플 볼륨 영의 계수를 요구 한다. 이러한 제한으로 인해 단백질 hydrogels는 일반적으로이 기술에 의해 조사를 너무 부드러운. 설계 된 polyproteins 때문에 살아있는 시스템 생산에 필요한 고분자, 보다 합성 하 더로 같은 높은 볼륨 효율적, 최고의4,15되지 않습니다. 또한, 대부분의 생물 학적 조직 10 kPa 보다 부드럽고 있다. 몇 가지 방법은 생물 학적 샘플, 근육 탄력20,21연구에서 특히 개발 되었다. 이러한 기술은 또한 지속적인 힘을 피드백에서 동작할 수 있습니다 하지만 아주 짧은 시간 동안 강제로 노출 (미크론 범위)에서 작은 직경을 가진 샘플에 대 한 최적화 (일반적으로 1 s).
단백질 기반 hydrogels 수정된 rheometry 기술로 성공적으로 공부 했다. 예를 들어 반지 모양에는 히드로 주조 확장4,22의 기능으로 경험 있는 힘에 있는 변화를 측정 하기 위해 extensional rheometry 사용 하 여 수 있습니다. 단백질 기반 hydrogels의 유 변 학적 특성을 공부에 대 한 다른 접근 제어 전단 응력 rheometry를 사용 합니다. 이 기술은 또한 낮은 샘플 볼륨을 달성 하 고 부드러운 소재를 용납 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 부족을 당기기 모방 능력 그 원인 단백질 펼쳐진 vivo에서, 고 탄성 계수 다양 한 가정 및23필요로 하는 복잡 한 이론에 따라 계산 됩니다.
우리는 최근 단백질, 직경 튜브 내부 생산의 작은 볼륨을 이용 하는 새로운 접근 방식을 보고 < 1 m m. 이 기술은의 우리의 첫 번째 구현 젤 원하는 프로토콜15다음 확장 했다 길이 클램프 모드에서 운영 했다. 이 방법에서는, 단백질 경험 확장에 힘 연속 변경 도메인 전개 하는 동안 데이터 해석 복잡 하. 최근에, 우리는 새로운 힘-클램프 rheometry 기술, 피드백 루프는 사전 정의 된 힘 프로토콜7 (그림 2) 낮은 볼륨 단백질 hydrogels을 노출할 수 있습니다 보고 있다. 아날로그 PID 시스템 컴퓨터에서 보낸 세트 포인트와 힘 센서에 의해 측정 하는 힘을 비교 하 고 두 입력 간의 차이 최소화 하기 위해 음성 코일을 이동 하 여 젤 확장을 조정 합니다. 힘의이 '죄' 지금 허용 한다 실험의 새로운 유형에 대 한 단백질 hydrogels의 역학을 측정 하기 위하여.
힘-램프 모드에서 속박 되 단백질 히드로 지속적인 증가 시간 강제의 감소를 경험 한다. PID는 단백질 및 하이드로 겔 제제의 종류에 따라 비-선형 방법에 있는 확장명을 변경 하 여 점 탄성 변형에 대 한 보상. 힘 램프의 주요 장점은 그것은 영의 계수는 전개 및 refolding 단백질 도메인의 에너지 소비 등의 표준 매개 변수의 정량화를 허용 한다.
상수-포스 모드에서 적용 된 힘 단계 처럼에서 변경 됩니다. 이 모드에서 젤 확장 계약 탄력적 때 힘 증가 또는 감소, 각각, 시간에 따른 변형에 의해 따라. 이 점 탄성 변형, 젤 지속적인 힘을 경험 하는 동안 일어나는 도메인 전개 refolding와 직접 관련 됩니다. 단순화 된 방법으로,이 확장 몇 십억 단일 분자 추적 함께 평균 하 고 한 번에 측정의 동급으로 볼 수 있습니다. 상수-포스 프로토콜 크 리프 힘 및 시간의 기능으로 단백질 hydrogels의 휴식을 공부 하 고 사용할 수 있습니다. BSA-기반 단백질 hydrogels 위한 힘의 기능으로 우리 최근 나타났습니다 탄성 및 점 탄성 확장 및 적용 된 스트레인7반동 사이 선형 종속성입니다.
여기 우리 힘 클램프 고분자 형광 고 쉽게 전반적인 하이드로 겔을 만드는 단백질 L의 혼합물 (8 도메인24, L8로 묘사) 및 단백질 L eGFP 구문 (L-eGFP)에서 만든 복합 젤을 사용 하 여 작업 세부 사항 보여 줍니다.
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Protocol
1. 시 약 솔루션 준비
- [20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다.
참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다. - Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)3]2 +) APS 용 해 하 여 (6.67 m m) 솔루션 및 Tris 버퍼에서 [Ru(bpy)3]2 + 파우더.
2. 단백질 기반 하이드로 겔 합성
- 누르면된 플런저와 1 mL 주사기에 23 G 바늘을 수정.
- 면도날을 사용 하 여 ()와 함께 0.022의 내부 직경에 0.044의 외부 직경 10 cm 소계 (PTFE) 튜브를 잘라. PTFE 튜브의 한쪽 끝을 바늘과 주사기를 연결 합니다.
- 실 란 솔루션으로 튜브의 두 번째 끝을 삽입 하 고 튜브 주사기 플런저를 축소 하 여 작성. ~ 30 분에 대 한 튜브를 둡니다.
- 실 란 솔루션을 제거 하 고 건조 한 압축 공기 튜브.
참고: 모든 실 란 솔루션은 건조 하 고 아무 잔류물은 튜브에 남아 있는지 확인 합니다. - APS와 [Ru (bpy) 3] 단백질 해결책 혼합2 + 일정 볼륨 비율을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 [예를 들어, 15:1:1 또는 15:0.5:0.5 (v:: v)].
- 그것은 완전히 혼합 될 때까지 광 솔루션 소용돌이.
- (예를 들어, 14000 x g) 솔루션에서 모든 거품을 제거 하는 최대 속도로 혼합 원심
- 광 혼합물으로 치료 PTFE 튜브의 열린 끝을 삽입 하 고 튜브에 주사기 플런저를 제거 하 여 솔루션을 그립니다.
- 로드 튜브가 열을 방지 하 고 실내 온도 (그림 1B)에 최대 30 분 동안 그것을 유지 하는 100 W 수은 램프에서 ~ 10 cm를 놓습니다.
참고: 경우에 따라 빛을 노출 시간 수 30 미는 겔 화 시간 단축에 사용 되며 여기 형광 젤, photobleaching 제한으로 낮은. - 바늘에서 튜브를 제거 하 고 면도날으로 히드로 끝 근처 튜브의 가장자리를 잘라.
- 무딘된 24 G 바늘을 사용 하 여 트리 스 솔루션 (그림 1C)에 히드로 돌출.
참고: 무딘된 바늘은 모든 노치를 피하기 위해 또는 하이드로 겔 샘플을 손상 하는 데 사용 됩니다. - 돌출 하는 동안 또는 거품을 형성 하 고 결함을 가진 젤을 버리고 수도 있는 어떤 결점 든 지 젤을 않았는지 살펴보십시오.
3. 단백질 기반의 히드로 첨부 및 힘-클램프 제가 설정
- 인스트루먼트 컨트롤 프로그램을 시작 합니다. 음성 코일 모터를 켭니다. 값 범위 (예를 들어, 7.5 m m)의 끝으로 코일 위치를 설정 합니다.
참고: 음성 코일 위치는 히드로의 가능한 확장을 최대화 하기 위해 최대 운동 범위의 끝으로 될 것이 좋습니다. - Z에서 후크를 치환-방향 x벤드에 그들을 정렬-방향 (당기 좌표 이며 그림 2B참조). 마이크로미터 나사 x의 값을 기록-방향.
- 2 살 균 봉합 길이가 가닥으로 잘라 (2-3 cm; 그림 3A 및 B참조).
- 각각의 가닥에 느슨한 더블 overhand 매듭 고 힘 센서 (그림 3C 와 3D)에 연결 하는 연결에 2 루프를 배치.
- Tris 버퍼 실험 챔버와 의료 핀셋을 사용 하 여 채워진된 챔버로 하이드로 겔 샘플을 전송.
- 음성 코일 및 놓고, 강제로 솔루션 표면 가까이 센서 후크 모든 방향으로 x를 사용 하 여 후크를 정렬 /y/z-조작자를 위치.
- 의료 핀셋, 기다려 음성에 연결 하는 걸이에 단백질 하이드로 겔 샘플의 양쪽 코일과 센서 (그림 3C)을 강제로 사용 하 여.
- 의료 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고, 동시에 그들을 당기고 하 여 음성 코일에 하이드로 겔 샘플 주위 봉합 루프 1 조입니다 (그림 3D).
- 루프에 대 한 반복 단계 3.8 힘 센서 (그림 3D)에 연결합니다.
참고: 어떤 구조적 손상 및 하이드로 겔 샘플의 횡단 절단을 방지 하기 위해 봉합의 극단적인 강화 하지 마십시오. - 어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 각 연결의 벤드에 봉합 루프를 강화 참고로이 벤드 포인트 제로 구분 단계 3.2에서에서 후크를 찾을 수 사용. 의료가 위 (그림 3D)를 사용 하 여 봉합의 초과 길이 잘라.
- Z를 사용 하 여 연결 된 하이드로 겔 이동- z따라 조작자-실험 솔루션에 히드로 몰입할 실험 챔버 쪽으로 축.
- Y-z 는 젤 하지 어떤 스트레스는 조작자를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 맞춥니다.
- 제로 포스 센서와 x를 사용 하 여 2 개의 후크를 분리-마이크로미터 단계 젤 힘 발생 하기 시작할 때까지. 일단 이것이 일어나면, 약간 되돌릴 마이크로미터 나사 x-방향.
- 음성 코일 모터 및 센서에 대 한 두 컨트롤러의 위치를 기록 하 고 이러한 값과 3.2 단계에서 측정 하는 것 들 사이의 차이 사용 하 여 정확한 실험의 시작에 tethering 후크 구분 계산.
- ~1.5-2 m m로 여유 곡선에 대 한 범위를 설정 하 고 젤 여유 (그림 4A)를 측정 한다.
참고: 여유 각 측정 2 정권 (그림 4A)에 맞게 최적의 수의 데이터 요소에 대 한 허용 초기 음성 코일 위치 근처 여유 정권의 시작을 유지 하려고 합니다. 젤 길이 갈고리와 느슨하게에 2 정권 사이의 교차로 사이의 분리를 사용 하 여 미크론 분해능으로 결정 될 수 있다 곡선 (단계 5.1 참조). 힘 센서는 실험 조건에 있는 변이 때문에 시간 드리프트 수 있습니다로 젤이 없는 아래 여유 곡선의 부분 힘이 가능한 드리프트에 대 한 보고서. 계측기 제어 프로그램 PID 루프 (그림 4A 인세트)를 세트 포인트 명령을 보낼 때 이러한 차이 대 한 자동으로 보정 합니다.
4. 단백질 기반의 히드로 특성 제어 힘 램프를 사용 하 여 상수-힘 측정
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힘-램프 실험
- 힘 램프 주기 원하는 로딩 속도 (예를 들어, 0.01 mN/s)에 힘을 증가 하 여를 수행 하려면 뒤집힌된 "V"로 시작 하 고 마지막 세력 및 프로토콜의 기간을 입력 합니다. 그런 다음 0 미네소타 (또는 낮은 힘) > 200 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 있도록 젤 잡으십시오.
- 추적을 저장 합니다.
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상수-힘 실험
- 정의 된 시간 동안 일정 한 힘 (예를 들어, 1만)에 30 s와 증가 힘에 대 한 낮은 힘 (예를 들어, 0.1 mN)를 적용 하 여 상수-힘 프로토콜을 수행 (예를 들어, 120 s), 뒤에 동일 하 게 다시 힘을 낮은 냉각 값 (예, 0.1 mN) > 300 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 수 있도록.
- 첫 번째 펄스 다음 PID 설정을 조정 하는 피드백의 응답 시간을 최대화 (참조 그림 2D) 루프.
참고: 뻣 뻣 한 젤에 대 한 힘에 작은 변화에 대 한 루프의 응답 시간 힘 센서의 전자와는 코일의 응답 시간에 의해 제한 됩니다 그리고, 5 ms7만큼 낮을 수 있다. 부드러운 젤, 힘에 있는 큰 변화에 대 한 응답 시간이 hydrogels (그림 2D)의 탄성에 의해 결정 됩니다. - 추적을 저장 합니다.
5. 데이터 분석
- 젤 힘 ( 그림 4A 삽입에서 δ x) 경험, 젤 길이 L 방정식을 사용 하 여 계산을 시작 하면 갈고리와 계산 된 코일 위치 측정된 구분 활용 하 여:
L = L0 + ∆x
여기, L0 (단계 3.14) 실험 전에 마이크로미터 나사의 위치에서 측정 후크 사이 분리 이다.
참고: 완전 한 cross-linking 귀착되는 낮은 단백질 농도와 젤에 대 한 측정된 길이 추적 추적에서 변경 됩니다. 또한, 시간의 오랜 기간 동안 hydrogels 내부 단백질 발생할 수 노화 효과25, 젤의 전체 길이에 있는 결과. - 정상화 긴장을 젤 길이 측정된 확장.
- 중 합에 사용 되는 관의 내부 직경을 사용 하 여 횡단 표면에 측정 된 힘을 정상화.
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Representative Results
그림 1A 는 L-£/ L8 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L8 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 게 보이는 손상 Hydrogels 폐기 해야한다.
조립의 렌더링 및 힘-클램프 고분자의 분해 뷰 그림 2A 및 2B에 선물 된다. 그림 2C 하이드로 겔 샘플 선형 음성 코일 및 힘 센서에 연결 된 및 버퍼 솔루션에 후크 사이 곁은 포스 클램프 고분자 구조를 보여 줍니다. 아날로그 PID 시스템 힘 세트 포인트에 따라 선형 음성 코일 위치를 제어 하 여 하이드로 겔 확장을 조정 합니다. 그림 2D 통합 이득에 대 한 다양 한 증가 사용 하 여 PID 튜닝 보여줍니다.
그림 3 히드로 샘플의 전형적인 부착 과정을 보여준다. 정렬된 후크 사이 하이드로 겔을 밧줄로 매기 후 봉합 루프 미 끄 러에서 샘플을 방지 하 고 히드로 길이의 정확한 결정 허용 굴절 근처 히드로 주위 강화 있습니다.
힘-램프 측정 및 단백질 기반 Hydrogels의 분석:
힘-램프 프로토콜의 대표적인 측정은 그림 4A - 4 C에 표시 됩니다. 각 새로운 풀 그림 4A와 같이 느슨하게 측정으로 시작 합니다. 그런 다음 힘 곡선으로 부하 증가 하 고 선형 시간 감소는 거꾸로 한 "V" 프로토콜을 적용 하 여 얻은 것입니다. 이후에 하이드로 겔 200 0 미네소타 힘에 개최 됩니다 (그림 4B) refold를 하이드로 겔 샘플 내부 단백질 도메인 수 있도록 s. 스트레스, 동안 PID 시스템 히드로 확장 사전 정의 된 힘 세트 포인트에 따라 코일 위치 표시를 수정 합니다. 각 여유 곡선에 대 한 우리 맞게 2 라인 (그림 4C). 블루 라인 처음 체제에 맞게 사용는 히드로 여유 되 면 정권 맞게 히드로 recoils와 오렌지 라인 사용 될 때. 두 라인 사이의 교차로 마이크로미터 해상도 (그림 4A)와 진정한 젤 길이 계산 하는 데 사용 됩니다. 그 후, 하이드로 겔 샘플의 연장 코일 위치 추적 (그림 4D)에서 초기 코일 위치를 빼서 계산 됩니다. 그림 4 층 응력-변형 곡선을 선물 한다. 스트레스 하이드로 겔 샘플의 단면적에 의해 적용 된 힘을 분할 하 여 계산 되 고 긴장은 진정한 젤 길이 그림 4A에에서 제시 된으로 여유 곡선에서 계산에 의해 확장 (4E 그림)를 나누어 계산 .
상수-힘 측정 및 단백질 기반 Hydrogels의 분석:
상수-포스 프로토콜의 대표적인 측정에 표시 됩니다 그림 5A - 5 D. 0.1 mN의 일정 힘이 30에 대 한 하이드로 겔 샘플에 적용 s, 힘 120 1 미네소타 변경 다음 s, 그리고 마지막으로, 힘 300 0.1 mN을 다시 침묵 이다 (그림 5A) refold 단백질 도메인을 허용 하는 s. 첫 번째 30 동안 s 낮은 힘에 젤 확장에 주목할 만한 변화가 있다. 1 미네소타 힘을 증가 하는 경우는 히드로 빠른 탄성 확장을 보여 줍니다. 이 초기 확장에 따라는 히드로 유지 시간이 지나면서, 힘 상수 (1만)을 유지 하면서 확장 됩니다. 그 후, 힘 초기 낮은 값 (0.1 mN)으로 다시 침묵 이다 고는 히드로 초기 길이 (그림 5B)에 복구. 하이드로 겔 샘플 (그림 5C)와 힘의 확장은 스트레인 (맨 위) 및 힘 램프 측정 (그림 5D)에서 비슷한 패션에 스트레스 (아래)를 계산 하는 데 사용 됩니다.
그림 1: L-eGFP/(L)8-하이드로 겔 합성을 기반으로. (A)이이 패널 photoactivated 반응 사용 하는 L-eGFP/(L)8 단백질 하이드로 겔 합성의 회로도 보여 줍니다. 단백질은 AP와 혼합 [Ru(bpy)3]2 + 와 인접 한 티로신 아미노산 (삽입 된) 사이 공유 결합의 대형을 승진 시키는 흰 빛에 노출. (B) 는 L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +-,이 패널 표시 및 APS-혼합 노출 하얀 빛 (위), 그리고 (하단) 후 전에 23 G 바늘을 사용 하 여 PTFE 튜브에 로드. (C) 이 패널 표시 압출된 L-eGFP/(L)8-트리 스 솔루션으로 하이드로 겔을 기반으로. 삽입 표시는 L-eGFP/(L)8의 확대 이미지-하이드로 겔을 기반으로. 직경 분포와 중 합 (558 μ m) 중 사용 PFTE 관의 내부 직경 552 ± 8 μ m 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 힘-클램프 고분자 설계 및 설정. (A) 조립된 힘-클램프 하이드로 겔 고분자의 렌더링. 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 목소리에 연결 된 인세트 쇼 코일 및 솔루션 챔버 내부 센서 후크 합니다. (B) 힘-클램프 하이드로 겔 고분자의 분해 뷰 렌더링: (-c) 위치, (d) 선형 음성 코일 모터, (e) 힘 변환기, (f) 힘을 연결 하는 음성 코일을 조정 하기 위한 x-y-z 컨트롤러 트랜스듀서 홀더, (g) 솔루션 챔버, 그리고 (h-나) x-y 조작자 힘 변환기 위치 조정. (C) 체계 힘 클램프 하이드로 겔 고분자 설정입니다. 체계는 힘 센서에 연결 된 단백질 기반 하이드로 겔 샘플을 보여줍니다를 음성 코일 의료 봉합을 사용 하 고 있습니다. 아날로그 PID 시스템 힘 세트 포인트에 따라 음성 코일 위치를 조정 하 여 하이드로 겔 길이 변경 합니다. (D) PID 시스템 응답 (나) 다른 적분 이득 값을 사용 하 여 힘을 도달 하는 포인트 (파선)을 설정 합니다. 색된 추적 측정된 힘 (하단) 나타내고 스트레인 (맨 위)에서 파생 된 PID 시스템 응답. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: L-eGFP/(L)8-히드로 첨부 파일 프로세스를 기반으로. (A) 클로즈업 보기를 고리 하이드로 겔 샘플을 연결 하는 데 사용 느슨한 더블 overhand 매듭으로 묶어 봉합 루프의. (B) 두 봉합 루프 단백질 기반의 히드로 첨부 파일에 사용 된 힘 센서에 배치 됩니다. (C)는 L-eGFP/(L)8-기반으로 하이드로 겔 샘플 후크 (화살표로 표시) 사이 걸려 있다. (D) 봉합 (왼쪽) 음성 코일 측에 루프와 힘 센서 연결 (오른쪽) 샘플 측정 동안 미 끄 러에서 방지 하기 위해 각 연결의 벤드에 하이드로 겔 샘플 주위 강화. 그 후, 초과 봉합 의료가 위 (빨간 화살표 표시)를 사용 하 여 잘립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 힘-램프 측정 및 데이터 분석 곡선 L-eGFP/(L)8-하이드로 겔 샘플을 기반으로. (A) 전형적인 느슨하게 측정 곡선 (레드) 힘 센서의 제로 포스와 실제는 히드로의 길이 결정 하는 데 사용. 두 선형 곡선 (블루와 오렌지 라인) 두 정권 맞게 사용 됩니다: 첫 번째 때 젤 힘 (파란 선), 아래는 젤 여유 (고원-오렌지 라인)을 되 면 두 번째. 두 라인 사이의 교차로 제로 힘에 진정한 히드로 길이 계산 하는 데 사용 됩니다. 화살표는 모션의 방향을 보여 줍니다. 삽입 0 힘의 위치 및 히드로 길이 수정 보여 줍니다. (B) 대표 힘-램프 곡선 하이드로 겔 샘플에 적용. (C) 추적 시간의 기능으로 코일 위치 움직임을 나타내는입니다. 코일 단계 3.1 (7.5 m m)에서 프로토콜에 정의 된 초기 위치에서 시작 합니다. (D) 시간의 기능으로 하이드로 겔 샘플의 확장의 대표적인 곡선입니다. 확장 측정된 코일 위치와 초기 위치로 사이의 변위로 계산 됩니다. (E) 대표 스트레인-대-시간 곡선. 변형 확장 느슨하게 측정에서 계산 하는 진정한 젤 길이 나누어 계산 됩니다. 하이드로 겔 샘플의 (F) 대표 응력-변형 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 상수-힘 측정 및 데이터 분석. (A)는 히드로에 적용 상수-포스 프로토콜의 대표적인 추적입니다. 하이드로 겔 30 0.1 mN에 노출은 s, 다음 힘 120 1 미네소타 증가 s, 그리고 마지막으로, 힘 0.1 mN을 다시 300 미 (B)이이 패널 보여줍니다 코일 위치 추적 대 는 h의 길이에 변화를 나타내는 시간에 대 한 침묵 이다 ydrogel 샘플 힘 프로토콜을 다음입니다. (C)이이 패널은 음성 코일의 변위를 측정 하는 젤 확장을 보여줍니다. (D) 스트레스 (아래)와 데이터 분석 후 스트레인 트레이스 (맨 위)의 대표적인 인물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 방법에 설명 합니다 제공 됩니다. 선형 음성 코일 및 힘 센서, 아날로그 PID 시스템 힘 램프 및 지속적인 힘 등 힘 제어 프로토콜의 응용 프로그램을 사용 합니다. 최근,이 기술은 다른 실험적인 솔루션7에 BSA 기반 hydrogels의 다른 복사해올된 농도의 biomechanical 반응을 하 사용 되었습니다.
공식화 하 고 단백질 hydrogels 작업할 때 중요 한 측면은 측정의 재현성. 젤은 너무 낮은 단백질 농도 또는 불완전 한 cross-linking 공식화 된다, 영원한 플라스틱 개 악 확장7동안 표시 됩니다. 이 플라스틱 개 악 점 탄성 효과 도메인 전개와 젤 내부 분자 재배열에서 온 것으로 데이터 해석을 제한 크게 것 이다. 있는지 쉽게 테스트 완료 거기 cross-linking 화학 denaturants, 6 M guanidinium 염화1에 하이드로 겔을 몰두 하는. 이 경우에, 되지 않습니다 어떤 점 탄성 효과는 스트레스-대에서-모든 도메인을 화학적, 접힌 되지 않습니다 그리고 분자는 지금 간단한 폴리머4,,726으로 행동 곡선, 변형. 또한, 젤의 초기 탄성 때 초기 버퍼7에 다시 복구 해야 합니다.
문제 해결에 대 한 여러 측면을 고려해 야 합니다 다른 젤으로 얻은 흔적 사이의 측정 된 반응에 있는 변화 경우: 단백질 집계는 cross-linking와 단백질의 비 균질 혼합 솔루션 화학 물질, 거품의 존재 때문에 잘못 된 silanization PFTE 튜브에 단백질 기반의 히드로의 바인딩. 튜브 벽에 silane의 잔류물은 히드로 오염 하 고 구조적 결함으로 이어질 수 있습니다. 이 오류를 방지 하려면 더 많은 압축 공기 튜브에서 silane의 총 제거를 보장 하기 위해 필요 합니다. 또한, 거품 PTFE 튜브에 히드로 광 혼합의 흡입 동안 형성할 수 있다. 이 거품 손상 샘플 하 고는 히드로의 biomechanical 응답에 영향을 초래할 수 있습니다. 어떤 거품 형성을 방지 하기 위해 PTFE 튜브의 끝 솔루션 믹스 안에 로드 과정 고 주사기 플런저를 천천히 제거 해야 합니다. 또 다른 일반적인 오류는 꽉 묶는 하이드로 겔 샘플 주위 봉합 루프의 노치 형성과 히드로의 절단으로 이어질 수 있는 첨부 파일 과정 이다. 음성 코일의 이동 하는 범위는 연결 된 하이드로 겔 샘플의 최대 확장을 제한합니다. 이 제한 몇 백을 확장 하는 젤을 측정할 때 고려 되어야 하는 그들의 초기 길이의 백분율. 예를 들어 200% 하이드로 겔을 확장 하려면 미만 4 m m의 초기 길이 필수입니다.
단백질 기반 hydrogels 독특한 생체 재료의 생체 적합성 및 높은 stretchability, 그들의 주요 건물 단위, 단백질과 단백질에 대 한 특성은 고유의 접는 전환에서 파생 된 클래스는. 또한, 이러한 hydrogels 조직 공학, 약물 전달 시스템, 그리고 3D 인쇄27생물 잉크 (bioink)에 대 한 우수한 잠재력이 있다. 힘-클램프 하이드로 겔 고분자 단백질의 큰 다양성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 힘-클램프 고분자의 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 상수-힘 프로토콜 응용 프로그램 수 있습니다. 이러한 실험 탄성 및 점 탄성 행동을 분리 하 여 허용 하 고 대량 접근에 (유엔) 접는 역학 공부.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구 성장 이니셔티브 (보너스 번호 101 X 340), 국립 과학 재단, 주요 연구 계측 프로그램 (부여 번호 로부터 재정 지원을 인정합니다 PHY-1626450), 더 큰 밀워키 재단 (쇼 수상)와 위스콘신 대학 시스템 (응용된 연구 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
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