Summary
En ny kraft-klemme rheometry teknikk brukes til å undersøke de mekaniske egenskapene av lavt volum protein-basert hydrogel prøver bundet mellom en talespole motor og en kraft-sensor. En analog proporsjonal-integrert-derivat (PID) systemet tillater 'klemmekraften"av force erfarne til ønsket protokollen.
Abstract
Her beskriver vi en kraft-klemme rheometry metode for å beskrive egenskapene biomekaniske protein-basert hydrogels. Denne metoden bruker et analogt proporsjonal-integrert-derivat (PID) system bruke kontrollert-force protokoller på sylindriske protein-basert hydrogel prøver, som er bundet mellom en lineær talespole motor og en force svinger. Under drift justerer PID systemet forlengelse av hydrogel prøven å følge en forhåndsdefinert kraft-protokollen ved å minimere forskjellen mellom den målte og set-punktet styrker. Denne unike tilnærming til protein-basert hydrogels gir deling av ekstremt lavt volum hydrogel prøver (< 5 µL) med annet protein konsentrasjoner. Under kraft-rampen protokoller, der anvendt stress øker og reduseres lineært med tid, systemet muliggjør studiet av elastisitet og hysteresis atferd tilknyttet (FN) folding av proteiner og måling av standard elastisk og viskoelastiske parametere. Under konstant-force, der kraft pulsen har en trinn-lignende figur, elastisk svaret, grunn til endringen i kraft, er avparet fra viskoelastiske svaret, som kommer fra protein domene Utfolding og refolding. P.g.a. lav-volum utvalg og allsidighet i å søke ulike mekaniske forstyrrelser, er kraft-klemme rheometry optimalisert for å undersøke mekanisk respons på proteiner under kraft med en bulk tilnærming.
Introduction
Tillegg unike fysiske egenskaper, holder protein-basert hydrogels løftet om revolusjonerende kraft spektroskopi ved å aktivere måling av flere milliarder molekyler i en "pull", dermed muliggjør studiet av proteiner i overfylte miljøer lik de i hud og andre vev. Protein domener forblir foldet i hydrogels, slik at studiet av deres biomekaniske Svar å tvinge, bindende partnere og kjemiske forhold. I tillegg ligner biomekaniske responsen av protein domener i hydrogels svaret sett med single-molekylet force spektroskopi teknikker. For eksempel redusere kjemiske denaturants og Oksiderende stoffer stabiliteten på brettet staten, både på enkelt protein domenet nivå1,2,3 og på makroskopisk nivå4,5 , 6 , 7. tilsvarende osmolytes øke stabiliteten av enkelt proteiner8,9, fører til en reduksjon i viskoelastiske svaret av hydrogels, for det samme tvinge forhold7,10.
Flere tilnærminger har blitt implementert for å syntetisere protein-basert hydrogels, enten ved hjelp av fysisk interaksjon11,12 eller kovalente cross-linking4,13. Kovalente reaksjoner tillater faste cross-linking steder og disse hydrogels kan gjenopprette den opprinnelige tilstanden på en fjerning av mekanisk eller kjemikalie forstyrrelser. En vellykket tilnærming for kovalente cross-linking er avhengig av danner kovalente karbon-karbon obligasjoner mellom synlige tyrosin aminosyrer med ammonium persulfate (APS) som en oksiderende og en ruthenium (II) salt som en initiativtaker (figur 1)14. Ved eksponering til hvitt lys, kan en løsning av konsentrert proteiner bli forvandlet til en hydrogel. Ved å kontrollere når den reaksjon starter, protein-APS blandingen kan injiseres i støping skjemaer, tillater som polytetrafluoroethylene (PFTE) rør (figur 1B og 1 C), bruk av en ekstremt liten løsning volum15. Videre bruk av hvitt lys utløse cross-linking reaksjon resulterer i en begrenset bleking fluorescerende proteiner og lar utformingen av sammensatte hydrogels med fluorescerende indikatorer (figur 1). Andre protein-basert hydrogel formasjon metoder bruke cross-linking basert på SpyTag-SpyCatcher kovalente samhandling16, Amin cross-linking via glutaraldehyde13eller biotin-streptavidin vekselsvirkningene17.
Dynamisk mekanisk analyse (DMA) er en teknikk som er mye brukt til å studere polymer-baserte hydrogels13,18. Mens DMA kan gjelde konstant force protokoller for biologisk materiale, krever det Youngs moduli over 10 kPa og stort utvalg volum mer enn 200 µL19. På grunn av disse begrensningene er protein hydrogels for myk undersøkes av denne teknikken. Som utviklet polyproteins er vanskeligere å syntetisere enn polymerer, siden de krever en levende system å produsere, er slike høyt volum ineffektivt, beste4,15. Videre er de fleste biologiske vev mykere enn 10 kPa. Flere tilnærminger ble utviklet for biologiske prøver, spesielt i studiet av muskel elastisitet20,21. Disse teknikkene kan også operere under tilbakemelding til bruk konstant kraft men er optimalisert for prøver med liten diameter (i området mikron) utsatt for å tvinge for svært kort tid (vanligvis mindre enn 1 s).
Protein-basert hydrogels ble vellykket studert med endrede rheometry teknikker. For eksempel tillater støping av hydrogel i ringen form bruk av extensional rheometry å måle endringen i den erfarne kraften som en funksjon av filtypen4,22. Andre tilnærminger for å studere reologiske egenskapene til protein-basert hydrogels bruke kontrollert skjær-stress rheometry. Disse teknikkene kan oppnå lav eksempel volum og tolerere myke materialer. Men disse metodene manglende evne til å etterligne trekke styrker som årsak protein utspiller seg i vivo, og Youngs modul beregnes basert på komplekse teorier som krever ulike forutsetninger og korrigeringer23.
Vi har nylig rapportert en ny tilnærming som bruker en liten mengde proteiner, polymerized inni rør med diameter < 1 mm. Første implementeringen av denne teknikken var opererer i lengde-klemme modus, hvor gel ble utvidet etter ønsket protokollen15. I denne metoden oppleve proteiner en kontinuerlig endring i både utvidelse og styrke mens domenene utfolder seg, gjør data tolkningen tungvint. Vi har nylig rapportert en ny kraft-klemme rheometry teknikk, hvor en feedback loop kan utsette lavt volum protein hydrogels til en forhåndsdefinert force protokollen7 (figur 2). En analog PID systemet sammenligner styrken målt ved kraft-sensor med settpunkt sendes fra datamaskinen og justerer gel filtypen ved å flytte talespole å redusere forskjellen mellom de to inngangene. Denne 'clamping' av force nå innrømmer for nye typer eksperimenter å måle biomekanikk av protein hydrogels.
I kraft-rampen modus opplever en bundet protein hydrogel en konstant økning og reduksjon av makt med tid. PID kompenserer for alle viskoelastiske deformasjon ved å endre filtypen i en ikke-lineær måte, avhengig av protein og hydrogel formulering. Den største fordelen med kraften rampen er at det tillater kvantifiseringen standard parametere som Youngs modul og energi ødsling, en utfoldelse og refolding av protein domener.
I konstant-force-modus, brukes kraft endringer i en trinn-aktig måte. I denne modusen gel utvides og kontrakter elastisk når kraften økes eller reduseres, henholdsvis, etterfulgt av en tidsavhengige deformasjon. Denne viskoelastiske deformasjon, finner sted mens gel opplever en konstant styrke, er direkte relatert til domenet unfolding/refolding. I en forenklet måte, kan denne utvidelsen sees som tilsvarer flere milliarder ett molekyl spor gjennomsnitt sammen og målt på en gang. Konstant-force protokoller kan brukes til å studere krype og avslapning av protein hydrogels som en funksjon og tid. Som en funksjon av force for BSA-basert protein hydrogels, har vi nylig vist at det er en lineær avhengighet mellom elastisk og viskoelastiske og rekyl med anvendt belastning7.
Her detalj vi bruk av et force-klemme rheometer bruker sammensatte gels laget av en blanding av protein L (8 domener24, som L8) og en protein L-eGFP konstruksjon (L-eGFP), som gjør det totale hydrogel fluorescerende og lett å vise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser løsning forberedelse
- Forberede en start protein løsning oppløsning/fortynne protein av interesse for den ønskede konsentrasjonen, bruker en Tris buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane og 150 mM NaCl, pH 7.4].
Merk: Den minste protein konsentrasjonen for hvilke cross-linking fører til hydrogels avhenger av protein brukes og er vanligvis > 1 mM. - Forberede bestander av ammonium persulfate (APS) (1 M) og tris(bipyridine)ruthenium(II) fra ([Ru(bpy)3]2 +) (6,67 mM) løsninger av oppløsende APS og [Ru(bpy)3]2 + pulver i Tris bufferen.
2. protein-basert Hydrogel syntese
- Fikse en 23 G nål på 1 mL sprøyte med en presset stempelholderen.
- Skjær en 10 cm polytetrafluoroethylene (PTFE) rør (med en diameter på 0.022 i og en ytre diameter på 0.044 i) med et barberblad. Fest sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer til den ene enden av PTFE tube.
- Sett den andre enden av røret til en silane løsning og fylle røret ved trekke sprøytestempelet. La røret for ~ 30 min.
- Fjerne den silane løsningen og tørr røret med trykkluft.
Merk: Kontroller at alle silane løsningen er tørket og at ingen rester som er igjen i røret. - Bland protein løsningen med APS og [Ru (bpy) 3]2 + i en 1,5 mL tube med en konstant volumkontrollen [f.eks15:1:1 eller 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Vortex fotoaktive løsningen før den er blandet helt.
- Sentrifuge blandingen med maksimal hastighet (f.eks, 14.000 x g) fjerne bobler fra løsningen.
- Sett inn den åpne enden av behandlet PTFE tube i fotoaktive blandingen og tegne løsningen inn i røret ved å trekke sprøytestempelet.
- Sett lastet røret ~ 10 cm fra en 100 W kvikksølv lampe å hindre varme den og holde den der i opptil 30 min ved romtemperatur (figur 1B).
Merk: I noen tilfeller eksponeringstid lys kan være så lite som 30 s. kortere gelation ganger brukes her for fluorescerende geleer, begrense photobleaching. - Fjerne røret fra nålen og kuttet kantene på røret nær hydrogel ender med et barberblad.
- Bruk en avstumpet 24 G nål extrude hydrogel Tris løsning (figur 1 c).
Merk: Avstumpet nåler brukes til å unngå noen hakk eller skade hydrogel prøven. - Visuelt inspisere geléer for eventuelle feil som kan danne under byggesystemer eller bobler og forkaste gels med feil.
3. protein-basert Hydrogel feste og kraft-klemme Rheometer oppsett
- Start apparatet kontroll programmet. Slå på talespole motoren. Angi coil plasseringen til en verdi mot slutten av området (f.eks, 7,5 mm).
Merk: Talespole posisjonen anbefales å være mot slutten av maksimal bevegelse området ved å maksimere mulig forlengelse av hydrogel. - Fortrenge kroker i z-retningen og justere dem i svingen i x-retningen (som er trekke koordinatet, se figur 2B). Registrere verdier mikrometer skruene for x-retningen.
- 2 sterile suturer skjære tråder like lange (2-3 cm, se figur 3A og B).
- Knytte en løs dobbel halvstikk knuten til hver av tråder og plassere de 2 løkkene på kroken koblet til kraft-sensor (Figur 3 c og 3D).
- Fyll den eksperimentelle kammeret med Tris buffer og overføre hydrogel prøven i fylt kammeret ved hjelp av medisinsk pinsett.
- Plasser talespole og tvinge sensor kroker nær løsning overflaten og justere kroker i alle retninger med x/y/z-posisjonering manipulators.
- Ved hjelp av medisinsk pinsett, henge begge sider av protein hydrogel prøven på krokene koblet til stemmen coil og tvinge sensor (Figur 3 c).
- Trekk 1 Sutur sløyfe rundt hydrogel prøven på stemme coil kroken ved å holde begge ender av Sutur loop med medisinsk pinsett og trekke dem samtidig (figur 3D).
- Gjenta trinn 3.8 for løkken koblet til kraft-sensor (figur 3D).
Merk: Unngå en ekstrem innstramming av bildet hindre at strukturell skade og tverrgående kutting av hydrogel prøven. - Stram Sutur løkker på bøyer av hver krok å hindre noen glidning; Bruk disse svinger som referanse poeng for å finne null avstanden mellom krokene i trinn 3.2. Kutt overflødig lengden på bildet ved hjelp av medisinsk saks (figur 3D).
- Flytte den vedlagte hydrogel bruke z-manipulators langs z-aksen mot eksperimentelle kammeret å fordype hydrogel i eksperimentell løsningen.
- Juster hydrogel prøven i y-z bruke manipulators slik at gel ikke er under noen stress.
- Null kraft-sensor og skille to kroker med x-mikrometer etapper til gel begynner å oppleve kraft. Når dette skjer, litt slå tilbake mikrometer skruen i x-retningen.
- Registrere plasseringen av både manipulators for stemme coil motoren og sensoren og bruke forskjellen mellom disse verdiene og de måles i trinn 3.2 til å beregne nøyaktige avstanden mellom tethering kroker i begynnelsen av eksperimentet.
- Angi området for slakk kurven til ~1.5 - 2 mm og måle gel slakk (figur 4A).
Merk: For hver slakk måling, prøv å holde starten av slakk regimet nær første stemme coil plassering, slik at for et optimalt antall datapunkt å passe de 2 regimene (figur 4A). Gel lengde kan fastsettes med en mikron oppløsning bruker avstanden mellom krokene og skjæringspunktet mellom de 2 regimene i slakk kurven (se trinn 5.1). Som kraft-sensor kan drive tid på grunn av variasjoner i eksperimentelle forhold, tvinge delen av slakk kurven hvor gel ikke er under rapporter på dette mulig drift. Programmet kontrollerer instrumentet kompenserer automatisk for denne forskjellen når du sender kommandoen set-punktet til PID loop (figur 4A innfelt).
4. protein-basert Hydrogel karakterisering ved hjelp av kontrollert kraft-rampen og konstant-Force målinger
-
Force-rampen eksperimenter
- For å utføre en kraft-rampen syklus ved å øke styrken på det ønskede overføringshastighet (f.eks, 0,01 mN/s), kan du angi de første og siste styrkene og varigheten av protokollen som en snudd "V". Deretter hold gel på 0 mN (eller lav makt) > 200 r å tillate protein domenene som refold og gel elastisitet gjenopprette.
- Lagre spor.
-
Konstant-force eksperimenter
- Utføre en konstant-force-protokollen ved å bruke en lav styrke (f.eks, 0.1 mN) for 30 s og deretter øke styrken til en konstant styrke (f.eks 1 mN) for en definert tidsperiode (f.eks120 s), etterfulgt av slukke styrken tilbake til den samme lave verdi (f.eks, 0.1 mN) for > 300 s tillate protein domenene som refold og gel elastisitet gjenopprette.
- Etter den første pulsen, justere PID å maksimere responstid for tilbakemelding (se figur 2D).
Merk: Stiv gels og små endringer i kraft, responstid for løkken er begrenset av elektronikken av kraft-sensor og responstid for spolen, og kan være så lavt som 5 ms7. Mykere gels og store endringer i kraft, er responstiden diktert av elastisitet i hydrogels (figur 2D). - Lagre spor.
5. analyse
- Utnytte målt avstanden mellom krokene og den beregnede coil plasseringen, når gel begynner å oppleve styrke (Δx i sett inn figur 4A ), beregne hvor gel L ved hjelp av formelen:
L = L0 + ∆x
Her er L0 avstanden mellom krokene, målt fra stillingen mikrometer skruene før eksperimentet (trinn 3.14).
Merk: For gels med lav protein konsentrasjoner som ikke resultere i en komplett cross-linking, den oppmålte lengden vil endre fra spor til spor. Også over lengre tid, kan proteiner i hydrogels oppleve aldring effekter25, som resulterer i en generell forlengelse av gel. - Normalisere målt filtypen til hvor gel å få belastningen.
- Normalisere målt styrken til tverrgående arealet ved hjelp av den indre diameteren på røret brukes for polymerisasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser ordningen med fotoaktive reaksjonen brukes å syntetisere L-EGP/L8 hydrogel. Figur 1B viser hydrogel blandingen i PTFE tube før og etter photoactivation. Figur 1 c presenterer ekstrudert L-eGFP-L8 hydrogel inne en Tris løsning. Hydrogel utvalget har ingen strukturelle feil som hakk. Hydrogels med synlig skade bør forkastes.
Gjengivelse av forsamlingen og eksplodert synspunkter av kraft-klemme rheometer presenteres i figur 2A og 2B. Figur 2C viser kraft-klemme rheometer ordningen, der hydrogel prøven er bundet mellom krokene koblet til den lineære talespole og kraft-sensor og midt i en buffer løsning. Analoge PID systemet justerer hydrogel filtypen ved å kontrollere lineær-talespole plasseringen å følge settpunkt kraft. Figur 2D viser tuning av PID bruker ulike intervaller for integrert gevinst.
Figur 3 viser en typisk vedlegg prosess i en hydrogel utvalg. Etter tilkobling hydrogel mellom justert kroker, strammes Sutur løkkene rundt hydrogel nær Bend å forebygge prøven sklir og tillater presist fastsettelsen av hydrogel lengden.
Force-rampen måling og analyse av Protein-basert Hydrogels:
Representant målinger av protokollen for kraften rampen er vist i figur 4A - 4 C. Hver nye trekk starter med en slakk måling, som vist i figur 4A. Deretter oppnås styrke kurven ved å bruke en omvendt "V"-protokoll som belastningen øker og reduseres lineært med tid. Etterpå hydrogel holdes på en 0 mN kraft for 200 s, slik at protein domenene i hydrogel prøve å refold (figur 4B). Under stress endrer PID systemet hydrogel forlengelsen representert av coil posisjonen å følge settpunkt forhåndsdefinerte kraft. For hver slakk kurve passer vi 2 linjer (figur 4C). Den blå linjen brukes til å passe det første regimet når hydrogel recoils og den oransje linjen brukes til å passe regimet når hydrogel blir slakk. Skjæringspunktet mellom de to linjene brukes til å beregne hvor sant gel med en mikrometer oppløsning (figur 4A). Etter beregnes utvidelsen av hydrogel prøven ved å trekke første coil posisjonen fra coil posisjon spor (Figur 4 d). Figur 4F presenterer stress-belastning kurven. Stress beregnes ved brukte makt fra tverrsnitt område av hydrogel prøven og belastningen beregnes ved forlengelse (figur 4E) av ekte gel lengden beregnet fra slakk kurven som presentert i figur 4A .
Konstant-force måling og analyse av Protein-basert Hydrogels:
Representant målinger av en konstant-force protokoll vises i figur 5A - 5 D. En konstant av 0,1 mN kraft til hydrogel utvalget for 30 s, kraften deretter endres til 1 mN for 120 s, og til slutt, kraften er slukket tilbake til 0.1 mN for 300 s tillate protein domenene som refold (figur 5A). I løpet av de første 30 s på lav makt, det er ingen merkbar endring i gel forlengelsen. Når økende styrken til 1 mN, viser hydrogel filtypen fast elastisk. Etter denne første utvidelse, holder hydrogel strekker seg over tid, mens force konstant (1 mN). Etterpå styrken er slukket tilbake til den opprinnelige lave verdien (0,1 mN) og hydrogel gjenoppretter til den opprinnelige lengden (figur 5B). Utvidelsen av hydrogel prøven (figur 5C) og force brukes til å beregne påkjenningen (øverst) og stress (nederst) på en lignende måte som i kraft rampen målinger (figur 5 d).
Figur 1: L-eGFP/(L)8-basert hydrogel syntese. (A) dette panelet viser skjematisk av en L-eGFP/(L)8 hydrogel proteinsyntese ved hjelp av en photoactivated reaksjon. Proteinet er blandet med APS og [Ru(bpy)3]2 + og utsatt for hvitt lys, som fremmer dannelsen av kovalente bindinger mellom tilstøtende tyrosin aminosyrer (innfelt). (B) Denne siden viser en L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- og APS-blanding lastet inn en PTFE tube bruker en 23 G nål før eksponering hvitt lys (øverst) og etter (nederst). (C) Dette panelet viser ekstruderte L-eGFP/(L)8-basert hydrogel til en Tris løsning. Rammemargen viser et forstørret bilde av en L-eGFP/(L)8-basert hydrogel. Diameter fordelingen er 552 ± 8 μm, med indre diameter av PFTE rør brukes under polymerisasjon (558 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Force-klemme rheometer utforming og oppsett. (A) gjengivelse av samlet styrke-klemme hydrogel rheometer. Innfelt viser en protein-basert hydrogel prøve knyttet til stemmen coil og tvinge sensor kroker inne i løsning-kammeret. (B) å gjengi oppbygning av kraft-klemme hydrogel rheometer: (a - c) x-y-z manipulators for å justere talespole koble posisjon, (d) den lineære talespole motor, (e) force svinger, (f) force svinger holderen, (g) løsningen kammer, og (h - jeg) x-y manipulators for å justere force svinger plasseringen. (C) ordningen med kraft-klemme hydrogel rheometer oppsett. Ordningen viser et protein-basert hydrogel eksempel knyttet til en kraft-sensor og talespole kroker med medisinsk suturer. Analoge PID systemet endrer hydrogel lengden ved å justere talespole plasseringen for å følge settpunkt kraft. (D) PID systemet svaret ved hjelp av ulike integrert-forsterkningen (jeg) å nå styrken angi (stiplet linje). Farget spor representerer den målt makt (nederst) og belastning (øverst) avledet fra PID systemet svaret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: L-eGFP/(L)8-basert hydrogel vedlegg prosessen. (A) nærbilde utsikt over en Sutur loop, bundet med en løs dobbel halvstikk knot legges hydrogel prøven til krokene. (B) to Sutur looper plasseres på kraft sensor kroken brukes i protein-basert hydrogel vedlegg. (C) en L-eGFP/(L)8-basert hydrogel eksempel henger mellom krokene (angitt med pilene). (D) suture looper på siden av talespole (venstre) og force sensor kroken (høyre) strammes rundt hydrogel prøven i svingen av hver krok å hindre prøven sklir under målinger. Etterpå skal overflødig bildet beskjæres ved hjelp av medisinsk saks (angitt med den røde piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant kraft-rampen måling og data analyse kurver for en L-eGFP/(L)8-basert hydrogel eksempel. (A) typisk slakk måling kurve (rød) brukes til å bestemme null kraft kraft-sensor og hvor sant hydrogel. To lineær kurver (blå og oransje linjene) brukes til å passe både regimer: først når gel er under force (blå linje), og andre, når gel blir slakk (platå - oransje linje). Skjæringspunktet mellom de to linjene brukes til å beregne sanne hydrogel lengden på null kraft. Pilen viser retningen av bevegelsen. Rammemargen viser plasseringen av null kraften og korrigering av hydrogel lengden. (B) representant kraft-rampen kurven på hydrogel prøven. (C) spor som representerer coil posisjon bevegelse som en funksjon av tid. Spolen starter fra den opprinnelige plasseringen definert i protokollen på trinn 3.1 (7,5 mm). (D) representant kurven av utvidelsen av hydrogel prøven som en funksjon av tid. Utvidelsen beregnes som forskyvning mellom målt coil posisjonen og sin utgangsposisjon. (E) representant press -versus-tid kurve. Belastningen beregnes ved forlengelse av ekte gel lengden beregnet fra slakk målingen. (F) representant stress-belastning kurven av en hydrogel prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: konstant-force måling og dataanalyse. (A) representant spor av konstant-force protokollen på en hydrogel. Hydrogel er utsatt til 0,1 mN for 30 s og styrken er økt til 1 mN for 120 s, og til slutt, kraften er slukket tilbake til 0.1 mN for 300 s. (B) dette panelet viser en coil posisjon spor mot tiden som representerer endringen i lengden på h ydrogel eksempel følger force protokollen. (C) dette panelet viser gel forlengelsen målt fra forskyvning av talespole. (D) figur representant av stress (nederst) og belastning spor (øverst) etter dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en kraft-klemme rheometry teknikk for å undersøke biomekaniske respons på lavt volum protein-basert hydrogels. I tillegg tilbys en protokoll for å syntetisere et ensartet sylindriske lavt volum protein hydrogel utvalg. En protokoll er også presentert som beskriver hvordan å knytte ulike typer protein-basert hydrogels med ulike elastisiteter uten å forårsake noe mekanisk deformasjon eller skade til protein-basert hydrogel prøver eller forsinkelse av gel på krokene. Analoge PID systemet, sammen med den lineære talespole og kraft-sensor aktiverer bruk av styrt-force protokoller som kraften rampen og konstant kraft. Nylig er denne teknikken brukt til å studere ulike krysskoblet konsentrasjoner av BSA-baserte hydrogels i forskjellige eksperimentelle løsninger7biomekaniske svar.
Et viktig aspekt når formulere og arbeider med protein hydrogels er reproduserbarhet av målinger. Hvis gels er formulert med en for lav protein konsentrasjon eller ufullstendig cross-linking, permanente plast deformasjoner vises under forlengelse7. Disse plast deformasjoner begrenser drastisk dataene tolkningen, viskoelastiske effekten ville komme fra både domene utfoldelsen og den molekylære omorganisering innvendig gel. En enkel test for å se om det fullstendig cross-linking er å fordype hydrogel i kjemiske denaturants, for eksempel 6 M guanidinium chloride1. I dette tilfellet, det bør ikke være noen viskoelastiske effekter i den stress -versus-belastning kurver, alle domener er brettet kjemisk og molekylene er nå oppfører seg som enkel polymerer4,7,26. Videre bør gel gjenopprette sin første elastisitet når midt i den første buffer7.
Hvis det er variasjoner i målt svaret mellom spor med ulike gels, flere aspekter bør vurderes for feilsøking: protein aggregering i løsning, en ikke-homogen blanding av protein med den cross-linking kjemikalier, tilstedeværelse av bobler, binding av protein-basert hydrogel til PFTE røret på grunn av feil silanization. Rester av silane på røret veggene kan forurense av hydrogel og føre til strukturelle feil. For å unngå denne feilen, for mer komprimert luft å sikre en total fjerning av silane fra røret. I tillegg kan bobler form under inntaks hydrogel fotoaktive blandingen i PTFE tube. Disse boblene kan føre skade og påvirker hydrogel biomekaniske svar. For å hindre eventuelle boble formasjon, slutten av PTFE tube må være innenfor løsning mikse under lasting prosessen og sprøytestempelet må tilbakekalles sakte. En annen vanlig feil er en over innstramming av Sutur looper rundt hydrogel prøvene under vedlegg-prosessen som kan føre til en hakk formasjon og skjæringen av hydrogel. Flytte området til talespole begrenser maksimal forlengelse av tilknyttede hydrogel prøven. Denne begrensningen må tas i betraktning når du måler gels som strekker seg flere hundre prosent av sine første lengde. For eksempel for å forlenge en hydrogel for mer enn 200%, er en innledende lengde på mindre enn 4 mm nødvendig.
Protein-basert hydrogels er en unik klasse av biologisk materiale deres biocompatibility og høy stretchability av proteiner, deres hovedbygningen enheter og iboende folding overgangen som er karakteristisk for proteiner. I tillegg, har disse hydrogels en utmerket potensial for tissue engineering og narkotika leveringssystemer biologiske blekk (bioink) for 3D utskrift27. Force-klemme hydrogel rheometer kan brukes til å undersøke en rekke proteiner. Videre gjør kraft-klemme rheometer bruk av konstant-force protokoller på lavt volum hydrogel prøver. Disse eksperimentene tillate frikopling av elastisk og viskoelastiske og studere (FN) folding mekanikken i en bulk tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner økonomisk støtte fra forskning Growth Initiative (Award nr 101 X 340), National Science Foundation, store Research instrumentering Program (Grant nr. PHY-1626450), større Milwaukee Foundation (Shaw Award) og University of Wisconsin System (anvendt forskning Grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
