Summary
En ny kraft-clamp reometri teknik används för att undersöka de mekaniska egenskaperna av låg volym proteinbaserade hydrogel prover uppbundna mellan en voice-coil motor och en kraftsensor. En analog proportionell-integral-derivat (PID) system möjliggör den 'fastspänning' av kraften som är erfarna att önskade protokoll.
Abstract
Här, beskriver vi en kraft-clamp reometri metod för att karakterisera proteinbaserade hydrogels biomekaniska egenskaper. Denna metod använder en analog proportionell-integral-derivat (PID) system för att applicera kontrollerade-force protokoll på cylindriska proteinbaserade hydrogel prover, vilket är uppbundna mellan en linjär röst-coil motor och en kraftgivare. Under drift justeras PID förlängning av hydrogel provet att följa en fördefinierad kraft-protokollet genom att minimera skillnaden mellan uppmätta och inställt krafter. Denna unika metod att protein-baserade hydrogels kan den tjudra av extremt låg volym hydrogel prover (< 5 µL) med olika protein koncentrationer. Under kraft-ramp protokoll, där tillämpad stressen ökar och minskar linjärt med tiden, systemet möjliggör studiet av elasticitet och hysteres beteenden associerade med (FN) vikningen av proteiner och mätning av standard elastisk och viskoelastiska parametrar. Under konstant-kraft, där kraft puls har en steg-liknande form, elastisk svaret, på grund att förändringen i kraft, är frikopplad från det viskoelastiska svar, som kommer från protein domän utspelar sig och vika. På grund av dess låg volym prov och mångsidighet i att tillämpa olika mekaniska störningar, är kraft-clamp reometri optimerad för att undersöka den mekaniska Svaren av proteiner under kraft med en bulk-metod.
Introduction
Förutom att ha unika fysiska egenskaper, håller proteinbaserade hydrogeler löftet om revolutionerar kraft spektroskopi genom att möjliggöra mätning av flera miljarder molekyler i en 'dra', vilket möjliggör studier av proteiner i trånga miljöer, liknar de stött på i huden och andra vävnader. Protein domäner förbli vikta inuti hydrogels, möjliggör studier av deras biomekaniska svar att tvinga, bindande partners, och kemiskt villkorar. Dessutom liknar protein domäner släpper hydrogels biomekaniska svar svar ses med singel-molekyl kraft spektroskopi tekniker. Exempelvis minskar kemiska denatureringsmedel och oxiderande ämnen stabiliteten i vikta staten, både på den enda protein domän nivåerna1,2,3 och på makroskopisk nivå4,5 , 6 , 7. på samma sätt osmolytes öka stabiliteten i enstaka proteiner8,9, leder till en minskning av viskoelastiska svar hydrogels, för samma kraft villkor7,10.
Flera metoder har genomförts för att syntetisera protein-baserade hydrogels, genom att antingen använda fysiska interaktioner11,12 eller kovalent tvärbindande4,13. Kovalent reaktioner möjliggöra fasta tvärbindande platser och dessa hydrogels kan återställa det ursprungliga tillståndet vid en borttagning av de mekaniska eller kemiska störningar. En framgångsrik strategi för kovalent cross-linking beroende bildar kovalenta kol-kol bindningar mellan exponerade tyrosin aminosyror med ammonium persulfatoxidation (APS) som en antioxidant och en rutenium (II) salt som en initiativtagare (figur 1)14. Vid exponering för vitt ljus, kan en lösning av koncentrerade proteiner förvandlas till en hydrogel. Genom att kontrollera när den reaktion börjar, protein-APS mixen kan injiceras i gjutning form, medger såsom polytetrafluoreten (PFTE) rör (figur 1B och 1 C), användning av en extremt liten lösning volym15. Dessutom användningen av vitt ljus att utlösa tvärbindande reaktionen resulterar i en begränsad blekning av fluorescerande proteiner och tillåter formuleringen av sammansatta hydrogels med fluorescerande markörer (figur 1). Andra protein-baserade hydrogel bildandet metoder använder cross-linking baserat på SpyTag-SpyCatcher kovalenta interaktioner16, amine tvärbindande via glutaraldehyd13eller biotin-streptividin interaktioner17.
Dynamisk mekanisk analys (DMA) är för närvarande en teknik som i stor utsträckning att studera polymerbaserade hydrogels13,18. Även DMA kan gälla biomaterial med konstant kraft protokoll, kräver det Youngs moduli över 10 kPa, och stora provmängder på mer än 200 µL19. På grund av dessa begränsningar är i allmänhet alltför mjuk för utredas av denna teknik protein hydrogels. Som konstruerade polyproteins är svårare att syntetisera än polymerer, eftersom de kräver ett levande system att producera, är så höga volymer ineffektiva, bästa4,15. Dessutom är de flesta biologiska vävnader mjukare än 10 kPa. Flera metoder har utvecklats för biologiska prover, särskilt i studien av muskel elasticitet20,21. Dessa tekniker kan också verka under feedback att tillämpa konstant kraft men är optimerade för prover med små diametrar (i intervallet micron) utsätts för för mycket korta (vanligtvis mindre än 1 s).
Protein-baserade hydrogels studerades framgångsrikt med modifierad reometri tekniker. Till exempel tillåter gjutning av hydrogel i en ringform användning av utvidgande reometri att mäta förändringen i den erfarna kraften som en funktion av förlängning4,22. Andra metoder för att studera de reologiska egenskaperna hos protein-baserade hydrogels använda kontrollerade skjuvspänningen-reometri. Dessa tekniker kan också uppnå låg provvolymen och tolerera mjuka material. Men dessa metoder saknar förmågan att härma dra styrkor att orsaka protein utspelas i vivooch Youngs modul beräknas baserat på komplexa teorier som kräver olika antaganden och korrigeringar23.
Vi har nyligen rapporterat en ny metod som använder en liten mängd proteiner, polymeriseras inuti rör med diametrar < 1 mm. Vårt första genomförande av denna teknik var verksamma i längd-clamp-läge, där gelen förlängdes efter de önskade protokoll15. I denna metod uppleva proteinerna en kontinuerlig förändring i både förlängning och kraft medan domänerna utvecklas, vilket gör tolkningen av data besvärlig. Vi rapporterade nyligen, har en ny kraft-clamp reometri teknik, där en feedbackloop kan exponera låg volym protein hydrogels till en fördefinierad kraft protokoll7 (figur 2). En analog PID-systemet jämför den kraft som mäts av den kraft sensorn med börvärdet skickas från datorn och justerar tillägget gel genom att flytta den talspole att minimera skillnaden mellan de två ingångarna. Denna 'fastspänning' av kraft gör nu för nya typer av experiment att mäta biomekanik av protein hydrogels.
I kraft-ramp läge erfar en tjudrad protein hydrogel en konstant ökning och minskning av våld med tiden. PID kompenserar för alla viskoelastiska deformation genom att ändra filnamnstillägget i ett icke-linjärt sätt, beroende på typ av protein och hydrogel formulering. Den största fördelen med kraft ramp är att det tillåter kvantifiering av standard parametrar, såsom Youngs modul och energiupptagning, på grund av en utspelas och vika av protein domäner.
I konstant-force läge ändras den tillämpliga kraften i en steg-liknande sätt. I det här läget gelen utökar och kontrakt elastiskt när kraften ökas eller minskas, respektive, följt av en tidsberoende deformationer. Detta viskoelastiska deformation, äger rum medan gelen erfar en konstant kraft, är direkt relaterad till domän utspelas/vika. På ett förenklat sätt, kan denna förlängning ses som motsvarar flera miljarder enda molekyl spår i genomsnitt tillsammans och mätt på en gång. Konstant-force protokoll kan användas för att studera krypning och uppmjukning av protein hydrogels som en funktion av kraft och tid. Som en funktion av kraft, för BSA-baserade protein hydrogels, har vi nyligen visat att det finns ett linjärt samband mellan elastiska och viskoelastiska förlängning och rekyl med tillämpad stam7.
Här detalj vi driften av en kraft-clamp reometer använder komposit geler gjorda av en blandning av protein L (8 domäner24, avbildad som L8) och en protein L-andra konstruktion (L-andra), vilket gör den totala hydrogel fluorescerande och lätt att demonstrera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser lösning förberedelse
- Bered en start protein genom upplösning/utspädning proteinet av intresse för önskad koncentration, använder en Tris buffert [20 mM tris (hydroxymetyl) aminometan och 150 mM NaCl, pH 7,4].
Obs: Den minsta proteinkoncentration för som bryggbindningen leder till hydrogels beror på det protein som används och är vanligtvis > 1 mM. - Förbereda lager av ammonium persulfatoxidation (APS) (1 M) och tris(bipyridine)ruthenium(II) klorid ([Ru(bpy)3]2 +) (6,67 mM) lösningar genom upplösning APS och [Ru(bpy)3]2 + pulver i Tris buffert.
2. protein-baserade Hydrogel syntes
- Fixa en 23-G nål på en 1 mL spruta med en pressad kolven.
- Skär ett 10 cm polytetrafluoreten (PTFE) rör (med en inre diameter av 0,022 i och en yttre diameter på 0,044 i) med ett rakblad. Fäst kanylen och sprutan till ena änden av PTFE-röret.
- Sätt in den andra änden av röret i en silan lösning och fyll röret med infällbara sprutkolven. Lämna röret för ~ 30 min.
- Ta bort silan lösningen och torka röret med tryckluft.
Obs: Se till att all silan lösning är torkat och att inga rester finns kvar i röret. - Blanda protein lösningen med APS och [Ru (bpy) 3]2 + i ett 1,5 mL rör med en konstant volym förhållande [e.g., 15:1:1 eller 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Vortex fotoaktiva lösningen tills det blandas helt.
- Centrifugera blandningen med maximal hastighet (t.ex., 14 000 x g) ta bort alla bubblor från lösningen.
- Infoga den öppna änden av behandlade PTFE-röret i fotoaktiva blandningen och dra in lösningen i röret genom att dra tillbaka sprutkolven.
- Placera den inlästa tuben ~ 10 cm från en 100 W kvicksilverlampa att förhindra värme det och hålla det där för upp till 30 min i rumstemperatur (figur 1B).
Obs: I vissa fall exponeringstiden för ljus kan vara så låg som 30 s. kortare gelation gånger används här för fluorescerande geler, för att begränsa fotoblekning. - Ta bort röret från nålen och Klipp kanterna på röret nära hydrogel ändarna med ett rakblad.
- Använd en avtrubbad 24 G nål för att extrudera hydrogel i Tris-lösningen (figur 1 c).
Obs: Trubbiga nålar används för att undvika eventuella Hack eller skada hydrogel provet. - Inspektera visuellt Gelens några defekter som kan bilda under extrudering eller på grund av bubblor och kassera gelerna med defekter.
3. protein-baserade Hydrogel fastsättning och kraft-Clamp reometer Set-up
- Starta kontrollprogrammet instrument. Slå på talspole motorn. Ställa in spolen position till ett värde i slutet av intervallet (t.ex., 7,5 mm).
Obs: Talspole position rekommenderas att vara mot slutet av intervallet maximal rörlighet, att maximera en eventuell utvidgning av hydrogel. - Förskjuta krokar i z-riktningen och justera dem vid krök i x-riktning (vilket är dra koordinaten; se figur 2B). Registrera värdena för de mikrometer skruvarna för x-riktning.
- Skär 2 sterila suturer i trådar med samma längd (2-3 cm; se figur 3A och B).
- Knyt en lös dubbel överhandsknop i var och en av delarna och placera 2 öglor på kroken ansluten till kraft sensorn (figur 3 c och 3D).
- Fyll den experimentella avdelningen med Tris buffert och överför hydrogel provet till fyllda kammaren använder medicinsk pincett.
- Placera talspole och tvinga sensor krokar nära lösning ytan och justera krokarna i alla riktningar med hjälp av x/y/z-positionering manipulatorer.
- Använda medicinska pincett, hänga båda sidor av protein hydrogel provet på krokar ansluten till röst spole och tvinga sensor (figur 3 c).
- Dra åt 1 suturen slinga runt hydrogel provet på voice coil kroken genom att hålla båda ändarna av suturen slingan med medicinsk pincett och dra dem samtidigt (figur 3D).
- Upprepa steg 3,8 för loopen ansluten till kraft sensorn (figur 3D).
Obs: Undvik en extrem skärpning av suturerna för att förhindra eventuella strukturella skador och övergripande skärning av hydrogel provet. - Dra åt suturen öglorna på böjar av varje krok att förhindra någon slirning; Använd dessa böjar som referens punkter för att hitta noll separationen mellan krokarna i steg 3,2. Skär de överskjutande längderna suturerna med medicinsk sax (figur 3D).
- Flytta den bifogade hydrogel med hjälp av z-manipulatorer längs z-axeln mot experimentell kammaren att fördjupa hydrogel i experimentell lösningen.
- Justera hydrogel provet i y-z använda manipulatorer så att gelen inte är under stress.
- Noll kraft sensorn och skilja de två hakarna som använder x-mikrometer arrangerar tills gelen börjar uppleva kraft. När detta händer, något vända tillbaka de Mikrometern skruven i x-riktning.
- Spela in positionen för båda manipulatorer för röst spole motorn och sensor och använda skillnaden mellan dessa värden och de mätte i steg 3.2 för att beräkna exakta separationen mellan de tjudra krokarna i början av experimentet.
- Ange intervallet för slak kurvan till ~1.5 - 2 mm och mäta gel slack (figur 4A).
Obs: För varje slack mätning, försök hålla i början av slack regimen nära den ursprungliga voice coil positionen, vilket möjliggör ett optimalt antal datapunkter för att passa de 2 regimerna (figur 4A). Gel längden kan bestämmas med en micron upplösning med hjälp av avståndet mellan krokarna och skärningspunkten mellan de 2 regimerna i slack kurvan (se även steg 5.1). Som kraft sensorn kan glida med tiden på grund av variationer i de experimentella förhållandena, tvinga delen av slack kurvan där gelen inte är enligt rapporter om denna möjliga drift. Programmet styra instrumentet kompenserar automatiskt för denna skillnad när du skickar kommandot set-punkt till PID slingan (figur 4A infälld).
4. protein-baserade Hydrogel karakterisering med kontrollerad kraft-Ramp och konstant-Force mätningar
-
Kraft-ramp experiment
- För att utföra en kraft-ramp cykel genom att öka kraften på önskad Fisktätheten (t.ex., 0,01 mN/s), mata in start- och sista krafter och varaktigheten av protokollet som en vänt V. Håll sedan, gelen på 0 mN (eller låg kraft) för > 200 s att tillåta protein domänerna refold och gel elasticiteten att återvinna.
- Spara spår.
-
Konstant-force experiment
- Utföra ett konstant-force protokoll genom att tillämpa en låg kraft (t.ex., 0.1 mN) för 30 s och sedan öka kraften en konstant kraft (t.ex. 1 mN) för en definierad tidsperiod (t.ex., 120 s), följt av kylning kraft tillbaka till samma låga värde (t.ex., 0.1 mN) för > 300 s att tillåta protein domänerna refold och gel elasticiteten att återvinna.
- Efter den första pulsen, justera PID inställningarna att maximera svarstiden för feedback loop (se figur 2D).
Obs: För stela geler för små förändringar i kraft, svarstiden för loopen är begränsad av elektroniken i kraft sensorn och svarstiden för spolen och kan vara så låg som 5 ms7. För mjukare geler och stora förändringar i kraft, är svarstiden dikteras av elasticiteten i hydrogels (figur 2D). - Spara spår.
5. dataanalys
- Utnyttja det uppmätta avståndet mellan krokarna och den beräkna spole positionen, när gelen börjar uppleva kraft (Δx i figur 4A infoga), beräkna gel längden L med hjälp av ekvation:
L = L0 + ∆x
Här är L0 separationen mellan krokarna, mätt från positionen där de mikrometer skruvarna innan experimentet (steg 3.14).
Obs: För geler med låg protein koncentrationer som inte resulterar i en komplett cross-linking, ändrar den uppmätta längden från spår-till-spår. Över långa tidsperioder, proteiner inuti hydrogels kan också få åldrande effekter25, som resulterar i en övergripande förlängning av gelen. - Normalisera uppmätta tillägget att gel längden att få stammen.
- Normalisera den uppmätta kraften att den övergripande yta med hjälp av den inre diametern av röret används för polymerisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar systematiken i fotoaktiva reaktionen används för att syntetisera de L-EGP/L8 hydrogel. Figur 1B visar hydrogel blandningen i PTFE-röret före och efter ljusaktivering. Figur 1 c presenterar den extruderade L-andra-L8 hydrogel inuti en Tris-lösning. Hydrogel provet har några strukturella defekter såsom skårorna. Hydrogeler med tydligt synliga skador ska kasseras.
Rendering av den hopsatta och sprängskisser av den kraft-clamp reometer presenteras i figur 2A och 2B. Figur 2 c visar kraft-clamp reometer systemet, där hydrogel provet är uppbundna mellan krokarna ansluten till linjär röst-spolen och kraft sensorn och nedsänkt i en buffertlösning. Det analoga PID-systemet justerar tillägget hydrogel genom att kontrollera den linjära-talspole ståndpunkten att följa gällande börvärdet. Figur 2D visar trimning av PID med olika steg för integrerad vinsten.
Figur 3 visar en typisk anknytningsprocessen provvikt hydrogel. Efter tjudra hydrogel mellan anpassade krokar, är sutur slingorna åtdragna runt hydrogel nära böjar att förhindra provet från att glida och låta för exakt bestämning av hydrogel längd.
Kraft-ramp mätning och analys av proteinbaserade hydrogeler:
Representativa mätningar av protokollet kraft-ramp visas i figur 4A - 4 C. Varje ny pull börjar med en slak mätning, som visas i figur 4A. Sedan erhålls kurvan kraft genom att tillämpa ett omvänt ”V”-protokoll eftersom belastningen ökar och minskar linjärt med tiden. Efteråt, hydrogel hålls på en 0 mN kraft för 200 s, att tillåta protein domäner släpper hydrogel provet med refold (figur 4B). Under stress ändrar systemets PID tillägget hydrogel som representeras av spole positionen följer börvärdet för fördefinierade kraft. För varje slack kurva passar vi 2 rader (figur 4 c). Den blå linjen används för att passa det första systemet när de hydrogel-konstruktionen och de orange linjen används att passa regimen när hydrogel blir slack. Skärningspunkten mellan de två linjerna som används för att beräkna sann gel längd med en mikrometer upplösning (figur 4A). Efteråt, beräknas förlängning av hydrogel provet genom att subtrahera den inledande spole positionen från spolen position tracen (figur 4 d). Figur 4F presenterar stress-påfrestningar kurvan. Stress beräknas genom att dividera den tillämpliga kraften av tvärsnittsarean av hydrogel provet och stammen beräknas genom att dividera tillägget (figur 4E) av sanna gel längd beräknas från slack kurvan som presenteras i figur 4A .
Konstant-force mätning och analys av proteinbaserade hydrogeler:
Representativa mätningar av ett konstant-force-protokoll visas i figur 5A - 5 D. En konstant kraft av 0.1 mN tillämpas på hydrogel provet för 30 s, i kraft sedan ändras till 1 mN för 120 s, och slutligen kraften är kylda tillbaka till 0.1 mN för 300 s att tillåta protein domäner till refold (figur 5A). Under de första 30 s vid låg kraft, finns det några anmärkningsvärda förändringar i tillägget gel. När ökar styrkan som 1 mN, visar hydrogel en snabbt elastisk förlängning. Efter denna inledande förlängning, håller hydrogel sträcker sig över tid, medan att hålla kraft konstant (1 mN). Efteråt, kraften är härdas tillbaka till det ursprungliga låga värdet (0.1 mN) och hydrogel återställs till sin ursprungliga längd (figur 5B). Förlängning av hydrogel provet (figur 5 c) och kraften som används för att beräkna stam (överst) och stress (nederst) på ett liknande sätt som i kraft ramp mätningarna (figur 5 d).
Figur 1: L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel syntes. (A) denna panel visar schemat för en L-eGFP/(L)8 proteinsyntesen hydrogel med hjälp av en photoactivated reaktion. Proteinet är blandad med APS och [Ru(bpy)3]2 + och utsätts för vitt ljus, som främjar bildandet av kovalenta bindningar mellan intilliggande tyrosin aminosyror (infälld). (B) i denna panel visas ett L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- och APS-blandning laddas in en PTFE-röret med en 23 G nål före exponering för vitt ljus (överst) och efter (nederst). (C) i denna panel visas en extruderad L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel Tris lösning. Infällt visar en förstorad bild av ett L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel. Diameter fördelningen är 552 ± 8 μm, i samförstånd med den inre diametern av PFTE röret används under polymerisationen (558 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kraft-clamp reometer design och set-up. (A) Rendering av den samlade kraft-clamp hydrogel reometer. Den infällda visar ett protein-baserade hydrogel prov bifogas röst spole och tvinga sensor krokar inne i lösning-kammaren. (B) Rendering av Sprängskiss av den kraft-clamp hydrogel reometer: (a - c) x-y-z manipulatorer för att justera röst-spolen krok ställning, (d) den linjära talspole motor, (e) kraft omformare, (f) kraft givare hållare, (g) lösningen kammare, och (h - jag) på x-y manipulatorer för justera kraft givaren position. (C) systematiken i kraft-clamp hydrogel reometer set-up. Systemet visar ett protein-baserade hydrogel prov bifogas en kraftsensor och talspole krokar med medicinsk suturer. Analoga PID systemet ändras hydrogel längden genom att justera talspole positionen för att följa gällande börvärdet. (D), PID systemsvar använder olika integral-gain värden (jag) att nå kraft börvärde (streckad linje). Färgade spår representerar den uppmätta kraften (nederst) och stam (överst) som härrör från PID systemsvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel anknytningsprocessen. (A) Närbild Visa med en sutur loop, bundna med en lös dubbel överhandsknop som används för att fästa hydrogel provet till krokar. (B) två sutur loopar placeras på kraft sensor kroken används i protein-baserade hydrogel fastsättning. (C), ett L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel prov hängde mellan krokarna (se pilarna). (D) suturen loopar på sidan av röst spolen (vänster) och kraft sensor kroken (höger) dras åt runt hydrogel provet vid krök av varje krok så att provet glider under mätningarna. Efteråt, trimmas de överskjutande suturerna med medicinsk sax (indikeras av de röda pilarna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ kraft-ramp mätning och data analys kurvor för en L-eGFP/(L)8-baserat hydrogel provet. (A) typiska slack mätning kurva (röd) som används för att bestämma noll kraft kraft sensorn och sanna längden på hydrogel. Två linjära kurvor (blå och orange linjer) används för att passa både regimer: först, när gelen är under kraft (blå linje), och andra, då gelen blir slack (platå - orange linje). Skärningspunkten mellan de två linjerna som används för att beräkna sann hydrogel längden på noll kraft. Pilen visar riktningen av rörelse. Infällt visar platsen för noll kraft och korrigering av hydrogel längd. (B) representativ kraft-ramp kurvan tillämpas på hydrogel provet. (C) Trace som representerar spole position rörelsen som en funktion av tid. Spolen startar från den första position som definieras i protokollet vid steg 3.1 (7,5 mm). (D) representativa kurva av en utvidgning av hydrogel provet som en funktion av tiden. Tillägget beräknas som förskjutningen mellan uppmätta spole samt dess ursprungliga position. (E) representant stam -kontra-tid-kurvan. Belastningen beräknas genom att dividera förlängningen av sanna gel längd beräknas från slack mätningen. (F) representativa stress-påfrestningar kurva provvikt hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: konstant-force mätning och dataanalys. (A) representativa spår av konstant-force protokollet tillämpas på en hydrogel. Hydrogel utsätts för 0.1 mN för 30 s, sedan kraften ökas till 1 mN för 120 s, och slutligen kraften är kylda tillbaka till 0.1 mN för 300 s. (B) denna panel visar en spole position spåra jämfört med den tid som motsvarar förändringen i längden av h ydrogel urvalet enligt protokollet kraft. (C) i denna panel visas tillägget gel mätt från förskjutningen av röst-spolen. (D) representativa figur av stress (nederst) och stam spår (överst) efter dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri, beskriver vi en kraft-clamp reometri teknik för att undersöka den biomekaniska Svaren av låg volym proteinbaserade hydrogels. Dessutom finns ett protokoll för att syntetisera en enhetliga cylindriska låg volym protein hydrogel provet. Ett protokoll är också presenteras som beskriver hur man knyter olika typer av protein-baserade hydrogels med olika elasticiteter utan att orsaka någon mekanisk deformation eller skada proteinbaserade hydrogel prover eller glidning av gelen på krokar. Det analoga PID-systemet, tillsammans med den linjära talspole och kraft sensorn, möjliggöra tillämpningen av kontrollerade-force protokoll som kraft ramp och konstant kraft. Nyligen, denna teknik har använts för att studera olika tvärbunden koncentrationer av BSA-baserade hydrogels i olika experimentella lösningar7biomekaniska svar.
En viktig aspekt när formulera och arbeta med protein hydrogeler är reproducerbarheten hos mätningarna. Om geler är formulerad med en alltför låg proteinkoncentration eller ofullständig cross-linking, visas permanent plastiska deformationer under förlängning7. Dessa plastiska deformationer skulle drastiskt begränsa data tolkningen, eftersom viskoelastiska effekterna skulle komma från både domän sanktionerar och molekylär omordningen inuti gelen. Ett enkelt test att se om där Slutför tvärbindningsmedel är att fördjupa hydrogel i kemiska denatureringsmedel, såsom 6 M guanidinium klorid1. I detta fall inte finnas några viskoelastiska effekter i den stress -kontra-stam kurvor, som alla domäner är ovikta kemiskt, och molekylerna nu beter sig som enkla polymerer4,7,26. Gelen bör dessutom återställa sin ursprungliga elasticitet när nedsänkt tillbaka i den inledande buffer7.
Om det finns variationer i den uppmätta Svaren mellan spår som erhålls med olika geler, flera aspekter övervägas för felsökning: protein aggregering i lösning, en icke-homogen blandning av protein med bryggbindningen kemikalier, förekomsten av bubblor, bindningen av den protein-baserade hydrogel till PFTE röret på grund av felaktiga silanisering. Rester av silan på tube väggarna kan förorena hydrogel och leda till strukturella brister. För att undvika detta fel, behövs mer tryckluft för att säkerställa ett fullständigt avlägsnande av silan från röret. Dessutom kan det bildas bubblor under sugningen av hydrogel fotoaktiva blandningen i PTFE-röret. Dessa bubblor kan leda till exempel skada och påverka biomekaniska hydrogel. För att förhindra någon bubbla bildandet, slutet av PTFE-röret måste vara inne blanda under inläsningen och sprutkolven ska vara tillbakadragen långsamt. En annan typisk fel är en alltför åtdragning av suturen slingor runt hydrogel proverna under kvarstad processen, vilket kan leda till en notch formation och styckning av hydrogel. Det rörliga utbudet av talspole begränsar maximal förlängning av bifogade hydrogel provet. Denna begränsning måste beaktas när man mäter geler som sträcker sig flera hundra procent av sin ursprungliga längd. För att förlänga en hydrogel för mer än 200%, krävs till exempel en inledande längd av mindre än 4 mm.
Protein-baserade hydrogeler är en unik klass av biomaterial på grund av sin biokompatibilitet och hög töjbarhet härrör från proteiner, andelarnas huvudbyggnaden och inneboende fällbara övergången som är karakteristisk för proteiner. Dessutom har dessa hydrogels en utmärkt potential för vävnadsteknik, drog leveranssystem och biologiska bläck (bioink) för 3D utskrift27. Den kraft-clamp hydrogel reometer kan användas för att undersöka en stor mängd proteiner. Dessutom möjliggör den kraft-clamp reometer tillämpningen av konstant-force protokoll på låg volym hydrogel prover. Dessa experiment tillåta frikopplingen elastisk och viskoelastiska beteenden och studera (FN) vikning mekaniken i en bulk-strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner finansiellt stöd från forskning tillväxtinitiativet (Award nr 101 X 340), National Science Foundation, större forskningsprogram instrumentering (Grant nr. PHY-1626450), större Milwaukee Foundation (Shaw Award) och University of Wisconsin System (tillämpad forskning Grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
