Summary
参与多个早期临床研究试验的正电子发射断层扫描 (PET) 成像站点需要强大且多才多艺的放射性同位素示踪制造能力。以放射性同位素示踪 [18F] 克罗拉滨为例, 说明如何使用灵活、基于磁带的 radiosynthesizer 自动合成放射性同位素示踪, 并验证临床使用的合成。
Abstract
新的正电子发射层析成像 (PET) 示踪剂的发展使研究人员和临床医生能够想象越来越广泛的生物靶点和过程。然而, 不同示踪剂的数量不断增加, 给 radiopharmacies 的生产带来了挑战。在历史上, 将定制配置的 radiosynthesizer 和热单元专用于每个单独的跟踪器的重复生产是切实可行的, 因此更改此工作流变得必要。基于每个跟踪器的一次性磁带盒/套件的最新商业 radiosynthesizers, 通过消除对自定义跟踪器特定修改的需求, 简化了使用一套设备生产多个示踪剂的过程。此外, 其中一些 radiosynthesizers 使操作人员能够开发和优化自己的合成协议, 以及购买商业可用的套件。在本协议中, 我们描述了如何在这些 radiosynthesizers 中自动进行手动合成新的 PET 示踪剂的一般步骤, 并对临床级示踪剂的生产进行了验证。例如, 我们使用 ELIXYS radiosynthesizer, 一种灵活的基于磁带的放射化学工具, 可支持 PET 示踪剂开发工作, 以及在同一系统上进行常规临床探针制造, 以生产 [18F] 克罗拉滨 ([18F] CFA), 一个用于测量体内脱氧胞苷激酶 (dCK) 酶活性的 PET 示踪剂。翻译手动合成包括将合成协议分解成基本的放射化学过程, 然后转化为合成器软件支持的直观化学 "单元操作"。然后, 通过使用拖放界面将这些操作快速转换为自动合成程序。经过基本测试, 合成和纯化过程可能需要优化, 以达到预期的产量和纯度。一旦达到预期的性能, 将对合成进行验证, 以确定其是否适合用于临床使用的放射性同位素示踪的生产。
Introduction
越来越多的生物靶点可以通过分子成像模式 PET 在活体中动态地可视化。PET 通过使用特定的 radiotracers (标记有正电子发射放射性核素的分子) 在成像1之前注入到主体体内, 提供特定生物、生化和药理过程的活体检测。在基础科学和临床研究2,3,4, 和在发现, 开发和临床使用的药物在病人护理5中, 更多地使用 PET 研究各种这些过程,6, 正导致对多样化 radiotracers 的需求增长7,8。为了避免辐射暴露在 radiochemist, 并确保这些短寿命示踪剂的可重复生产, 它们通常是使用在 "热电池" 内运行的自动化 radiosynthesizer 制造的。最近的 radiosynthesizers 使用一次性盒式磁带/套件架构简化了遵守临床级制造的任务, 同时还提供了灵活性, 只需更换磁带盒即可准备多种类型的 radiotracers9.然而, 在早期临床阶段, 通常没有商业可用的盒式磁带/套件来执行自动 radiosynthesis;因此, 宠物药品制造设施在适当的时间内和合理的成本下, 难以定制系统以实施 cGMP 级示踪剂生产能力。因此, radiosynthesizers 已开发出将盒式/套件结构与特性相结合, 以促进示踪剂的开发和优化。
ELIXYS FLEX/化学 (ELIXYS) 是一种灵活的基于盒式 radiosynthesizer 的示例, 具有广泛的试剂、溶剂和反应温度兼容性10。它有三反应容器, 并使用机器人机制, 根据任何特定的合成协议11的要求, 动态配置流体通路。合成器软件允许通过拖放单元操作(如陷阱同位素、洗脱同位素、添加试剂、反应) 来创建不同示踪剂的合成程序 (序列),蒸发12。每个单元操作都有可供操作员使用的各种可编程参数, 例如持续时间、温度或惰性气体驱动压力 (压力)。通过了解每个单元操作的性质, 手动合成可轻松转换为单元操作序列, 然后在协议13的优化过程中进行修改。结合 ELIXYS 纯/模模块, 集成系统还可以执行 PET 示踪剂的自动纯化和配方。使用此 radiosynthesizer, 我们以前报告了自动合成24不同的18F 标记的示踪剂和假肢组11,14,15,16, 作为以及生物分子17的自动酶 radiofluorination, 只需改变试剂, 而不是系统的配置。其他人已经显示了 [18F] RO6958948 的自动合成, 用于 tau 神经原纤维缠结18的成像, 该假肢组的自动合成 [18f] f-Py-TFP, 随后对肽19进行标记, 并对磷酸二酯酶 10a (PDE10A)20的成像进行了 [18F] AM580 的自动合成。此外, 几个小组已经显示了适合临床使用的示踪剂的生产, 包括 4-[18F] 氟苄三苯基 ([18F] FBnTP), 用于线粒体膜电位21的成像, [18F] DCFPyL 用于前列腺特异性膜抗原 (PSMA)22的成像, 和 [18F] THK 5351 用于 tau23的成像。
在本文中, 我们使用 [18F] CFA 的经验来说明手动 radiosynthetic 程序如何可以直截了当地快速转化为符合 cGMP 准则的常规生产的自动化合成。示踪剂 [18F] CFA 是为 dCK 活动的成像而设计的。[18F] CFA 的手工 radiosynthesis 最初是由蜀等所描述的。24作为使用两个反应容器的过程, 中间二氧化硅滤芯纯化和最终的 HPLC 纯化步骤 (参见补充材料,第1节了解详细信息)。最近的体外和临床前研究显示了这个示踪剂对 dCK 的特殊特异性, 而第一个人的研究显示了有利的生物分布25。在更广泛的临床研究中, 立即有兴趣确认 [18F] CFA PET 对 dCK 活性变化的敏感性, 以及对此示踪剂26的潜在临床应用的长期兴趣。它可能是一种有用的生物标志物, 用于触发 T 细胞活化、诱导 DNA 损伤或依赖 dCK 依赖性核苷模拟前药的治疗。特别是, [18F] CFA 可以使患者的分层能够对克罗拉滨治疗产生潜在的反应。[18F]CFA 也可能促进研究和开发 dCK 抑制剂, 正在推进对临床试验。由于此示踪剂传统上是人工合成的, 因此, 推进所有这些研究需要可靠、自动化的合成 [18F] CFA 适合临床使用。
虽然我们以前报告了 [18F] CFA 的自动合成, 用于临床前研究16, 但本议定书进一步建立了这些努力, 并描述了临床生产此示踪剂所需的额外修改,包括全自动纯化和配方、协议验证和质量控制测试的集成。这里描述的一般程序不限于开发一个自动化和临床上合适的合成 [18F] CFA, 但可以简单地概括为开发适合临床使用其他的自动化合成radiotracers 标有 fluorine-18。
Protocol
1. 临床制造 Radiosynthesis 协议的自动化和验证通用程序
-
临床生产人工合成方案的资格分析
- 使用任何不必要的残留化学品对产品污染进行风险分析。
- 避免使用1类溶剂 (如苯), 并用适当的替代溶剂 (2 类或3级) 替换它们。
- 避免在最终配方中难以检测到的化学物质作为潜在的残余杂质。
- 仅选择在高纯度等级 (USP 或 Ph 药典欧洲等级所需的) 商业上可用的化学品, 并提供分析证书。
- 如果风险分析检测到任何不良化学品或溶剂, 并重复第1.1 节直至无残留, 则改进合成方案。
- 使用任何不必要的残留化学品对产品污染进行风险分析。
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自动化合成协议
- 如果使用相同合成器的跟踪程序的自动协议已创建并上载到联机存储库, 请下载该合成计划的副本。
- 如果不存在自动合成程序, 请创建一个。
- 使用纸和笔, 将人工合成分为高级步骤 (例如, 干燥/激活 [18F] 氟化物、加热以促进放射化学反应、执行纯化步骤等)。进一步将高级步骤分解为所需的离散、基本流程。例如, 在图1中显示了 [18F] CFA 的合成方案, 在图2A中显示了高电平步骤的识别, 并在图 2B中显示了过程的分解。
- 使用纸张和笔, 将每个进程映射到由合成器软件提供的单个单元操作。例如,图 2C显示了将 [18F] CFA 合成中的基本过程映射到合成器软件13中合适的单元操作的方法。
- 使用 radiosynthesizer 编程接口, 创建一个空白程序并按顺序追加每个标识的单元操作, 方法是单击菜单按钮 (左上) 并选择序列, 然后单击新序列"按钮。对于步骤1.2.2.2 中标识的每个单元操作, 将设备操作从可用操作拖到 "胶片显示" 视图, 然后单击或键入以填写单位操作的每个参数的所需值。图 3显示了在合成 [18F] CFA 的所有操作之后, 该接口的一个示例, 并且用户选择了第一个响应单元操作来编辑参数值。[18F] CFA 的最终合成程序在补充材料、表 S1和S2中进行了描述。
- 验证合成程序。
- 执行干运行。按照步骤 2.1-2.3 所示设置和运行程序, 使用除放射性核素以外的所有试剂和溶剂 (例如 [18F] 氟化物) 来验证预期行为。
- 如有必要, 调整程序中的单位操作参数值 (例如, 时间或驱动压力, 以完全转移试剂、时间/温度, 将溶剂蒸发到所需的水平等), 并重新测试。要调整参数值, 首先, 从主菜单中选择序列(左上) 并选择新创建的程序, 返回到编辑模式。接下来, 在 "胶片显示" 视图 (屏幕底部) 中单击所需的单位操作, 导航到所需的参数, 然后选择或键入新值。
- 执行低活动 (< 370 MBq) 测试运行以评估程序。
- 通过调整参数值来优化自动合成, 以提高产量、合成时间、重复性和任何其他所需的可测量结果。
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制定质量控制 (QC) 测试程序
- 使用对最终产品和潜在化学杂质样品的非放射性参考, 开发一个分析无线电-HPLC 和/或无线电薄层层析 (单色谱) 方法, 具有足够的分离物种, 以确定化学纯度、摩尔活性、放射化学纯度和放射化学特性。验证可重复性和线性度的分析方法, 并确定检测和量化限制。
- 同样, 开发和验证气相色谱法来分析挥发性杂质 (例如, 在合成过程中使用的溶剂残留量)。
- 开发和验证分析检测, 允许检测和量化其他潜在杂质 (例如, 大二 222通过标准色斑测试)。
- 使用标准程序来测定不孕、pH 值、radionuclidic 身份、radionuclidic 纯度、放射性浓度、产品体积和内毒素水平。
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执行综合验证
- 为合成和 QC 测试程序建立标准操作程序 (sop), 并集成符合当前良好制造实践 (cGMP) 要求的材料和设备跟踪系统。
- 通过三独立的和连续的生产运行在与 sop 的临床制造相同的放射性水平验证合成过程。记录 QC 测试的综合性能和结果。
- 所有连续验证运行都必须通过预设置的 QC 限制。如果验证运行失败, 请在适当处理失败的根本原因后重复整个验证过程。
2. 示例: 用于临床使用的 [18F] CFA 的自动合成
- 准备 radiosynthesizer
- radiosynthesizer 的电源。
- 确保惰性气体供应以足够的压力开启, 必要的阀门打开, 使 radiosynthesizer 连接到气体供应。
- 在反应器 #1 和 #2 位置安装新的一次性磁带盒, 并插入含有磁性搅拌棒的反应容器。确保每个盒式传输 dip 管都指向直下。
- 根据图 4中的图, 准备试剂瓶并将其安装在磁带盒中。
- 在盒 #1 的W1位置安装一个空的 [18O] H2o 恢复小瓶。
- 通过第一次通过12毫升的1米 KHCO3溶液, 然后通过12毫升去离子水激活第四纪胺 (QMA) 墨盒。通过5毫升乙酸乙酯通过它来条件一个二氧化硅 9月-Pak 墨盒。
- 连接墨盒并制作所有卡式管接头, 如图 5A所示。验证没有盒式管 (包括未使用的油管) 悬挂在内部, 在那里它可能会干扰机器人运动。
- 将 [18F] 氟化物源线从回旋加速器连接到盒式 #1 上的 [18f] 氟化物输入线。
- 确保废弃物容器为空。将废弃管线从纯化/配方子系统放置到废物容器 (例如, 样品环路1废物线、HPLC 子系统废料线和注射器泵废料线)。
- 连接 HPLC 输入线。将 hplc 移动相输入线 "a" 放入 25 mM 醋酸铵和 HPLC 流动相输入线 "B" 的容器中的乙醇。
- 平衡纯化/配方子系统和 HPLC 柱。
- 从主菜单 (左上) 选择HPLC , 打开软件中纯化/配方模块的控制页面。默认情况下, "纯化" 选项卡将已选中。(此页如图 6所示。
- 将流量设置为5.0 毫升/分钟在定义的溶剂组合, 并选择哪一列位置的纯化列安装在。在等度模式下打开 HPLC 泵至少10分钟。
- 用流动相冲洗产品线和所有馏分收集线, 每次1分钟。
- 使用注射器冲洗每个液相色谱样品环和 hplc 样品循环转移管, 采用10毫升的流动相位。
- 连接纯化/配方子系统注射器泵输入线。使用浓缩氯化钠 (90 毫克/毫升) 为洗脱线和0.9% 生理盐水为重建线。
- 主要是配方子系统。
- 导航到纯化/配方控制页面的配方选项卡。
- 为浓缩氯化钠 (90 毫克/毫升), 选择洗脱选项卡. 按初始化以初始化注射器泵。点胶5毫升。
- 要将0.9% 生理盐水选中, 请选择 "重建" 选项卡. 点胶5毫升。
- 从 T 连接中的纯化/配方子系统前端连接产品和最终产品线。将 T 型连接的输出连接到无菌过滤器 (0.22 µm), 然后将其连接到最终的无菌产品小瓶。将无菌过滤器的排气针插入最终产品小瓶的顶部。图 5B显示了最终系统设置的照片。
- 将干冰、乙醇或甲醇添加到冷阱中。
- 运行合成程序
- 通过从主菜单按钮 (左上) 选择序列, 导航到程序列表。选择 [18F] CFA 程序, 然后按Run按钮启动程序。
- 仔细查看预运行核对清单上的每个项目, 并在完成后检查它们。预运行清单屏幕的一部分如图 7所示。
- 按 "继续" 以确认安装已完成, 并导致自动合成开始。
- 如果需要, 通过视觉反馈 (反应堆摄像机)、传感器读数 (例如温度、压力、真空、辐射读数等) 和倒数计时器实时监控合成。一个代表性的截图如图 8所示。
- 在纯化单元操作过程中, 当产品峰值开始出现在辐射探测器色谱上时, 选择产品。图 9显示了在本单元操作过程中 (包含 UV 探测器和辐射检测器输出的色谱) 的代表性屏幕截图。
- 一旦辐射探测器色谱峰返回基线, 选择废弃物将 HPLC 子系统的流动路径转移到废物容器。
- 设置和运行配方计划
- 从程序列表 (序列屏幕), 打开[18F] CFA 配方计划。
- 调整配方单元操作的参数。
- 根据 HPLC 泵流量和馏分收集的持续时间, 计算所收集的产品分数 (V分数) 的体积。
- 计算达到 isotonicity 所需的额外氯化钠 (90 毫克/毫升) 的体积, 并计算稀释乙醇浓度低于10% 所需的额外盐水量。
- 使用这些值修改程序。洗脱步骤输入氯化钠 (90 毫克/毫升) 的体积, 并为重建步骤输入生理盐水的体积。(计算在补充材料中描述,图 S2。
- 保存程序。
- 运行该程序。该系统将稀释收集纯化的产品馏分与氯化钠和盐水, 以确保配方的 isotonicity, 并通过灭菌过滤器进入无菌产品瓶。
- 收集配方 [18F] CFA 质量控制和装运
- 从热电池中取出所配制的 [18F] CFA 产品。
- 使用无菌工作技术, 提取两个样品 (300 µL) 进行质量控制测试。
- 使用第一个样本, 通过接种流体巯基乙酸培养基和胰蛋白酶酱油 14 d, 而不观察任何生长, 测试最终配方的无菌性。
- 根据步骤1.3 中开发的步骤, 使用第二个样本执行质量控制。根据美国药典, 在加州大学洛杉矶分校阿曼森生物医学回旋设施建立的程序如下所述。
- 通过目视检查来评估外观。
- 用指示纸评估 pH 值。
- 使用动态显色细菌内毒素检查 (注) 评估细菌内毒素含量。
- 通过验证放射性样品和非放射性参考化合物的共洗脱液, 通过分析无线电 HPLC 来评估放射化学的身份。
- 通过分析无线电-HPLC, 通过比较伽玛探测器色谱中放射性杂质的曲线区域 (auc) 与所需产品相对应的 auc 来评估放射化学纯度。
- 通过分析 hplc 测定化学纯度, 确定所有紫外活性杂质的紫外检测色谱中的 AUC。
- 通过分析无线电高效液相色谱测定摩尔活性和载体质量, 确定与所需产品在紫外检测色谱中对应的 AUC。
- 通过在两个不同的不仅上测量其活性并拟合衰变曲线来评估探针的半衰期。
- 用气相色谱法评估配方中残留溶剂含量。
- 使用伽玛光谱仪评估放射性核素的能量。
- 使用基于 TLC 的斑点测试评估大二222内容。
- 如果所有测试都通过, 则将探针配方释放到临床成像站点。
- 运行后和系统关机
- 用水中的 70% (a/v) 乙醇冲洗 HPLC 纯化柱和所有用于产品收集的油管。这应该用纯/表单控制页面完成, 类似于步骤2.1.12。
- 通过软件上的电源按钮关闭 radiosynthesizer。弹出窗口将指示何时可以关闭系统电源。
- 关闭适当的关闭阀, 关闭压缩空气和惰性气体供应。
- 允许在热细胞中残留放射性的时间衰减 (通常一夜之间)。
- 清洁 radiosynthesizer
- 去除并处理合成过程中使用的所有盒式磁带、墨盒、反应器瓶和试剂瓶。
- 清空冷陷井的内容。
- 清洁纯化子系统流体路径。
- 打开现有的清洁程序或创建一个新程序, 其中包含清洁模式下的一个纯化单元操作 (即, 选中 "清除" 复选框)。参见补充材料,图 S9的例子。
- 在 "参数配置" 页上, 选择用于纯化的列和在水中连接到包含70% 乙醇的瓶子的 HPLC 移动相输入线。程序流速为2毫升/分钟, 每个注射回路的冲洗持续时间为5分钟, 每个产品的冲洗时间和三十年代的馏分产量. 选择干线和计划的持续时间三十年代。
- 将所有分数线输出放置在一个大型废物容器中。
- 运行该程序。
- 完成后, 清空废弃物容器。
- 清洁配方子系统流体路径。
- 打开现有程序或创建一个新程序, 其中包含在清理模式下的一个配方单元操作 (即, 在 "干净" 选项卡下选中 "清理" 复选框)。参见补充材料,图 S10的例子。
- 用100毫升的乙醇填充干净的稀释油藏 (在纯化/配方子系统的前面)。
- 将纯化/配方子系统洗脱输入线放置在乙醇储层中 (包含 > 50 毫升乙醇)。
- 将冲洗和重建输入线与最终产品输出线一起放在废物容器中。
- 运行该程序。
- 完成后, 清空废弃物容器。
Representative Results
开发了一种实现 [18F] CFA 生产自动化的方法, 并合成了三个验证批次。在90±5分钟 (n = 3) 中实现了 [18F] CFA 的合成、纯化和配制, 而非衰变校正的放射化学屈服率为8.0 ± 1.4% (n = 3)。三运行的活动产量为 3.24 GBq、2.83 GBq 和 3.12 GBq, 分别从 34.3 GBq、41.8 GBq 和 41.1 GBq 开始。获得的 [18F] CFA 配方通过了所有质量控制测试 (表 1)。该自动化协议目前正在用于生产临床级 [18F] CFA, 以支持临床试验。
| 质量控制数据 | 验证运行1 | 验证运行2 | 验证运行3 |
| [要求 "通行证"] | |||
| 外观 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [透明, 无色, 无微粒物质] | |||
| EOS 放射性浓度 | 213 MBq/毫升 | 210 MBq/毫升 | 180 MBq/毫升 |
| [≤ 740 MBq/毫升 @ EOS] | |||
| Ph | 6 | 5。8 | 6 |
| [5.0-8.0] | |||
| 半衰期 | 115分 | 108分 | 112分 |
| [105 –115分钟] | |||
| 放射化学纯度 | 99% | 99% | 99% |
| [> 95%] | |||
| 放射化学相对保留时间 (复审) 的标识 | 1.01 | 1.01 | 1.01 |
| [1.00 < 复审 < 1.10] | |||
| 摩尔活性 | 314 GBq/µmol | > 370 GBq/µmol | > 370 GBq/µmol |
| [≥ 3.7 GBq/µmol] | |||
| 最终产品中的总载流子质量 | 3.1 µg | < 1 µg | < 1 µg |
| [≤50µg/剂量] | |||
| 最终产品中的总杂质质量 | ND | ND | ND |
| [≤1µg/剂量] | |||
| 最大允许注射体积, 根据总载流子质量≤50µg/剂量和总杂质质量≤1µg/剂量 | 整批 | 整批 | 整批 |
| 通过 GC 的残余乙醇含量 | 8.90% | 9.50% | 9.60% |
| [≤ 10%] | |||
| 通过 GC 的残余萃取含量 | < 1 ppm | < 1 ppm | < 1 ppm |
| [≤ 5000 ppm] | |||
| 通过 GC 的残余 MeCN 含量 | < 1 ppm | < 1 ppm | < 1 ppm |
| [≤ 410 ppm] | |||
| 用色斑试验 K222 残余物 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [< 50 µg/毫升] | |||
| 过滤膜完整性测试 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [气泡点≥ 50 psi] | |||
| 细菌内毒素 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [≤175欧盟/批次] | |||
| 伽玛光谱法 Radionuclidic 纯度 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [> 99.5%] | |||
| 无 菌 | 通过 | 通过 | 通过 |
| [符合 USP < 71 > 要求] |
表 1: 三验证批次的质量控制 (QC) 测试数据摘要.EOB = 轰炸结束;EOS = 合成结束;ND = 未检测到。
图 1: [18F] CFA radiosynthesis 计划.MMT = Monomethoxytrityl。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 将手动合成转换为自动单元操作序列.(A) 本小组概述了手工合成 [18F] CFA 的高级别步骤。(B) 本小组显示执行每一项高级别步骤所需的基本程序。(C) 用于执行基本程序的 Radiosynthesizer 特定单位操作显示为卡片。每个单元操作都有自己的一组参数值 (如下划线), 通过软件进行配置。符号 "R1" 和 "R2" 分别表示反应血管 #1 和 #2。试剂编号对应的试剂见图 4。单元操作系列被保存为序列, 由软件执行自动合成。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: radiosynthesizer (ELIXYS) 软件界面的屏幕截图, 用于创建合成程序.使用拖放界面将单元操作置于胶片显示窗格中所需的顺序。在此屏幕截图中, 选择了反应单元操作, 其可编辑参数值显示在屏幕的主要部分。在这个例子中, 氟化反应将在反应容器 #1 (密封) 在120摄氏度下进行, 10 分钟, 主动搅拌。反应时间过去后, 该容器将冷却至35摄氏度。可为其他单元操作编程的参数值的详细信息显示在补充材料(第3节) 中。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 试剂配置屏幕截图.对于 [18F] CFA 合成序列, 所有试剂都装入一次性盒 #1 中, 在组件选择区域中突出显示。在这里描述的 [18F] CFA 合成,流动是1.0 毫克 K2CO3 + 5.0 毫克的 K222 在0.4 毫升的 H2O/0.5 毫升的 MeCN,前驱体是6毫克的 CFA 前驱体0.6 毫升 MeCN, 和HPLC 流动相是 85:15 v/v 25 mM 醋酸铵: 乙醇。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: Radiosynthesizer [18F] CFA 合成的建立.(a) 这是一个示意图, 显示盒式流体路径、与墨盒的连接, 以及将最终原油产品从 radiosynthesis 模块转移到纯化/配方模块的连接。(两个模块均采用单台计算机和软件接口进行控制。(B) 这是在准备 [18F] CFA 合成后的热细胞内 radiosynthesizer 的照片。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6: 纯化/配方模块控制接口的屏幕截图.此屏幕由操作人员访问, 以便在合成设置过程中手动控制 HPLC 和配方子系统。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 7: 预运行核对清单屏幕.操作员输入系统中安装的磁带盒的序列号, 必须检查每个项目, 以确保系统已正确配置并准备好进行合成。除了这些部分之外, 还提示操作员输入合成运行的名称和描述 (第1节) 和使用的所有试剂的批号 (第2节), 并要求验证所有反应器视频源是否正常工作 (第6节)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 8: 运行 [18F] CFA 合成序列时, radiosynthesizer 软件的屏幕截图.该软件在胶片显示窗格区域中展示单位操作的顺序。已完成的操作将灰显并以白色高亮显示, 当前操作以灰色高亮显示, 即将进行的操作以深灰色显示。屏幕的中心区域显示活动单元操作的状态, 包括正在执行的子命令, 以及当前系统状态 (电抗器视频馈送和传感器数据)。这种特殊反应单元操作是氟化反应。在温度范围内, 反应器的当前温度显示在目标 (编程) 温度的旁边。在此下方,活动区域显示与反应步骤相关联的三传感器的辐射传感器值。最后, 左侧的视频提要显示了反应器小瓶的实时视图。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 9: 在合成 [18F] CFA 期间运行纯化单元操作时, radiosynthesizer 用户界面的屏幕截图。纯化/配方模块的 UV 检测器和辐射检测器输出实时显示在中央图中。从检测器和 HPLC 泵的其他反馈显示在屏幕的右侧。当峰值开始出现时, 操作员通过暂时选择产品来收集产品峰值, 然后在看到完整峰值后切换回废弃物。请点击这里查看这个数字的更大版本.
Discussion
本协议定义了在自动化手动合成协议时应采取的基本步骤, 以实现临床级示踪剂配方的生产。整个发展周期, 包括质量控制的发展, 都是放射性同位素示踪 [18F] CFA (用于 dCK 活动的成像) 的例证。特别注意修改自动合成, 以确保示踪剂对临床使用的适用性。该合成需要基本过程, 如活化 [18F] 氟化物、radiofluorination 前体分子、中间滤芯纯化、保护基团去除、半制备 HPLC 纯化和配方注射。这些基本过程包括一个标准的曲目, 足以合成绝大多数18F 标记的 PET 示踪剂。
在设计合成时, 试剂的选择及其质量保证对临床应用尤为重要。通过执行模拟合成 (仅限溶剂) 确保正确的编程和正确的连接是必要的, 以消除意外的错误, 当合成进行放射性。随后的合成优化 (溶剂、体积、用量、温度、反应时间和纯化条件) 取决于开发中的特定 PET 示踪剂。在这些实验中, 应特别关注最终产品的化学和放射化学纯度, 因为这些都必须满足临床使用的严格要求。一种在低但足够的活动产量下可靠地生产纯产品的合成, 通常优于具有偶发失败风险的高收益过程。一旦合成经过充分优化, 最终过程需要经过验证测试 (法规要求), 以确保临床适用性。经验证的合成方法可用于生产用于临床使用的 PET 示踪剂。根据验证的方法合成 PET 示踪剂时, 应彻底遵循标准操作程序。为了确保合规性, 软件被编程为让操作员在点击run开始合成后通过预运行核对清单确认完成关键步骤。虽然系统将以自动方式执行合成, 但纯化步骤需要手动干预。因此, 操作者必须在 HPLC 纯化步骤中密切观察色谱筛, 并手动输入实时启动和停止收集产品分数。
在我们为 [18F] CFA 合成的自动化和优化工作中, 我们使用了由醋酸铵溶液和乙醇组成的可注射溶剂系统, 简化了产品混合物的半制备 HPLC 纯化方法。;我们以前的方法需要额外的步骤来交换溶剂后纯化16。因此, 随后的制定过程只需要将所收集分数的乙醇含量减少到允许的水平, 并确保其 isotonicity, 这两者都可以通过稀释来完成。配方步骤是使用由单个配方单元操作组成的第二个程序执行的, 允许通过配方模块对纯化的产品分数进行可变体积的氯化钠溶液添加, 以考虑变量HPLC 纯化后获得的体积。如果所收集的产品分数体积被设置为常量, 则配方单元操作可以包含在主合成程序中, 从而避免了独立程序的需要。避免手动干预的另一种方法是使用配方模块的全部功能 (例如, 用水稀释纯化的示踪剂、C18 固相萃取盒上的疏水阀、洗净、洗脱固定体积的乙醇, 最后用固定量的盐水稀释)。
此处介绍的用于自动化和验证用于临床使用的合成协议的技术是相当普遍的。通过选择 radiosynthesizer (ELIXYS), 可以自动和验证各种合成。这包括复杂的 3-锅合成, 或涉及高温挥发性溶剂的合成。通过改变软件程序的参数, 可以实现对合成的优化。该合成器具有监测变化影响的功能, 例如定位反应容器以去除样品进行射频 TLC 或无线电 HPLC 分析。但是, 如果不进行系统修改, 系统目前不允许处理非常低的试剂体积 (约 5-20 µL)、中间产品蒸馏或处理 [18F] AlF、 68Ga 或其他 radiometals。如果手动合成要自动包含这样的步骤, 并且它们不能被规避, 自动化和验证与另一个 radiosynthesizer 平台可能是适当的。
虽然这项工作的重点是制定一项用于临床使用的 "18F" CFA 自动化生产的协议, 但许多其他 PET 示踪剂的合成可以以适合临床生产的方式自动进行, 遵循相同的逻辑和方法。按照此处介绍的方法, 我们还调整了 9-(4-[18F] 氟-3-羟甲基丁基) 鸟嘌呤 ([18F] FHBG) 的自动合成, 并验证了它的临床应用。用户建立的协议可以上传到苏菲探针网络, 并下载在不同的 radiopharmacy 站点27之间共享合成程序和相关文档的 web 门户。这可以避免社区的重复工作, 并促进涉及 PET 成像的多中心临床研究。
Disclosures
加州大学的董事们已经许可技术到苏菲, 这是由杰弗里柯林斯和 r. van 大坝发明的, 并已在苏菲的股权作为授权交易的一部分。此外, r. van 坝是苏菲的创始人和顾问。这项安排的条款已根据其利益冲突政策在洛杉矶加利福尼亚大学进行了审查和批准。埃里克施霍普夫和克里斯托弗. 德雷克是苏菲的雇员和股东。
Acknowledgments
这项工作由国家癌症研究所 (R44 CA216539) 和加州大学洛杉矶分校基金会部分支持, 由拉尔夫和马乔里克伦普为加州大学洛杉矶分校克伦普分子成像研究所捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELIXYS FLEX/CHEM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1010001 | Radiosynthesizer |
| Radiosynthesizer cassette | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1861030400 | Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM |
| ELIXYS PURE/FORM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1510001 | Radiosynthesizer purification module |
| [O-18]H2O | IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA) | IBA.SP.065 | >90% isotopic purity |
| [F-18]fluoride in [O-18]H2O | UCLA | N/A | Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil. |
| Deionized water | UCLA | N/A | Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter |
| Acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 271004 | Anhydrous, 99.8% |
| Ethanol (EtOH) | Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA) | 2701 | Anhydrous, 200 proof |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Merck (Burlington, MA, USA) | 1.09137.1000 | 1M solution |
| Hydrochloric acid (HCl) solution | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | SA48-500 | 1M solution |
| Ethyl acetate (EtAc) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | E195SK-4 | HPLC grade |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | S-640-500 | USP grade |
| Ammonium acetate | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | A639-500 | HPLC grade |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | P-208-500 | Certified ACS |
| CFA precursor | CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA) | N/A | Custom synthesis |
| Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2) | ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany) | 800.1000 | >99% |
| Sodium chloride (NaCl) solution (saline) | Hospira (Lake Forest, IL, USA) | 0409-4888-02 | 0.9%, for injection, USP grade |
| Silica cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT051900 | Sep-pak Classic |
| Quaternary methylammonium (QMA) cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT023525 | Sep-pak Light Plus |
| Sterile syringe filter (0.22 µm) | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | SLGSV255F | Millex-GV |
| Glass V-vial (5 mL) | Wheaton (Millville, NJ) | W986259NG | Used for reaction vessels |
| Septa | Wheaton (Millville, NJ) | 224100-072 | Used for reagent vials |
| Crimp cap | Wheaton (Millville, NJ) | 224177-01 | Used for reagent vials |
| Amber serum vial (2 mL) | Voigt (Lawrence, KS, USA) | 62413P-2 | Used for reagent vials |
| Magnetic stir bar | Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) | 14-513-65 | Used for reaction vessels |
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