Summary
في المختبر يمكن استخدام نماذج تولد الأوعية التاجية لاكتشاف الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية. في المختبر الثقافات الاستئصالية من الأنسجة الودينة والشغاف تظهر نموا قويا استجابة لVEGF-A وعرض نمط مماثل من التعبير COUP-TFII كما هو الحال في الجسم الحي.
Abstract
هنا، نصف في المختبر الثقافة الزرع لدراسة الأوعية التاجية. الأوعية التاجية تغذية عضلة القلب وذات أهمية سريرية. العيوب في هذه الأوعية تمثل مخاطر صحية شديدة مثل تصلب الشرايين، والتي يمكن أن تؤدي إلى احتشاء عضلة القلب وفشل القلب في المرضى. وبالتالي، فإن مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أهميتها السريرية، لم يتم إحراز تقدم يذكر نسبيا في كيفية تجديد الشرايين التاجية التالفة. ومع ذلك، فقد أُحرز تقدم في الآونة الأخيرة في فهم المنشأ الخلوي ومسارات التمايز لتطوير الأوعية التاجية. وكان ظهور الأدوات والتكنولوجيات التي تسمح للباحثين لتسمية خلايا السلف الفلورسنت، ومتابعة مصيرها، وتصور progenies في الجسم الحي، تلعب دورا ً أساسياً في فهم تطور الأوعية التاجية. في دراسات الجسم الحي قيمة، ولكن لها قيود من حيث السرعة، وسهولة الوصول، والمرونة في التصميم التجريبي. بدلا من ذلك، يمكن للنماذج الدقيقة في المختبر لتولد الأوعية التاجية التحايل على هذه القيود والسماح للباحثين لاستجواب الأسئلة البيولوجية الهامة بسرعة ومرونة. قد يكون عدم وجود أنظمة نموذج في المختبر المناسب قد أعاق التقدم في فهم الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الأوعية التاجية. هنا ، نصف نظام الاستزراع في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من الوريد الالجيوب الأنفية (SV) وendocardium (Endo)، وهما أنسجة السلف التي تنشأ منها العديد من الأوعية التاجية. كما أكدنا أن الثقافات تُلخص بدقة بعض الآليات المعروفة في الجسم الحي. على سبيل المثال، نحن نظهر أن براعم الأوعية في الثقافة من SV downregulate COUP-TFII التعبير مماثلة لما لوحظ في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن VEGF-A ، وهو عامل أنجيوجينيك معروف في الجسم الحي ، يحفز بقوة تولد الأوعية من كل من ثقافات SV و Endo. بشكل جماعي ، ابتكرنا نموذجًا دقيقًا في الثقافة المختبرية لدراسة تولد الأوعية التاجية.
Introduction
تسمى الأوعية الدموية للقلب عادة الأوعية التاجية. تتكون هذه الأوعية من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية. أثناء التطوير ، يتم إنشاء الشعيرات الدموية المتفرعة للغاية أولاً ، والتي تعيد تشكيلها بعد ذلك في الشرايين التاجية والأوردة1،2،3،4،5. يتم بناء هذه الشعيرات الدموية الأولية من الخلايا السلف البوالجينية الموجودة في proepicardium ، ووينوس الجيوب الأنفية (SV) ، وأنسجة الشغاف (Endo)1،6،7،8. SV هو عضو تدفق القلب الجنينية وإندو هو البطانة الداخلية للتجويف القلب. الخلايا السلف الاندوري وجدت في SV وEndo بناء غالبية الأوعية الدموية التاجية، في حين أن proepicardium يساهم في جزء صغير نسبيا منه2. وتسمى العملية التي تنمو بها الشبكة الشعرية للأوعية التاجية في القلب من خلاياها السليفة الموجودة مسبقًا تولد الأوعية التاجية. مرض الشريان التاجي هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم وحتى الآن لا يوجد علاج فعال لهذا المرض. يمكن أن يكون فهم الآليات الخلوية والجزيئية التفصيلية لتكوين الأوعية التاجية مفيدًا في تصميم علاجات جديدة وفعالة لإصلاح الشرايين التاجية التالفة وتجديدها.
في الآونة الأخيرة، تم تحقيق طفرة في فهمنا لكيفية تطور الأوعية التاجية جزئيا من خلال تطوير أدوات وتقنيات جديدة. على وجه الخصوص ، في تسمية النسب الحي وتقنيات التصوير المتقدمة كانت مفيدة للغاية في الكشف عن المنشأ الخلوي ومسارات التمايز للأوعية التاجية9،10،11،12. على الرغم من مزايا هذه في أدوات الجسم الحي ، هناك قيود من حيث السرعة والمرونة وسهولة الوصول. لذلك ، يمكن أن تكمل أنظمة النموذج المختبري القوية في أنظمة الجسم الحي لتوضيح الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية.
هنا، نصف نموذج في المختبر من تولد الأوعية التاجية. لقد قمنا بتطوير نظام زراعة الاستئصال في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من اثنين من أنسجة السلف، SV وEndo. مع هذا النموذج، ونحن نظهر أن الثقافات في الأنسجة المختبرية explant تنمو براعم الأوعية التاجية عندما حفزت من قبل متوسط النمو. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الثقافات النباتية بسرعة مقارنة بالتحكم عندما يحفزها عامل النمو البائي A (VEGF-A)، وهو بروتين أنجيوجينيك قوي للغاية. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن براعم الأوعية من ثقافة SV الخضوع إزالة التمايز وينوب (فقدان التعبير COUP-TFII)، وهي آلية مماثلة لتولد الأوعية SV في الجسم الحي1. هذه البيانات تشير إلى أن نظام الثقافة في المختبر explant يعيد بأمانة الأحداث الوعائية التي تحدث في الجسم الحي. بشكل جماعي ، في نماذج المختبر من تولد الأوعية التي يتم وصفها هنا مثالية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن الوصول إليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام جميع الحيوانات في هذا البروتوكول يتبع جامعة ولاية الكرة المؤسسية رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية.
1. إنشاء مربي الفئران والكشف عن المقابس المهبلية للحمل في الوقت المناسب
- إعداد قفص تربية الفئران مع الفئران نوع البرية الذكور والإناث. تأكد من أن عمر الفئران الخصبة بين 6-8 أسابيع. قم بإعداد إما زوج (ذكر واحد وأنثى واحدة) أو كثلاثي (ذكر واحد وأنثى 2) للتكاثر.
- تحقق من وجود قابس مهبلي في صباح اليوم التالي. استخدم مسبارًا معدنيًا بزاوية للكشف عن قابس عميق عن طريق إدخاله في فتحة المهبل. عيّن صباح القابس المهبلي الإيجابي ليكون يومًا جنينيًا 0.5 (e0.5).
ملاحظة: يمكن أن تكون المكونات المهبلية إما سطحية (والتي يمكن رؤيتها بسهولة ، انظر الشكل 1)أو عميقة (والتي لا يمكن رؤيتها بسهولة). وجود قابس عميق سيمنع الإدراج الكامل للمسبار في حين أن عدم وجود قابس سيسمح بالإدراج الكامل دون مقاومة. - الحفاظ على الحمل في الوقت المناسب حتى تصل الأجنة e11.5 التي سيتم حصادها. لتأكيد الحمل قبل حصاد الأجنة، سجل وزن الفئران الأنثوية بين e7.5 و e11.5.
ملاحظة: الزيادة اليومية في وزن الأم ستشير إلى نجاح الحمل، في حين أن أي تغيير في الوزن لن يشير إلى فشل الحمل.
2. حصاد الأجنة من الفئران الحامل
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: غرفة القتل الرحيمCO 2، 70٪ الإيثانول، المناشف الورقية، ملقط العادية، ملقط غرامة، مقص، 1x محلول ة مالحة معقمة الفوسفات (PBS)، 10 سم أطباق بيتري العقيمة، حاوية مع الثلج، ملعقة مثقبة، استئصال المجسم.
- وضع الماوس الحامل e11.5 في غرفة نظيفة CO2 القتل الرحيم للتضحية به. أغلق غطاء الغرفة لمنع الماوس من الهروب.
- بعد أن يتم تأمين الماوس في غرفة القتل الرحيم، بدوره على CO2. تأكد من تنظيم معدل تدفقثاني أكسيد الكربون لكل توصيات IACUC (أي 10-30٪ إزاحة في الدقيقة). بعد أن يتم قتل الفأر ة بالكامل، قم بخلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
- رش الماوس مع الإيثانول 70٪. رفع الجلد فوق البطن باستخدام ملقط، وجعل شق صغير باستخدام زوج من مقص وتمديد شق الاحقا. تكبير الشق الأمامي حتى الحجاب الحاجز وفضح قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة(الشكل 2).
- اسحب سلسلة الأجنة (قرن الرحم + الأجنة) عن طريق الإمساك بالرحم وقطعه مجانًا. ضع سلسلة الأجنة في الثلج البارد معقم 1x PBS.
- تشريح الأجنة الفردية من قرن الرحم عن طريق تقشير عضلة الرحم ، كيس الصفار ، وamnion واحدا تلو الآخر(الشكل 3A -F)تحت مجهري. نقل الأجنة تنظيفها باستخدام ملعقة مثقبة إلى طبق بيتري يحتوي على 1x مقسم تلفزيوني معقم على الجليد. تأكد من الحفاظ على الأجنة الباردة.
3. عزل القلوب من الأجنة e11.5
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون لديك المعدات والكواشف التالية: ملقط العادية، ملقط غرامة، 1x PBS العقيمة، 10 سم طبق بيتري المعقم، 6 سم طبق بيتري المعقم، حاوية مع الثلج، ملعقة مثقبة، تشريح المجسم.
- إعداد طبق بيتري جديد مع الجليد الباردة العقيمة 1x PBS تحت ستيريواستيرايمر. نقل الجنين من الخطوة 2.5 إلى طبق بيتري لتشريح خارج القلب.
- إزالة رأس الجنين باستخدام ملقط. أولا، اضغط على الرأس بين ملقط بيد واحدة ثم إزالة الرأس عن طريق كشط بعيدا مع اليد الأخرى باستخدام ملقط مغلقة(الشكل 4A-C).
- بعد إزالة الرأس ، قم بتوجيه الجنين بجانبه البطني لأعلى عن طريق الضغط على الجنين مع ملقط في بطنه بيد واحدة(الشكل 4D).
- مع جهة أخرى، فتح جدار الصدر من الجنين عن طريق إجراء أول شق صغير في الصدر قليلا فوق الحجاب الحاجز باستخدام ملقط غرامة. ثم تكبير شق بعناية فائقة عن طريق إدراج ملقط مغلقة وتمزيق جدار الصدر عن طريق فتح ملقط. تأكد من عدم دفع عميق جدا، والتي يمكن أن تلحق الضرر القلب. مع مساعدة من ملقط، والحفاظ على جدار الصدر مفتوحة على مصراعيها لفضح القلب والرئتين في تجويف الصدر(الشكل 4E).
- باستخدام ملقط ناعم، حرك القلب بلطف بشكل عرضي (90 درجة) وفضح الأورطا الظهري/الوريد. سحب القلب / الرئتين الأمامي عن طريق التقاط الأورطا الرُقّابة / الوريد عند قاعدة القلب(الشكل 4F-H).
ملاحظة: كن لطيفًا أثناء سحب القلب / الرئتين لتجنب تمزق SV ، والذي يقع في الجانب الظهري من القلب. - شطف القلب / الرئتين مع 1x الباردة PBS لإزالة خلايا الدم.
- كرر الخطوات 3.1-3.6 لإزالة القلب / الرئتين من الأجنة المتبقية. تأكد من الحفاظ على عزل القلب / الرئتين على الجليد.
4. عزل SVs وVentricles من e11.5 قلوب الفأر الجنينية
- ضع طبق بيتري مع القلب / الرئتين من الخطوة 3.7 تحت المجهر لعزل SVs والبطينين كله. قشر قبالة الفصوص المرفقة من الرئتين واحدا تلو الآخر من جذورها باستخدام ملقط غرامة.
- توجيه القلب على الجانب الظهري وإزالة الأذينين والأنسجة المجاورة التي تحيط SV الأمامي دون تمزيق SV. إزالة الأذين الأيمن والأيسر من القلب عن طريق عقد في قاعدتها وكشط تشغيله باستخدام ملقط غرامة(الشكل 5B). إزالة الأنسجة المجاورة المحيطة SV باستخدام تقنية مماثلة(الشكل 5C).
ملاحظة: ضع في اعتبارك أن الأذين الأيمن متصل بـ SV، لذا كن حذراً لإزالة الأذين فقط. - لعزل SV، أول توجيه القلب مع الجانب الظهري التي تواجه لأعلى (لأن SV هو على الجانب الظهري) والحفاظ على القلب لا يزال في هذا الموقف عن طريق عقد بلطف القلب في البطينين مع ملقط.
ملاحظة: SV هو عضو تدفق القلب الجنينية التي تقع بين الأذينين على الجانب الظهري من القلب. - إزالة SV بعناية عن طريق تقشير قبالة القلب حيث يتم إرفاقه أو عن طريق عقد SV في قاعدة مرفقها مع ملقط غرامة وكشط تشغيله مع ملقط مغلقة(الشكل 5D, E).
- نقل SV معزولة في طبق بيتري جديد 6 سم مع الجليد الباردة العقيمة 1x PBS على الجليد باستخدام ماصة نقل معقمة وتسمية طبق بيتري كما SV.
- لعزل البطينين كله، وإزالة القناة الخارج (الشريان الأورطان والجذع الرئوي) من القلب بعد إزالة SV(الشكل 5F، G).
- نقل البطينين كله في طبق بيتري جديد 6 سم تحتوي على 1x PBS معقمة على الجليد باستخدام ماصة نقل معقمة وتسمية طبق بيتري والبطينين. الحفاظ على SV معزولة والبطينين على الجليد.
- كرر الخطوات 4.1-4.7 لعزل SVs والبطينين من القلوب المتبقية.
5. إعداد لوحات زراعة الأنسجة مع إدراج وطلاء مصفوفة خارج الخلية
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من الحصول على المعدات والكواشف التالية: محلول مصفوفة خارج الخلية التجارية (ECM؛ على سبيل المثال، Matrigel)، 8.0 ميكرومتر البولي إيثيلين terephthalate (PET) إدراج الثقافة، 24 لوحات بئر، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
- دع محلول ECM يذوب على الجليد. الحفاظ على حل ECM على الجليد لتجنب التصلب.
- ضع الكائنات البوزيتائية البوزيترونية (حجم المسام = 8.0 ميكرومتر، منطقة الترشيح = 0.3 سم2،قطر المرشح = 6.5 مم) في آبار الثقافة غير النسيجية المعالجة 24 لوحة بئر. قم بتسمية اللوحات على أنها SV أو البطينين لـ SV أو تنظير تكوين الأوعية في البُرِح، على التوالي.
ملاحظة: قم بإعداد الإدراجات في لوحات منفصلة لـ SV والبطينين عند تنفيذ كلا الثقافتين في وقت واحد. تأكد من إعداد ما يكفي من الآبار لجميع العينات التجريبية والضوابط. - بعد إذابة محلول ECM، قم على الفور بتخفيف ECM 1:2 في وسط القاعدي ة مسبقالتبريد (أي، وسط القاعدي EBM-2، انظر جدول المواد)إلى حجم كاف (100 ميكرولتر/إدراج عدد من الإدراجات).
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان هناك ستة إدراجات، فإن الحجم الإجمالي سيكون 100 ميكرولتر × 6 = 600 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من ECM إلى 400 ميكرولتر من الوسط القاعدي. - معطف إدراج مع 100 ميكرولتر من ECM المخفف حديثا عن طريق إضافته مباشرة على رأس الغشاء. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للECM لترسيخ.
ملاحظة: يجب أن يتم ذلك تحت غطاء الأنسجة تدفق لامينار لتجنب التلوث.
6. SVs وكامل Ventricles الثقافات
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: الإيثانول 70٪، نقل ماصة، stereomicroscope، ملقط، اللامي تدفق الأنسجة الأنسجة الثقافة هود، طقم تكملة الخلية الانثنائي الأوعية الدقيقة(جدول المواد)،المتوسطة القاعدية، 1x مقسم معقم). يوضح الشكل 6 سير عمل ثقافة SV والبطين.
- إذابة محتويات مجموعة الملحق على الجليد. إعداد المتوسطة كاملة عن طريق إضافة جميع محتويات عدة الملحق في 500 مل من المتوسطة القاعدية تحت غطاء الأنسجة تدفق لامير معتمدة. مزيج جيدا المتوسطة وتوزيعها في 50 مل aliquots.
- قم بتعقيم قاعدة المجهر المجسم ومنطقة العمل المحيطة به مع الإيثانول بنسبة 70٪.
- الحصول على لوحات زراعة الأنسجة من الخطوة 5.4. مع المعونة من ماصة نقل، ونقل بعناية explants من الخطوة 4.7 على رأس غشاء إدراج. تحت المجسم وبمساعدة ملقط نظيفة، ضع الإكساب في وسط الغرز لضمان عدم وجود هازفير في زاوية الغرز أو تعلق على الجدران الجانبية.
- بعد وضع explants وتركزت على إدراج، وإزالة بعناية أي PBS إضافية من إدراج وإغلاق أغطية لوحات.
- تحت غطاء الأنسجة تدفق laminar الأنسجة، إضافة 100 ميكرولتر من الوسط الكامل prewarmed على رأس إدراج و 200 ميكرولتر في الآبار لثقافة explants في واجهة الهواء السائل بحيث السطح القاعدي للإدراج هو في اتصال مع المتوسطة ، ولكن السطح العلوي يتعرض للهواء.
ملاحظة: تأكد من ضبط مستوى الصوت للحصول على واجهة سائل ة هوائية إذا كنت تستخدم أحجام ًا مختلفة / لوحات جيدة. - أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الآبار غير المستخدمة من لوحات الآبار الـ 24 وغطيها بالغطاء. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة، وتنمو الثقافات لمدة 5 أيام.
- في الأيام التالية ، لاحظ بشكل روتيني الثقافات تحت مجهر الضوء المقلوب لتقييم حالة الثقافات الطاردة. تأكد من أن explants عرض الضرب انقباض وأن تعلق جميع explants إلى الجزء السفلي من الغشاء جزءا لا يتجزأ من ECM. يحيط علما بأي explants العائمة.
ملاحظة: يشير الانكماش الدوري للنباتات الخارجية إلى أنها على قيد الحياة. وينبغي حذف النباتات العائمة من التحليل. - بعد تقييم حالة الثقافة، وضع لوحة الثقافة مرة أخرى في الحاضنة والاستمرار في تنمية الثقافة لمدة تصل إلى 5 أيام.
7. علاج الثقافات مع VEGF-A (التحكم الإيجابي)
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة تدفق التصفيمي، 1x PBS، المتوسطة القاعدية + 1٪ مصل الأبقار الجنين (FBS)، المتوسطة القاعدية + VEGF-A، ماصة، ونصائح ماصة.
- إعداد المتوسطة القاعدية + 1٪ FBS والمتوسطة القاعدية + VEGF-A.
- لإعداد الوسيط القاعدي + 1٪ FBS، أولاً تحديد عدد آبار التحكم المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان هناك ثلاثة آبار التحكم، ثم 300 ميكرولتر / بئر × 3 = 900 ميكرولتر هو الحجم الإجمالي اللازم. أضف 9 ميكرولتر من FBS إلى 891 ميكرولتر من الوسط القاعدي لجعل الوسط القاعدي + 1٪ FBS.
- لإعداد الوسط القاعدي + VEGF-A، حدد أولاً العدد الإجمالي للآبار التي تحتاج إلى وسيط VEGF-A. إذا كان هناك ثلاثة آبار، ثم 300 ميكرولتر / بئر × 3 = 900 ميكرولتر هو الحجم الإجمالي و 50 نانوغرام / جيد × 3 = 150 نانوغرام VEGF-A. إضافة 150 نانوغرام من VEGF-A إلى 900 ميكرولتر من المتوسطة القاعدية لجعل المتوسطة القاعدية + VEGF-A.
ملاحظة: تجميع هذا الحل في وحدة تخزين أكبر من المحسوبة لتأمين عدد كاف من aliquots أصغر لكل تجربة.
- في اليوم الثاني، قم بإزالة الوسائط من الغرفتين (الإدراجات والآبار). غسل الثقافات مع 300 ميكرولتر من 1x PBS عن طريق إضافة 100 ميكرولتر إلى إدراج و 200 ميكرولتر في الآبار. دوامة بحزم لوحات عدة مرات وإزالة برنامج تلفزيوني.
- أضف 300 ميكرولتر من المتوسط القاعدي + 1% FBS (100 ميكرولتر في الإدراج و200 ميكرولتر في الآبار) لتجويع الثقافات لمدة 24 ساعة.
- في اليوم الثالث، بعد المجاعة، أضف 300 ميكرولتر من المتوسط القاعدي + 1% FBS (100 ميكرولتر في الإدراج و200 ميكرولتر في الآبار) إلى آبار التحكم والمتوسطة القاعدية + VEGF-A (50 نانوغرام/بئر) في آبار العلاج، على التوالي.
- بعد العلاج، ومواصلة تنمية الثقافات في الحاضنة.
8. التثبيت وتلطيخ المناعة
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من الحصول على المعدات والكواشف التالية: 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 1x PBS، الأجسام المضادة الأولية والثانوية، شاكر، 0.5٪ خافض للتوتر السطحي غير الأيوني في PBS (PBT).
- في اليوم السادس من الزراعة، وإزالة الثقافات المتوسطة وغسل مع 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إصلاح الثقافات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول PFA بنسبة 4٪ في الآبار و 100 ميكرولتر في الإدراج. إصلاح الثقافات في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء الهزاز.
- بعد تثبيت 20 دقيقة، وإزالة PFA من الثقافات في غطاء الدخان وغسل الثقافات مع 1x PBS عن طريق إضافة 200 ميكرولتر في الآبار و 100 ميكرولتر في إدراج.
- تكرار غسل 3x، 10 دقيقة لكل منهما، في حين هزاز. ثم المضي قدما لأداء المناعة.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل على سطح البدلاء في RT.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية (المضادة VE-Cadherin، المضادة ERG 1/2/3) في حل حجب (5٪ مصل حمار، 0.5٪ PBT). أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (200 ميكرولتر في الآبار السفلية و100 ميكرولتر في الإدراجات). احتضان الثقافات في الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز.
ملاحظة: يستخدم المضادة VE-كادهيرين لتسمية غشاء الخلية البطانة ومكافحة ERG 1/2/3 يستخدم لتسمية نواة الخلية البطانة من أجل تصور براعم الأوعية من الخلايا البطانة. - في اليوم التالي، وغسل والصخور لوحات الثقافة 10x في 0.5٪ PBT، وتغيير PBT كل 10 دقيقة.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الحمار المضادة للفئران اليكسا فلور 488 والحمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 555) في حل منع. أضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي كما هو الحال في الخطوة 8.2 واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أثناء الهزاز. في اليوم التالي، اغسل الأجسام المضادة الثانوية 10x في PBT، وتغيير PBT كل 10 دقيقة.
ملاحظة: غسل ما لا يقل عن 10x ولكن أكثر يغسل هي أفضل. بعد اكتمال السُلم، يمكن تخزين الثقافات مع 1x PBS حتى يتم تركيبها على الشرائح.
9. تصاعد الثقافات على الشرائح والتصوير والتحليل
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: ملقط غرامة، والشرائح، وتركيب المتوسطة مع 4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)، coverslips، والمجهر البؤري. بعد تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية، قم بتركيب الثقافات على الشرائح للتصوير باستخدام الخطوات التالية.
- قشر قبالة الغشاء بعناية من إدراج باستخدام ملقط غرامة ونقله إلى الشرائح عن طريق وضع الجانب الغشاء إلى أسفل ووضع الثقافات explant صعودا. ضع عينات النسخ المتماثل في نفس الشرائح وتسمية الشرائح كتحكم أو VEGF-A. إضافة بضع قطرات من وسط تصاعد مع DAPI مباشرة على الغشاء وتغطية الشرائح مع زلات الغطاء.
ملاحظة: تأكد من تجنب فقاعات الهواء أثناء وضع القسائم. - ختم قبالة حواف الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة والسماح الجافة.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. - شرائح الصورة باستخدام المجهر البؤري.
- إجراء تحليل لقياس طول النمو الوعائي. قياس طول النمو الوعائي عن طريق قياس مسافة الخلايا الفيوليلية (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) الممتدة من الحدود الداخلية لخلايا ERG 1/2/3+ في ثقافات البطين ومن مركز explants SV في ثقافات SV.
- لإجراء القياس الكمي باستخدام فيجي/ ImageJ، قم أولاً بتنزيل برنامج فيجي.
- فتح ملفات الصور في فيجي: انتقل إلى ملف | فتح | مجلد | اسم الملف | فتح.
- انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات | حدد المحيط.
- حدد أداة الخط المستقيم من النافذة الرئيسية.
- رسم خط عبر طول براعم كما هو مقترح في الخطوة 9.4.
- انتقل إلى تحليل | قياس.
ملاحظة: يتم عرض قياسات الطول في الإطار الجديد. - تنفيذ القياس الكمي في الصور التي تمثل ثلاثة حقول عرض محددة عشوائيًا على الأقل. متوسط قياسات طول براعم والإبلاغ عنها كمتوسط ± الانحراف المعياري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واحدة من السمات الأكثر لفتا للتولد الوعائي SV في الجسم الحي هو أنه يتبع مسارمحدد وينطوي على إزالة التمايز الخلية والأحداث التي تحدث في الأوقات النمطية والمواقف1. كما تنمو خلايا SV الأولية على البطين القلب، فإنها تتوقف عن إنتاج علامات وينوية مثل COUP-TFII(الشكل 7). في وقت لاحق، براعم الشريان التاجي اتخاذ مسارين الهجرة، إما على سطح القلب أو عميقة داخل عضلة القلب. السفن السطحية تصبح في نهاية المطاف الأوردة في حين أن السفن الغازية تصبح الشرايين والشعيرات الدموية1،6،7. يتم الحفاظ على هذا التمييز مع نمو القلب وتوسع الأوعية الدموية التاجية.
لتسهيل اكتشاف الأسس الجزيئية للتنمية التاجية ، وضعنا نموذجًا في المختبر لتنتشر SV التي يمكن استخدامها لفقدان الوظيفة وتجارب كسب الوظيفة. يتم تشريح أنسجة SV من قلوب الفئران الجنينية ، ووضعها على الجزء العلوي من ECM المخفف (وهو متاح تجاريًا ، انظر Table of Materials)، والحفاظ عليها في واجهة الهواء السائل في وسط نمو الخلايا الفيوذيلية. يستمر عضلة القلب SV في التغلب عليها طوال فترة الثقافة. بعد 2 أيام في الثقافة، والخلايا epicardial التي خط الأنسجة ترك explant وترحيل ها إلى المصفوفة. بعد 5 أيام، تنبت الخلايا الفيوليلية SV وتهاجر إلى الأنسجة الملحمية(الشكل 8A، رؤوس الأسهم السوداء). بشكل جماعي ، هذه العملية تُلخص الجوانب الوعائية للتطور التاجي.
براعم SV المستزرعة تخضع أيضًا لإزالة التمايز وينوى. كما هو الحال في القلب الجنيني ، يتم تقليل التعبير COUP-TFII حيث تهاجر الأوعية بعيدًا عن SV(الشكل 8B، مقارنة بالرقم 7). يمكن أن تنتج أوعية التحكم مثل الشرايين الكيس السري أو الصفار والأوردة أوعية تنبت. ومع ذلك ، فهي أقل في العدد وأقصر في الطول ولا تغير هويتها الشريانية أو الوداعية (غير مبين). وبالتالي ، فإن إعادة البرمجة الوريدة خاصة بانتشار SV وليست سمة عامة لتولد الأوعية أو استجابة لمكونات ECM. وتشير هذه البيانات أيضاً إلى أن أنواع الخلايا الواردة في الـ SV نفسها ضرورية وكافية للحث على إزالة التمايز.
ومن المعروف جيدا أن عامل النمو الانائي الوعائي A (VEGF-A) هو محفز قوي لتولد الأوعية7،13،14،15،16،17،18. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن VEGF-A عضلة القلب يحفز تولد الأوعية الانجية لتنمو الأوعية التاجية7. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت الخلايا الفيوليلية التاجية للتعبير عن مستقبلات VEGF-A، والأوعية التاجية المشتقة من SV في عضلة القلب قد تنمو استجابة لVEGF-A في الجسم الحي2. لإظهار أن نموذجنا المختبري لتولد الأوعية التاجية يستجيب بإخلاص لـ VEGF-A ، قمنا بتحفيز ثقافات SV و Endo مع VEGF-A. كما هو متوقع، أظهرت نتائجنا أن كلا من SV و Endo تستجيب بشكل كبير لVEGF-A. الثقافات حفز مع VEGF-A تظهر زيادة نمو براعم الأوعية على حد سواء في الكثافة والطول(الشكل 9A, C). الثقافات SV التي حفزتها VEGF-A تظهر زيادة 3 أضعاف تقريبا في طول براعم مقارنة مع السيطرة(الشكل 9B). هذه النتائج تشير إلى أن براعم الفيوثيليال من SV وEndo تستجيب لإشارات مماثلة التي هي معروفة في الجسم الحي.
إذا ما أُخذت بياناتنا معاً، تشير إلى أن هذه الثقافات في المختبر تتشارك في أحداث خلوية وجزيئية مماثلة تحدث أثناء عملية تطوير الشريان التاجي في الجسم الحي، بما في ذلك إزالة التمايز والانتشار القوي استجابة ً لتحفيز VEGF-A. لذلك ، تشير بياناتنا إلى أن نماذج الاستزراع البُنائية هذه مفيدة لدراسة تولد الأوعية التاجية في المختبر.
الشكل 1: تحديد المكونات المهبلية. (أ)قابس المهبل (بقعة بيضاء). (ب)عرض مكبر للمنطقة محاصر بما في ذلك المكونات المهبلية (المشار إليها بالسهم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الوصول إلى سلسلة الجنين في رحم فأر حامل. يتم وضع الماوس الحامل القتل الرحيم مع سطحه البطني حتى ورشها مع الإيثانول 70٪ إلى الجلد الرطب لتشريح. يتم سحب الجلد في منطقة الحوض باستخدام ملقط ويتم إجراء شق صغير. يتم تمديد الشق بشكل ٍ غير واضح. يتم إجراء شق إضافي بشكل الأمامي حتى الحجاب الحاجز. في الرحم، تظهر سلسلة من الأجنة (يشار لها برؤوس الأسهم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشريح الأجنة وإزالتها من الرحم. (أ)صورة تظهر الرحم الذي يحتوي على سلسلة من الأجنة. يتم تقشير الغشاء على الجانب الظهري من الجنين (مقابل الجانب الذي تقع فيه المشيمة). (ب)الجنين في كيس صفار يصبح مرئيا بعد تقشير قبالة غشاء الرحم. (C, D) الجنين تعلق على المشيمة مع الحبل السري مرئيا بعد تقشير قبالة كيس صفار. يتم تقشير Amnion قبالة إذا كان لا يزال موجودا. (هـ)صورة تظهر جنيناً ملتصقاً بالمشيمة بواسطة الحبل السري. (واو)صورة تظهر فصل الجنين عن المشيمة عن طريق سحب الحبل السري (Umb). الحبل) باستخدام ملقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إزالة نتف القلب/الرئتين من الأجنة. (A, B) يتم إزالة الرأس من الجنين عن طريق التقاط في الرقبة وكشط تشغيله. (ج)صورة تظهر إزالة الرأس من الجسم. (د)الوضع الصحيح للجنين لتشريح القلب. يتم وضع الجنين مع الجانب البطني حتى يكون من السهل الوصول إلى تجويف الصدر لإزالة القلب. بمجرد وضع الجنين كما هو موضح في D ، يتم فتح تجويف الصدر مع ملقط. (E)صورة تظهر تجويف الصدر المفتوح مع تعرض القلب على جانبه البطني. (F)لإزالة القلب دون الإضرار SV، وقلب القلب الأمامي، ويصبح الأورطا الظهري مرئية. (ز)صورة تظهر الموقف في قاعدة القلب / الرئتين حيث يتم التقاط الأورطا الظهري / الوريد مع ملقط ويتم سحب نتف القلب / الرئتين خارج الأمامي. (H)تظهر الصورة نتف القلب / الرئتين e11.5 إزالتها من الجنين. V. القلب = القلب البطني; د. القلب = القلب الظهري؛ د. أورتا = أورتا الظهرية؛ LA = الأذين الأيسر; RA = الأذين الأيمن؛ LV = البطين الأيسر; RV = البطين الأيمن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عزل SV والبطينين من القلوب الجنينية. (أ)صورة تظهر وجهة النظر الظهرية للقلب المعزول / الرئتين نتف من الجنين e11.5. ويشار إلى موقع SV في القلب. (ب)صورة للقلب بعد إزالة براعم الرئة. (ج)تتم إزالة الأتاريا والأنسجة المجاورة المحيطة SV، والكشف عن الأورطا. يتم وضع علامة على موقع SV. (د)صورة تظهر إزالة SV. باستخدام ملقط، وسيطرت SV في قاعدتها وكشط قبالة من القلب. (E)يتم عرض SV إزالتها من القلب جنبا إلى جنب مع الأنسجة المتبقية من القلب. يصبح الشريان الأورطا والجذع الرئوي (PT)، الذي يسمى بشكل جماعي مسار التدفق الخارجي (OFT)، مرئيًا في القلب بعد إزالة SV. سيتم استخدام SV للثقافة المختبرية، كما هو موضح في الشكل 6 (اللوحة اليسرى). (واو)يتم وضع OFT ليتم تشريحها بخط أبيض متقطع. (ز)تتم إزالة الأورطا / PT (مسار التدفق) من البطينين عن طريق تشريح في الموقف المبين في لوحة F. وتستخدم البطينات المتبقية دون OFT لثقافات البطين كما هو مبين في الشكل 6 (اللوحة اليمنى). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التخطيطي الذي يظهر سير عمل ثقافة SV والبطين. إلى اليسار: إجراء لثقافة SV. أولاً، تتم إزالة SV من قلوب e11.5 ووضعها على إدراج الثقافة. إدراج يحتوي على غشاء مسامية في الجزء السفلي (8 ميكرومتر المسام) والمغلفة مع عامل النمو انخفاض ECM. يتم وضع إدراج في آبار لوحة 24 جيدا. يتم إضافة المتوسطة على حد سواء في الغرفة السفلية والعليا دون تغطية explant. وتزرع الثقافة لمدة 5 أيام. بعد 5 أيام ، تتم إزالة الغشاء من الإدراج ويتم تركيبه على الشرائح للتصوير والتحليل. إلى اليمين: إجراء لثقافة البطين. تتم إزالة البطينين بدون SV والأذينين وOFT من قلوب e11.5 ويتم استزراعها كما هو موضح أعلاه لـ SV. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: يتم فقدان التعبير COUP-TFII في براعم SV في الجسم الحي. (أ)وجهة نظر الظهر من قلوب e11.5. صورة كونتشال لعلامة بطانة (أحمر) التي تلصق الجيوب الأنفية وينوس (SV) ، وبراعم الشريان التاجي (cs ، خط منقط) ، وبطانة (endo) بطانة تجويف القلب. (ب)صانع الوريدية COUP-TFII (الأخضر), عامل النسخ الوريد (trx), وأعرب في SV فقدت تدريجيا كما براعم ترك SV وتنمو على البطين. إلى اليمين: أعلى التكبير من براعم الشريان التاجي هو مبين في المنطقة محاصر من لوحة A. مقياس شريط = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: نماذج في المختبر للهوية وريدوووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو (أ)صورة برايتفيلد من الأنسجة SV المستزرعة. تنمو براعم الأوعية الدموية (رؤوس الأسهم) من الإكسينج الأصلي (الخط المنقط الأسود) فوق ركيزة ECM. (ب)الفلورية المناعية لثقافات SV المسماة بالأجسام المضادة التي تميز سطح الخلية الفيوليلي (VE-Cadherin) ونواة الخلايا الفيوطية (ERG 1/2/3) ونواة الوريد وepicardial (COUP-TFII). النوى إيجابية لكل من ERG 1/2/3 وCOUP-TFII في SV ، ولكن ERG 1/2/3 فقط في براعم الهجرة عبر ECM. مقياس شريط = 50 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: SV والشغافات تستجيب لVEGF-A في المختبر. (أ)صورة Confocal من السيطرة 5 أيام من العمر وVEGF-A معاملة SV ثقافة explant. الخلايا الاندوثرية هي المناعة الملطخة مع VE-cadherin (الأخضر), نواة الخلايا الانديوثرية ملطخة ERG 1/2/3 (الأحمر) الأجسام المضادة, ونواة الخلية مع DAPI (الأزرق). (ب)يتم قياس نمو الأوعية للخلايا الفيوائية عن طريق قياس طول امتداد تنبت (المسافة التي هاجرها ERG 1/2/3+ الخلايا البُنائية من النبتة، المشار إليه بخطوط صلبة بيضاء في الألواح السفلية من (A). (C)صورة Confocal من ثقافة 5 أيام من العمر من السيطرة والبطينات VEGF-A المعالجة. الخلايا الاندوثيلية هي المناعة الملطخة مع VE-cadherin (الأخضر) ونواة الخلايا البُنثية ملطخة بأجسام مضادة ERG 1/2/3 (أزرق). النقاط هي قياسات فردية وأشرطة الخطأ هي تعني ± SD. مقياس شريط = 200 ميكرومتر(A, C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بعض الخطوات الأكثر أهمية لزراعة الأوعية التاجية بنجاح من أنسجة السلف SV وEndo هي: 1) تحديد وعزل أنسجة SV بشكل صحيح لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV بشكل صحيح لاستزراع SV. 2) استخدام البطينين من الأجنة بين أعمار e11−11.5 لثقافة الإندو الدقيقة؛ 3) الحفاظ على الظروف المعقمة طوال فترة التشريح والحفاظ على الأنسجة الباردة في جميع الأوقات؛ و 4) الحفاظ على explants تعلق على الغشاء المغلفة ECM لتجنب الأنسجة العائمة في المتوسط.
أولاً، يمكن أن يكون عزل أنسجة SV تحديًا. من المهم أن ندرك أن SV يكمن على الجانب الظهري من القلب بين الأذينين الأيسر والأيمن مخبأة داخل الفصيصات الرئوية. لذلك، من الصعب فصل وعزل. بدلا من ذلك، يجب استخراج القلب كله / نتف الرئتين أولا. ثم يتم عزل SV من نتف عن طريق إزالة فصيصات الرئة بعناية وتنظيف الأنسجة المجاورة بمساعدة ملقط غرامة. وعلاوة على ذلك، يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في حين تنظيف الأنسجة المجاورة لعدم فقدان SV.
ثانياً، للحصول على تكوين وعائي دقيق لتولد الأوعية في القوباء، من المهم زراعة البطينين من أجنة لا يزيد عمرها عن e11.5. في e12.5 والأجنة الأكبر سنا، التاجية من SV تنمو إلى نسبة كبيرة من البطينين. لذلك ، يمكن أن تتكون الأوعية التاجية التي تنمو من البطينين القديم من كل من الأوعية التاجية المشتقة من SV و Endo1،2،10،19،20. لهذا السبب، وبدقة إلى فحص نمو الأوعية التاجية من Endo، فمن الأهمية بمكان لالبالتيات الثقافة (ناقص SV والتدفق إلى الخارج) من الأجنة e11.520. بالإضافة إلى ذلك، SV أكبر نسبياً وأسهل عزل في e11.5.
ثالثا، لأن البروتوكول ينطوي على كمية كبيرة من العمل خارج غطاء زراعة الأنسجة، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على بيئة عمل معقمة. من المهم تعقيم أدوات التشريح (ملقط، مقص، الخ) ولوحات زراعة الأنسجة وتجنب الاتصال مع المناطق غير المعقمة في جميع الأوقات. من المهم رش منطقة العمل وتشريح النطاق مع الإيثانول 70٪. لتجنب التلوث ، من المهم إجراء عملية التشريح بسرعة وتقليل العمل خارج غطاء زراعة الأنسجة.
رابعا ، للحصول على ثقافات خارجية صحية ، من المهم أن تبقى النباتات القابلة للتركيب ملتصقة بقاعدة الغشاء في جميع الأوقات. يجب تجنب النبتات العائمة في الوسط لتنمو بنجاح الثقافات explant. لتجنب العائمة، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على واجهة الهواء السائل حيث السطح القاعدي للإدراج هو في اتصال مع المتوسطة، ولكن يتعرض السطح العلوي للهواء. يتم الحصول على مثل هذه الواجهة عندما يتم تغطية explant بما فيه الكفاية من قبل الوسط ولكن لا يتم غمرها بالكامل. من المهم مراقبة حجم المتوسط يوميًا ، حيث يمكن فقدان الحجم بسبب التبخر. لمنع هذا، يمكن ترطيب لوحة الثقافة عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني في الآبار غير المستخدمة من لوحات الثقافة.
وصفت ثقافات مماثلة explant SV وEndo في مكان آخر20. في هذه الأساليب ، تم استزراع النباتات الخارجية مباشرة في آبار لوحات زراعة الأنسجة ، مما يحد من التصوير المعالبؤر عالي الدقة. الصور التي تم التقاطها في هذا الإطار ضعيفة نسبيا ً من حيث الجودة مقارنة بالطريقة المقترحة هنا ، مما يحد من التحليلات المجهرية التفصيلية. للتحايل على هذا، ونستخدم إدراج الثقافة التي يمكن من الأغشية التي تحتوي على الثقافة أن تكون مقشرة قبالة وشنت على الشرائح الزجاجية للتصوير. وهذا يسمح للتصوير البؤري عالي الدقة حيث يمكن عرض التفاصيل الخلوية مثل أنماط التعبير ومورفولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب الاستزراع مباشرة على اللوحات بروتوكول تلطيخ منفصل لـ DAPI أو تلطيخ علامة نووية أخرى. لا يتطلب هذا البروتوكول خطوات تلطيخ منفصلة لأنه يمكن تحميل الشرائح مع وسط متصاعد يحتوي على DAPI. وعلاوة على ذلك، فإن التركيب على الشرائح يسمح بالتخزين على المدى الطويل دون تلاشي الفلورسنت، في حين أن الثقافات المخزنة في الآبار ذات الوسط السائل ستؤدي إلى تلاشي سريع وليست قابلة للتخزين والتصوير على المدى الطويل.
نماذج الثقافة المختبرية الموصوفة هنا مثالية لاستجواب الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن الوصول إليها. يمكن استخدام هذا النظام في المختبر لفحص الأدوية المحتملة أو الأهداف الجزيئية لتقييم تأثيرها على تولد الأوعية التاجية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام أيضًا لدراسة اكتساب الوظيفة وفقدان وظيفة الجينات المختلفة لوظيفتها المستقلة في تولد الأوعية التاجية. لاحظنا أن براعم الشريان التاجي من SV اتبعت الهجرة الملحمية في ثقافاتنا المختبرية ، مما يشير إلى تفاعل مهم بين الخلايا البطانية التاجية والخلايا الملحمية. ومن المعروف جيدا أن epicardium هو مصدر غني لعوامل النمو لتولد الأوعية التاجية من SV. على سبيل المثال ، وقد ثبت سابقا عوامل النمو المستمدة epicardial مثل VEGF - C وELABELA لتنظيم تولد الأوعية التاجية المشتقة من SV2،19. يمكننا استخدام هذا النظام الثقافة SV لمزيد من التحقيق في التفاعل بين epicardium والخلايا البواثيلية التاجية وتحديد المسارات الجزيئية المشتقة من epicardial الرواية من تولد الأوعية التاجية. بالإضافة إلى ذلك، لدينا في بيانات الجسم الحي تشير إلى أن نقص الأكسجة عضلة القلب قد تشارك في تولد الأوعية الانجيوية الغدد19. يقدم نظام نا في المختبر الثقافة نموذجا ممتازا لدراسة دور نقص الأكسجة في تولد الأوعية في الغدد الأصلية عن طريق احتضان الثقافات في ظروف نقص الأكسجة أو normoxic. هذه هي التجارب التي يصعب إجراؤها في الجسم الحي لأنه يتطلب وضع فأر حامل في غرفة نقص الأكسجة الخاضعة للرقابة. من تجربتنا الخاصة، فإنه من الصعب جدا الحصول على نتائج متسقة وموثوق بها من التجارب في الجسم الحي. باختصار، لدينا نموذج المختبر من تولد الأوعية التاجية يوفر نظام موثوق به لاستجواب مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بالبيولوجيا الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر شارما على توفير بيئة بحثية داعمة. نود أن نقدم لكم شكرا خاصا لديان (دي) R. هوفمان الذي يحافظ ويهتم لدينا مستعمرة الماوس. كما نود أن نشكر الدكتورين فيليب ج. سمالدينو وكارولين فان على تدقيق المخطوطة بدقة وتقديم تعليقات مفيدة. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من مكتب عميد جامعة ولاية بول وقسم البيولوجيا إلى بكالوريوس، وأكاديمية إنديانا للعلوم صناديق منحة البحوث العليا إلى B.S، والمعاهد القومية للصحة (RO1-HL128503) ومؤسسة الخلايا الجذعية في نيويورك أموال إلى K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
