Summary
מחקר זה מתאר את השיטה של הזרקה תוך-מפרקית של מונו-יודואצטט בחולדות ודן בהתנהגויות הקשורות לכאב כתוצאה מכך ובשינויים היסטופתולוגיים, המספקים סימוכין ליישומים עתידיים.
Abstract
ניתן לחלק את המודלים החייתיים הנוכחיים של דלקת מפרקים ניוונית (OA) למודלים ספונטניים ומודלים מושרים, שמטרתם לדמות את השינויים הפתופיזיולוגיים של OA אנושי. עם זאת, כתסמין העיקרי בשלב מאוחר של OA, הכאב משפיע על חיי היומיום של החולים, ואין הרבה מודלים זמינים. המודל המושרה על ידי מונו-יודואצטט (MIA) הוא מודל הכאב OA הנפוץ ביותר, המשמש בעיקר במכרסמים. MIA הוא מעכב של גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז, הגורם למוות של כונדרוציטים, ניוון סחוס, אוסטאופיט ושינויים מדידים בהתנהגות בעלי חיים. חוץ מזה, ניתן לזהות שינויי ביטוי של מטריקס מטאלופרוטינאז (MMP) וציטוקינים מעודדי דלקת (IL1 β ו- TNF α) במודל המושרה על ידי MIA. שינויים אלה עולים בקנה אחד עם תנאים פתופיזיולוגיים של OA בבני אדם, מה שמצביע על כך ש-MIA יכול לגרום למודל כאב OA מדיד ומוצלח. מחקר זה נועד לתאר את המתודולוגיה של הזרקה תוך-מפרקית של MIA בחולדות ולדון בהתנהגויות הקשורות לכאב ובשינויים היסטופתולוגיים הנובעים מכך.
Introduction
אוסטאוארתריטיס (OA) היא מחלת המפרקים הנפוצה ביותר בעולם, הפוגעת בכ-10-12% מאוכלוסיית המבוגרים1. המפרק המעורב ביותר הוא הברך, ול-OA יש שכיחות גבוהה יותר בקרב מבוגרים, במיוחד נשים2. כמחלה כרונית, OA מתפתחת בהדרגה במשך עשרות שנים לכשל במפרקים עם תסמינים כגון אובדן סחוס, דלקת סינוביאלית, אוסטאופיטוזה, ירידה בתפקוד וכאב כרוני3. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), OA היא המחלה הרביעית בשכיחותה אצל נקבות והמחלה השמינית בשכיחותה אצל גברים. עד 2020, OA עשויה להפוך למחלה הרביעית הכי משביתה בבני אדם4. עם זאת, הטיפולים הזמינים כיום של OA מטפלים רק בסימפטומים ומאריכים את הזמן עד לניתוח החלפת מפרקים5.
OA ספונטני בחולים אנושיים לעתים קרובות לוקח זמן רב כדי לייצר סימפטומים קליניים כגון כאב הקשור למפרקים6. בשלבים המוקדמים של OA, הכאב הוא בדרך כלל לסירוגין והופך תכופים וחמורים יותר ככל שהמחלה מתקדמת, מה שהופך אותו לתלונה השלטת של חולים7. לכן, מודלים נרחבים של בעלי חיים לכאבי OA פותחו בחצי המאה האחרונה כדי לקדם טיפול לשיכוך כאבים. מודלים OA חולקו באופן קלאסי מודלים ספונטניים המושרה. מודלים ספונטניים כוללים מודלים טבעיים ומודלים מהונדסים גנטית, שיכולים לדמות בצורה קרובה יותר את מהלך ה- OA הראשוני בבני אדם8. בדרך כלל ניתן לחלק מודלים מושרים לשתי קטגוריות: 1) OA פוסט טראומטי המושרה על ידי ניתוח או טראומה אחרת; או 2) הזרקה תוך-מפרקית של חומרים כונדרוטוקסיים או מעודדי דלקת3. מודלים אלה מניחים בסיס למחקר הפתופיזיולוגי של OA ותורמים רבות לפיתוח תרופות להפחתת הכאב ולהגברת התפקוד.
לאחרונה, הגורם הנפוץ ביותר עבור מודלים OA הוא מונו-יודואצטט (MIA). MIA, מעכב של גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז, יכול לגרום לשינויים במטריצת הסחוס, השפלה, אובדן סחוס, סינוביטיס ושינויים אחרים, הדומים לשינויים הפתולוגיים של דלקת מפרקים ניוונית אנושית9. צוין כי הזרקה תוך-מפרקית של MIA גרמה לכאב מתמשך 28 יום לאחר מתן MIA, מה שמצביע על כך שמודל MIA עשוי להיות שימושי לחקר כאב נוסיצפטיבי כרוני10,11,12. במחקר זה, חולדות ספראג-דאולי זכרים קיבלו זריקות תוך-מפרקיות עם 0.5, 1.5 או 3 מ"ג של MIA במפרקי הברך. חומרת כאבי המפרקים הנגרמים על ידי MIA נמדדה על ידי הערכת רגישות מכנית ותרמית ב 1, 7, 14, 21, 28 ו -35 ימים לאחר הזריקות. על בסיס זה, 1.5 מ"ג של MIA נבחר כריכוז הסופי להערכת דפוסי הליכה ושינויים היסטולוגיים ב 28 ימים לאחר הזריקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים המערבים נושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הנורמות הרפואיות והאתיקה של האוניברסיטה לרפואה סינית בג'ג'יאנג והם בהתאם לחקיקה הסינית בנושא שימוש וטיפול בחיות מעבדה.
1. הזרקה תוך-מפרקית של מונו-יודואצטט בברך
- לאחר שבוע של התאקלמות, מחלקים באופן אקראי ושווה 40 חולדות ספראג-דאולי זכרים במשקל 180-200 גרם (בני 4−5 שבועות) לארבע קבוצות (n = 10 חולדות/קבוצה).
הערה: חולדות בקבוצת הביקורת יוזרקו באופן תוך-מפרקי עם 50 μL של מי מלח, ואילו חולדות בקבוצות הניסוי יטופלו ב-0.5, 1.5 או 3 מ"ג של MIA מומס ב-50 μL של מי מלח, בהתאמה. - ביום ההזרקה, הכינו טרי את התמיסה של MIA במי מלח סטריליים (0.9% NaCl) בריכוז 15, 30 ו-60 מ"ג/מ"ל ותמיסת פנטוברביטל 10% בתמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl).
אזהרה: ל-MIA יש השפעה הרסנית ביותר על הקרום הרירי, דרכי הנשימה העליונות, העין, העור ורקמות אחרות. לכן, מסכה וכפפות מומלץ בעת הכנת פתרון. - הרדמת חולדות על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין ב-60 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-5 מ"ג/ק"ג (שניהם מוכנים במי מלח). מהדקים בעדינות את בהונות החולדה בפינצטה כדי לאשר הרדמה.
- הניחו את החולדה כשגבה פונה כלפי מטה. לגלח את הברך ולנגב את האזור המקיף את מפרק הברך באלכוהול.
- שמרו על הברך בזווית של 90° וחשפו את גיד הפטלר הלבן מתחת לפטלה. לחץ על גיד הפטלר עם קצה האצבע כדי למצוא את הרווח מתחת לפטלה.
- בחר את צומת הפער ואת הגיד הפטלרי הלטרלי כאתר ההזרקה. לאחר מכן, הכנס את מחט 26 G אנכית לתוך האתר על 5 מ"מ. אין להרגיש התנגדות כאשר המחט נמצאת בחלל המפרק.
הערה: חשוב לשמור את המחט בניצב למקום ההזרקה. - להזריק 50 μL של תמיסת מלח או MIA לתוך חלל המפרק. שלפו באיטיות את המחט ועטפו חתיכת גזה סביב אתר ההזרקה כדי למזער רפלוקס ודליפה. לאחר התאוששות הרדמה, להסיר את גזה.
- בדוק התנהגות הקשורה לכאב ב 1, 7, 14, 21, 28 ו 35 ימים לאחר זריקות כמתואר בסעיף 2.
2. הערכות התנהגותיות
- סף משיכה מכני (MWT)
הערה: ה- MWT נמדד על ידי מבחן פון פריי13 והצופה היה עיוור לזריקות שהחיות קיבלו.- מניחים חולדה בכלוב פלסטיק מוגבה (17 ס"מ על 11 ס"מ על 13 ס"מ) עם בסיס רשת תיל תלוי 50 ס"מ מעל שולחן. ודאו שסביבת הבדיקה שקטה ותנו לחולדה 30 דקות להסתגל לסביבה.
- לחצו את מחט פון פריי בניצב על פני השטח הכפיים של כף ידה האחורית של כל חולדה. הגבירו את הלחץ בהדרגה (כ-20 גרם לשנייה) ובאופן ליניארי עד להתרחשות הרמת כפות הרגליים או ליקוק הכפות.
- השתמש בכוח נמוך מהסף הקודם כדי להבטיח שהסף הוא כוח הנסיגה המינימלי. בדקו כל חולדה יותר משלוש פעמים, בהפרש של 3-5 דקות לפחות.
- רשום את הכוח המינימלי המעורר רפלקס משיכת כפות. ממוצע הנתונים כ- MWT של חולדות.
- חביון נסיגה תרמית (TWL)
הערה: ה- TWL נמדד באמצעות מנגנון הבדיקה הכפית (טבלת חומרים) והצופה היה עיוור לזריקות שהחיות קיבלו.- הניחו קופסת פרספקס (60 ס"מ על 20 ס"מ x 14 ס"מ, מחולקת ל-6 תאים) על לוח זכוכית בעובי 3 מ"מ, והכניסו חולדות לקופסה (אחת בכל תא). ודאו שהסביבה שקטה וטמפרטורת החדר קבועה.
- תנו לחולדות 30 דקות להסתגל לסביבת הבדיקה.
- כייל את הגירוי התרמי באמצעות רדיומטר אינפרא אדום. הגדר את עוצמת האינפרא אדום הרצויה על 70 יחידות.
- הניחו את פולט/גלאי האינפרא אדום על המיכל ישירות מתחת למרכז הכפה הנבדקת.
- לחיצה על לחצן START . הטיימר יופעל באופן אוטומטי. הבקר יכבה באופן אוטומטי את אור האינפרא אדום ויפסיק את הטיימר לחלוטין ברגע שמתרחשת תנועת הכפה.
- הקלט את זמן התגובה כאשר המראה של משיכת כפות וליקוק כפות.
הערה: תגובה חיובית לבדיקה נחשבת למשיכת כפות וליקוק כפות. אם מתרחשת רק נסיגת כפות, יש להתייחס אליה כאל תנועה רצונית של החולדה ולא כאל תגובה חיובית. - חזור על הבדיקה יותר משלוש פעמים. ממוצע הנתונים כ- TWL של חולדות.
הערה: כל חשיפה של חום קורן לא תעלה על 20 שניות. גירויי אינפרא אדום על אותה כפה אחורית צריכים להיות במרחק של לפחות 3−5 דקות זה מזה.
- ניתוחי תבניות הליכה
הערה: ניתוחי תבניות ההליכה נמדדו באמצעות מערכת הדמיה (Table of Materials) והצופה היה עיוור לזריקות שהחיות קיבלו.- התאימו את אורך תא ההליכה באמצעות הידיות בשני הקצוות של תא ההליכה לאורך המתאים לחולדות (למשל, 61 ס"מ).
- הכניסו חולדה לתא ההליכה ואימנו חולדות לבצע ריצות רצופות במשך 5 מחזורי צעדים לפחות במהירות של 18 ס"מ לשנייה לפני הניסוי הפורמלי.
הערה: כאשר חולדה ממוקמת לראשונה בתא ההליכה, ניתן להגדיר את המהירות לכ-20 ס"מ לשנייה ולכבות אותה כאשר היא רצה סביב 2 שניות. לאחר מכן הגדר את המהירות ל-18 ס"מ לשנייה. טפחו בעדינות על גב החולדה עם המחיצה, אם החולדה משתהה או נסוגה במהלך הליכה. נסו להפחית את המהירות בהדרגה מ-18 ס"מ לשנייה ל-10 ס"מ לשנייה. אם החולדה בסופו של דבר לא מצליחה לבצע את הבדיקה, מקובל לבחור חולדה אחרת לבדיקה. - הגבירו באיטיות את מהירות ההליכון עד שהוא מגיע למהירות היעד (18 ס"מ לשנייה). צלם לפחות 5 שניות וידאו של תנועה מתמשכת של החולדה באמצעות מצלמת הווידאו הדיגיטלית המהירה המותקנת מתחת לחגורת ההליכון השקופה.
- בדקו כל חולדה במרחק של לפחות 5 דקות זו מזו כדי להשיג לפחות שלוש ריצות רצופות.
- ציירו "תיבה תוחמת" כדי להגדיר את הגבול של תמונת הליכה של בעלי חיים בתוכנת ההדמיה והזינו את מהירות הריצה עבור כל סרטון. בחר סרטונים כקבוצה ועבד סרטונים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה. לאחר עיבוד סרטונים, התוכנה תפיק מספר גיליונות אלקטרוניים לדיווח על מדדי הליכה, כולל עמידה, נדנדה, בלימה, הנעה, קצב, רצף צעדים וכו '.
- חישוב שטח הכפה הכולל (ס"מ2), אורך צעד ממוצע (ס"מ) ואיחוד אורך צעד.
הערה: שטח הכפות הכולל הוא הממוצע של השטח הכולל של ארבע כפות של כל קבוצת חולדות ושטח הכפות מוגדר כשטח הכפות המרבי במגע עם ההליכון במהלך שלב העמידה של מחזור הצעדים. אורך צעד הוא המרחק בין מגעים ראשוניים של אותה כפה בצעד שלם אחד. אורך צעד יחידה = אורך צעד ממוצע (ס"מ)/אורך גוף (ס"מ).
3. ניתוחים היסטופתולוגיים ואימונוהיסטוכימיים
- המתת חולדות על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל במינון של 150 מ"ג/ק"ג (מוכן במי מלח). כריתת מפרקי הברך באופן מיידי לצורך הניתוחים ההיסטולוגיים.
- לתקן את המפרקים ב 10% פורמלין במשך 24 שעות, decalcify עם 10% EDTA במלח מאוגר פוספט (PBS) במשך 8 שבועות, ולאחר מכן להטמיע את המפרקים פרפין.
אזהרה: פורמלין עלול לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה. זה צריך להיות מטופל במכסה המנוע. - חותכים את המפרקים המשובצים בפרפין בעובי 3 מ"מ עם מיקרוטום וצפים באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס המכיל מים מזוקקים.
- העבר חלקים למגלשות זכוכית. יש לייבש את המגלשות למשך הלילה ולאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר (RT) להמשך הכתמים הבאים.
- מניחים את המגלשות בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לנטרל את השקופיות.
- טבל את השקופיות ברצף בקסילן, קסילן, 100% אתנול, 100% אתנול, 95% אתנול, 80% אתנול ו-75% אתנול למשך 5 דקות, בהתאמה, ב-RT.
- מקטעי כתמים עם המטוקסילין ואאוזין (H&E), ספרנין-O (SO) והמטוקסילין כחול אלקסיאני (ABH) וכן נוגדנים נגד קולגן מסוג II של חולדות (Col2), קולגן מסוג X (Col10) ומטריצה מטאלופרוטאינאז 13 (MMP13), כמתואר בשלבים 3.8−3.12.
- צביעת H&E
- יש לשטוף את המגלשות עם H2O שעבר דה-יוניזציה למשך 3 דקות. כתם מחליק עם המטוקסילין במשך 3−5 דקות.
- יש לשטוף את החלקות עםH2O 3x, דקה אחת כל אחת, עד שלא נשאר המטוקסילין על המשטח.
- כתם מחליק עם eosin במשך 30 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x שעבר דה-יוניזציה, דקה אחת כל אחת, עד שלא יישאר אוזין על פני השטח.
- לטבול מגלשות באמוניה של 0.1% למשך 10−20 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- יש לטבול ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול, קסילן, קסילן וקסילן למשך דקה אחת, בהתאמה.
- עטיפת השקופיות בשרף נייטרלי.
- כל כך מכתים
- יש לשטוף את המגלשות עם H2O שעבר דה-יוניזציה למשך 3 דקות. כתם מחליק עם המטוקסילין במשך 3−5 דקות.
- להבדיל במהירות 1% אלכוהול חומצה (כ 3 שניות). לאחר מכן, יש לשטוף עםH2O 3x שעבר דה-יוניזציה, דקה אחת כל אחד, עד שלא יישאר המטוקסילין על פני השטח.
- מחליק כתמים עם פתרון ירוק מהיר (FCF) למשך 5 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- כתם מחליק עם SO במשך 1−2 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- יש לשטוף עם 1% חומצה אצטית למשך 1-2 דקות כדי להסיר את שאריות ה-FCF. יש לשטוף את המגלשות עם H2O שעבר דה-יוניזציה למשך דקה אחת.
- יש לטבול ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול, קסילן, קסילן וקסילן למשך דקה אחת, בהתאמה.
- עטיפת השקופיות בשרף נייטרלי.
- מכתים ABH
- יש לשטוף את המגלשות עם H2O שעבר דה-יוניזציה למשך 3 דקות. יש לטבול ב-1% אלכוהול חומצי למשך 30 שניות ולנקז לזמן קצר על מגבת נייר (אין לשטוף).
- לטבול מגלשות ב- ABH למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x שעבר דה-יוניזציה, דקה אחת כל אחת, עד שלא יישאר ABH על פני השטח.
- להבדיל במהירות 1% אלכוהול חומצה (כ 3 שניות). יש לשטוף את המגלשות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- יש לטבול במי אמוניום ב-0.5% למשך 15 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- לטבול ב-95% אתנול למשך דקה אחת. היסחפו לתוך תמיסת eosin/orange G למשך דקה וחצי.
- יש לטבול ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול, קסילן, קסילן וקסילן למשך דקה אחת, בהתאמה.
- עטיפת השקופיות בשרף נייטרלי.
- בחנו את כל השקופיות תחת מיקרוסקופ וקיבלו ציון סטטיסטי בסולם של 0-13 על ידי תצפית כפולת סמיות, על פי שיטת הניקוד של מנקין14.
- אימונוהיסטוכימיה
- יש לשטוף את המגלשות עם H2O שעבר דה-יוניזציה למשך 3 דקות.
- יש לטבול את השקופיות ב-0.1 M נתרן ציטראט ולהניח את השקופיות בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאחזר את האנטיגן.
- היסחפו לתוך 0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם PBS 2x, 3 דקות כל אחת.
- הדגירה של מקטעים בתמיסתH 2 O2 3% במתנול ב-RT למשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. יש לשטוף את השקופיות עם PBS 2x, 3 דקות כל אחת.
- הדגירה של חלקים עם סרום עזים של 5% ב-PBS למשך 30 דקות ב-RT כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית. יש לשטוף את השקופיות עם PBS 2x, 3 דקות כל אחת.
- יש לדגום מקטעי לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם 100 μL של נוגדנים ראשוניים מדולל PBS (1:1,000) נגד קולגן מסוג II של חולדות (Col2), קולגן מסוג X (Col10) ומטריצה מטאלופרוטאינאז 13 (MMP13). יש לשטוף את השקופיות עם PBS 2x, 3 דקות כל אחת.
- מקטעי דגירה עם 100 μL של נוגדן משני מדולל PBS (1:1,000) (עז נגד עכבר משני או עז נגד עכבר משני) במשך 20 דקות ב- RT. יש לשטוף את השקופיות עם PBS 2x, 3 דקות כל אחת.
- מקטעי דגירה עם 100 μL של 3,3′-diaminobenzidine (DAB) פתרון עבודה. עקוב אחר התגובה כאשר התגובה הכרומוגנית הופכת את אתרי האפיטופ לחום.
אזהרה: DAB הוא חומר מסרטן. תמיד ללבוש כפפות ולעבוד עם מכסה המנוע בעת עבודה עם DAB.
הערה: זמן התפתחות הצבע עשוי להשתנות בין מספר שניות ל-10 דקות. - ברגע שמתפתח צבע חום על החלקים, יש לשטוף את השקופיות עםH2O 2x שעבר דה-יוניזציה, 3 דקות כל אחת.
- יש לטבול את השקופיות בהמטוקסילין למשך 1-2 דקות כדי לנטרל שקופיות. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות עם H2O 3x, דקה אחת כל אחת.
- יש לטבול ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול, קסילן, קסילן וקסילן למשך דקה אחת, בהתאמה.
- עטיפת השקופיות בשרף נייטרלי.
- שימו לב לצבע הנוגדנים המכתימים בקטעים תחת מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעזרת מתודולוגיה זו, הקמנו מודל כאב OA בחולדה וזיהינו את השינויים שנוצרו. MWT ו- TWL שיקפו אלודיניה מכנית והיפראלגיה תרמית, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיור 1, MIA גרם לאלודיניה מכנית ולהיפראלגזיה תרמית באופן תלוי מינון. למרבה הפלא, הירידה של MWT הגיעה לשיא מ 21 ימים ל 28 ימים, ולאחר מכן התאושש, מה שמרמז כי תיקון משותף עשוי להתרחש בשלב זה, אבל MWT של 3 מ"ג MIA הקבוצה עדיין היה ברמה נמוכה. השינוי של TWL היה תואם פחות או יותר ל-MWT (איור 2).
על בסיס זה, בחרנו 1.5 מ"ג של MIA כמנה הסופית והערכנו דפוסי הליכה ושינויים היסטולוגיים ב-28 יום לאחר ההזרקה. פרמטרים של הליכה (שטח כף כולל ואורך צעד יחידה) שיקפו התנהגויות הקשורות לכאב. רמות הפרמטרים של ההליכה, כולל שטח הכפות הכולל (איור 3A) ואורך הצעד של היחידה (איור 3B) הופחתו באופן משמעותי בקבוצת MIA לאחר 28 יום, מה שמרמז על כך ש-MIA גרם לכאבי מפרקים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית בחולדות. עם העלייה בניקוד של מנקין על השקופיות ההיסטופתולוגיות, ניוון הסחוס, הפרעה בקולגן וחוסר ארגון של מטריצה נצפו כמובן בקבוצת MIA (איור 4). כפי שניתן לראות באיור 5, 1.5 מ"ג של MIA גרמו לעלייה משמעותית בוויסות של MMP13, ו-Col10, וירידה משמעותית בוויסות של Col2.
איור 1: התפתחות MTW לאחר הזרקת MIA. ספי הנסיגה המכנית של כפות אחוריות הוערכו לאחר הזרקת MIA (0.5, 1.5 או 3 מ"ג/חולדה) ומלח (0.9% NaCl), n = 10 חולדות / קבוצה. הערכים מוצגים כממוצע ± SD. **P < 0.01 לעומת קבוצה שטופלה במי מלח; ANOVA חד-כיוונית ואחריה ההשוואה הפחות משמעותית של פישר (LSD). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: התפתחות של TWL לאחר הזרקת MIA. חביון הנסיגה התרמית של כפות הרגליים האחוריות הוערך לאחר הזרקת MIA (0.5, 1.5 או 3 מ"ג/חולדה) ומלח (0.9% NaCl), n = 10 חולדות / קבוצה. הערכים מוצגים כממוצע ± SD. **P < 0.01 לעומת קבוצה שטופלה במי מלח (NC); ANOVA חד-כיוונית ואחריה השוואת האל-אס-די של פישר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח הליכה 28 יום לאחר הזרקת MIA. (A) שטח כפה כולל (ס"מ2). שטח כפות כולל: הממוצע של שטח כולל של ארבע כפות של כל קבוצת חולדות. (B) אורך צעדי היחידה. אורך צעד יחידה = אורך צעד ממוצע (ס"מ)/אורך גוף (ס"מ). n = 10 חולדות/קבוצה. הערכים מוצגים כממוצע ± SD. # #P < 0.01 לעומת קבוצה שטופלה במי מלח (NC) ביום 28. נתון זה שונה מ- Yan et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תצפית היסטופתולוגית (הכתמת HE, SO ו-AHB) וניקוד מנקין של מפרקי הברך של החולדות ביום ה-28 לאחר טיפול ב-MIA. n = 10 חולדות/קבוצה. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. הערכים מוצגים כממוצע ± SD. ##P < 0.01 לעומת קבוצה שטופלה במי מלח (NC). ANOVA חד-כיוונית ואחריה השוואת האל-אס-די של פישר. נתון זה שונה מ- Yan et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תצפית אימונוהיסטוכימית על הביטויים של MMP13, Col2 ו-Col10 בסחוס חולדות ביום ה-28. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. N = 10 חולדות/קבוצה. נתון זה שונה מ- Yan et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל החולדות של OA המושרה על ידי MIA הוא מודל מבוסס היטב, בשימוש נרחב. הזרקה תוך-מפרקית של MIA גורמת בתחילה לדלקת חמורה וחריפה, מה שמוליד את השלב הארוך והניווני של OA17,18. במחקר זה מדדנו את הרגישות הנוסיספטיבית של MWT ו-TWL, והערכנו שינויים בהליכה באמצעות מערכת הדמיה. דו"חות קודמים מצאו כי הזרקת MIA עלולה להעלות את הרגישות של סיבי מפרק הברך האפרנטיים המובילה לתפיסה נוסית, המתבטאת בהיפראלגיה תרמית ובהפחתת הסף המכני19,20. הוכח כי שינויים בהליכה היו קשורים לתפיסה משופרת, מה שמרמז על כך שניתן להשתמש בדפוסי הליכה כדי להעריך מודלים של כאב21. בהתאם לכך, מודלים המושרים על ידי MIA משמשים בעיקר להערכת כאבים הקשורים ל-OA ולסינון תרופות דרך הפה, כמו גם תרופות להזרקת מפרקים 3,6.
אמנם בהשוואה למודל OA המושרה בניתוח, אך פשוט ומהיר יותר להזריק MIA לחלל המפרק, עדיין יש נקודות קריטיות במידול. קודם כל, חלל המפרק של חולדות הוא זעיר, ואת המיקום שלה צריך להיות מאושר לפני ההזרקה. שנית, MIA הוא רעיל, ולכן יש לבחור בקפידה את המינון של MIA. דווח כי MIA יכול לגרום לפגיעה בסחוס המפרקי באופן תלוי-מינון וזמן (המוערך על ידי הציון ההיסטולוגי של OARSI וציון מנקין), מה שמצביע על כך שניתן לווסת את ההתקדמות והחומרה של נגעים מפרקיים על ידי ויסות הריכוז שלMIA 22,23. נמצא כי MIA גורם לכאב ולסמני עקה חמצונית במינונים גבוהים10,18,24. דיווחים קודמים הציעו כי מינון של 1.5 מ"ג של זריקת MIA בחולדות יצר תהליך דלקתי הדומה לברך האנושיתOA 18,25. חוץ מזה, חשוב להשתמש באותו נסיינית לאורך כל המבחן ההתנהגותי ולהכיר את החולדות עם הסביבה מראש, כדי להפחית את החרדה ולהימנע מלהשפיע על תוצאות הניסוי.
כאמור, מודלים של בעלי חיים OA מחולקים בדרך כלל למודלים ספונטניים ומושרה. הזרקה תוך מפרקית של MIA נמצאת בשימוש נרחב בשל מספר יתרונות: 1) פעולה פשוטה; 2) קלות האינדוקציה והשכפול; 3) מינון וחומרה הניתנים לשליטה; 4) זמן דוגמנות קצר; ו-5) התאמה לבעלי חיים קטנים כמו גם לבעלי חיים גדולים. עם זאת, כמו מודלים אחרים של בעלי חיים, גם למודלים של OA המושרה על-ידי MIA יש מספר חסרונות. מוות תאי נרחב והרס מפרקים מהיר לאחר הזרקת MIA אינם עולים בקנה אחד עם OA ספונטני או פוסט טראומטי בבני אדם26. יתר על כן, MIA שיורי בחלל המפרקי עשוי להשפיע על ההשפעות של טיפולים תוך מפרקיים הבאים, וכתוצאה מכך תוצאה לא ברורה על ידי שימוש במודל MIA. האם לשטוף את חלל המפרק לפני הזרקה טיפולית במודל זה נותרה שאלה ללא מענה. בסך הכל אין מודל אחד של בעלי חיים שמשחזר בצורה מושלמת את כל ההיבטים של OA אנושי, אך המגוון הרחב של הדגמים הזמינים מאפשר ליישם מודלים מרובים על השאלות הרלוונטיות ביותר באופן סינתטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הקרן המחוזית למדעי הטבע של ג'ה-ג'יאנג של סין (מענק מספר: LY17H270016), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס': 81774331, 81873049 ו-81673997), ופרויקט המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ג'יאנג לרפואה סינית מסורתית של סין (מענק מס': 2013ZQ007 ו-2016ZZ011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam(UK) | 34712 | Primary antibody for immunohistochemistry (IHC) |
| Anti-Collagen X (Col10) antibody | Abcam(UK) | 49945 | Primary antibody for IHC |
| DigiGait Imaging System | Mouse Specifics (Boston, MA, USA) | Equipment for gait patterns analyses | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| MIA | Sigma-Aldrich | I4386-10G | powder |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks. |
| Plantar Test apparatus | UgoBasile (Italy) | 37370 | Equipment for TWL assay |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China) | RR037A | Extracte total RNA from cultured cells |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections. |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor |
References
- Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).
- Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).
- Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. C. Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis. AAPS Journal. 15 (2), 438-446 (2013).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Bijlsma, J. W., Berenbaum, F., Lafeber, F. P. Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet. 377 (9783), 2115-2126 (2011).
- McCoy, A. M. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
- O'Neill, T. W., Felson, D. T.
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
- Takahashi, I., Matsuzaki, T., Hoso, M. Long-term histopathological developments in knee-joint components in a rat model of osteoarthritis induced by monosodium iodoacetate. Journal of Physical Therapy Science. 29 (4), 590-597 (2017).
- Liu, P., et al.
- Combe, R., Bramwell, S., Field, M. J. The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats. Neuroscience Letters. 370 (2-3), 236-240 (2004).
- Pomonis, J. D., et al. Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain. Pain. 114 (3), 339-346 (2005).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. 53 (3), 523-537 (1971).
- Yan, L., et al. Chondroprotective effects of platelet lysate towards monoiodoacetate-induced arthritis by suppression of TNF-α-induced activation of NF-ĸB pathway in chondrocytes. Aging. 11 (9), 2797-2811 (2019).
- Yan, B., et al. Intra-Articular Injection of Extract Attenuates Pain Behavior and Cartilage Degeneration in Mono-Iodoacetate Induced Osteoarthritic Rats. Frontiers in Pharmacology. 9, 1360 (2018).
- Wang, C., et al. Agkistrodon ameliorates pain response and prevents cartilage degradation in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritic rats by inhibiting chondrocyte hypertrophy and apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 231, 545-554 (2019).
- Yamada, E. F., et al. Evaluation of monosodium iodoacetate dosage to induce knee osteoarthritis: Relation with oxidative stress and pain. International Journal of Rheumatic Diseases. 22 (3), 399-410 (2019).
- Schuelert, N., McDougall, J. J. Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).
- Lee, S. E. Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model. Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).
- Piesla, M. J., et al. Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models. Brain Research. 1295, 89-98 (2009).
- Udo, M., et al. Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).
- Guingamp, C., et al. Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry. Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).
- Jeong, J. H., et al. Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes. PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).
- Cook, J. L., et al.
- Little, C. B., Zaki, S. What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).
