Summary
Это исследование описывает метод внутрисуставной инъекции моно-йодоацетата у крыс и обсуждает результирующее болевое поведение и гистопатологические изменения, которые предоставляют ссылки для будущих применений.
Abstract
Современные животные модели остеоартрита (ОА) можно разделить на спонтанные модели и индуцированные модели, обе из которых направлены на моделирование патофизиологических изменений ОА человека. Однако, как основной симптом на поздней стадии ОА, боль влияет на повседневную жизнь пациентов, и существует не так много доступных моделей. Монойодоацетатная (MIA)-индуцированная модель является наиболее широко используемой моделью боли ОА, в основном используемой у грызунов. MIA является ингибитором глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которая вызывает гибель хондроцитов, дегенерацию хряща, остеофит и измеримые изменения в поведении животных. Кроме того, изменения экспрессии матриксной металлопротеиназы (MMP) и провоспалительных цитокинов (IL1 β и TNF α) могут быть обнаружены в модели, индуцированной MIA. Эти изменения согласуются с патофизиологическими условиями ОА у людей, что указывает на то, что МИА может вызывать измеримую и успешную модель боли ОА. Это исследование направлено на описание методологии внутрисуставной инъекции МИА у крыс и обсуждение результирующего поведения, связанного с болью, и гистопатологических изменений.
Introduction
Остеоартрит (ОА) является наиболее распространенным заболеванием суставов в мире, затрагивающим, по оценкам, 10-12% населения у взрослых1. Наиболее часто вовлеченным суставом является колено, и ОА имеет более высокую заболеваемость у пожилых людей, особенно у женщин2. Как хроническое заболевание, ОА развивается постепенно в течение десятилетий в суставную недостаточность с такими симптомами, как потеря хряща, синовиальное воспаление, остеофитоз, снижение функции и хроническая боль3. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ОА является четвертым наиболее распространенным заболеванием у женщин и восьмым наиболее распространенным заболеванием у мужчин. К 2020 году ОА может стать четвертым наиболее инвалидизирующим заболеванием у людей4. Однако доступные в настоящее время методы лечения ОА направлены только на симптомы и продлевают время до операции по замене сустава5.
Спонтанная ОА у пациентов на людях часто занимает много времени для возникновения клинических симптомов, таких как боль в суставах6. На ранних стадиях ОА боль обычно прерывистая и становится более частой и тяжелой по мере прогрессирования заболевания, что делает ее преобладающей жалобой пациентов7. Поэтому за последние полвека были разработаны обширные животные модели боли при ОА для продвижения обезболивающей терапии. Модели ОА классически делятся на спонтанные и индуцированные модели. Спонтанные модели включают естественные модели и генетически модифицированные модели, которые могут более точно имитировать течение первичного ОА у людей8. Индуцированные модели обычно можно разделить на две категории: 1) посттравматическая ОА, вызванная хирургическим вмешательством или другой травмой; или 2) внутрисуставное введение хондротоксических или провоспалительных веществ3. Эти модели закладывают основу для патофизиологического изучения ОА и вносят большой вклад в разработку препаратов для уменьшения боли и повышения функции.
В последнее время наиболее широко используемым индуктором для моделирования ОА является моно-йодоацетат (MIA). МИА, ингибитор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, может вызывать изменения хрящевого матрикса, деградацию, потерю хряща, синовит и другие изменения, которые сходны с патологическими изменениями остеоартроза человека9. Было отмечено, что внутрисуставная инъекция МИА вызывала постоянную боль через 28 дней после введения МВД, что указывает на то, что модель МИА может быть полезна для исследования хронической ноцицептивной боли 10,11,12. В этом исследовании самцы крыс Sprague-Dawley получали внутрисуставные инъекции с 0,5, 1,5 или 3 мг MIA в коленных суставах. Тяжесть боли в суставах, вызванной МИА, измеряли путем оценки механической и тепловой чувствительности через 1, 7, 14, 21, 28 и 35 дней после инъекций. На этой основе в качестве конечной концентрации было выбрано 1,5 мг МИА для оценки паттернов походки и гистологических изменений через 28 дней после инъекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по медицинским нормам и этике Чжэцзянского китайского медицинского университета и соответствуют законодательству Китая об использовании и уходе за лабораторными животными.
1. Внутрисуставная инъекция моно-йодоацетата в колено
- После одной недели акклиматизации случайным образом и поровну разделите 40 самцов крыс Sprague-Dawley весом 180−200 г (4−5 недель) на четыре группы (n = 10 крыс на группу).
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысам в контрольной группе будут внутрисуставно введено 50 мкл физиологического раствора, в то время как крысам в экспериментальных группах будут лечить 0,5, 1,5 или 3 мг МИА, растворенного в 50 мкл физиологического раствора, соответственно. - В день инъекции только что приготовить раствор МИА в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) в концентрации 15, 30 и 60 мг/мл и 10% растворе пентобарбитала в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl).
ВНИМАНИЕ: МИА оказывает крайне разрушительное воздействие на слизистую оболочку, верхние дыхательные пути, глаз и кожу и другие ткани. Поэтому маска и перчатки рекомендуются при приготовлении раствора. - Анестезируют крыс внутрибрюшинной инъекцией кетамина в дозе 60 мг/кг и ксилазина в 5 мг/кг (оба препарата в физиологическом растворе). Осторожно зажмите пальцы крысы пинцетом, чтобы подтвердить анестезию.
- Положите крысу спиной вниз. Побрить колено и протереть спиртом область, окружающую коленный сустав.
- Держите колено под углом 90° и раскройте белое сухожилие надколенника ниже надколенника. Нажмите кончиком пальца на сухожилие надколенника, чтобы найти щель под надколенником.
- В качестве места инъекции выберите место соединения промежутка и бокового сухожилия надколенника. Затем вставьте иглу 26 Г вертикально в участок около 5 мм. Не следует ощущать сопротивления, когда игла находится в суставном пространстве.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать иглу перпендикулярной месту инъекции. - Вводят 50 мкл физиологического раствора или раствора МИА в полость сустава. Медленно вытащите иглу и оберните кусок марли вокруг места инъекции, чтобы свести к минимуму рефлюкс и утечку. После восстановления после анестезии удалите марлю.
- Проверьте поведение, связанное с болью, через 1, 7, 14, 21, 28 и 35 дней после инъекций, как описано в разделе 2.
2. Поведенческие оценки
- Механический порог вывода (MWT)
ПРИМЕЧАНИЕ: MWT был измерен тестом фон Фрея13 , и наблюдатель был ослеплен инъекциями, которые получили животные.- Поместите крысу в приподнятую пластиковую клетку (17 см х 11 см х 13 см) с основанием из проволочной сетки, подвешенной на 50 см над столом. Убедитесь, что тестовая среда тихая и дайте крысе 30 минут, чтобы адаптироваться к окружающей среде.
- Нажмите иглу фон Фрея перпендикулярно на подошвенную поверхность задней лапы каждой крысы. Увеличивайте давление постепенно (примерно 20 г/с) и линейно до тех пор, пока не произойдет подъем лапы или облизывание лапы.
- Используйте силу, меньшую, чем предыдущее пороговое значение, чтобы убедиться, что порог является минимальным усилием вывода. Протестируйте каждую крысу более трех раз, с интервалом не менее 3−5 минут.
- Запишите минимальную силу, вызывающую рефлекс отвода лапы. Усредните данные как MWT крыс.
- Задержка теплового вывода (TWL)
ПРИМЕЧАНИЕ: TWL измеряли с помощью подошвенного испытательного аппарата (Таблица материалов), и наблюдатель был ослеплен к инъекциям, которые получили животные.- Поместите коробку из плексигласа (60 см х 20 см х 14 см, разделенную на 6 отсеков) на стеклянную пластину толщиной 3 мм и поместите крыс в коробку (по одной в каждом отсеке). Убедитесь, что окружающая среда тихая, а температура в помещении постоянная.
- Дайте крысам 30 минут, чтобы адаптироваться к тестовой среде.
- Откалибруйте тепловой стимул с помощью инфракрасного радиометра. Установите желаемую интенсивность инфракрасного излучения на уровне 70 единиц.
- Поместите инфракрасный излучатель/детектор на контейнер непосредственно под центром тестируемой лапы.
- Нажатие кнопки START . Таймер запустится автоматически. Контроллер автоматически выключит инфракрасный свет и полностью остановит таймер, как только произойдет движение лапы.
- Запишите время реакции при появлении выведения лапы и облизывания лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный ответ на тест расценивается как изъятие лапы и облизывание лапы. Если происходит только изъятие лапы, это следует рассматривать как добровольное движение крысы, а не положительную реакцию. - Повторите тест более трех раз. Усредните данные как TWL крыс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое воздействие лучистого тепла не должно превышать 20 с. Инфракрасные стимуляции на одной и той же задней лапе должны быть не менее чем на расстоянии 3−5 мин друг от друга.
- Анализ паттернов походки
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ рисунка походки был измерен с использованием системы визуализации (Таблица материалов), и наблюдатель был ослеплен инъекциями, которые получили животные.- Отрегулируйте длину отсека для ходьбы с помощью ручек на обоих концах отсека для ходьбы до подходящей длины для крыс (например, 61 см).
- Поместите крысу в отсек для ходьбы и обучите крыс совершать непрерывные пробежки в течение не менее 5 циклов со скоростью 18 см / с до официального эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда крыса впервые помещается в отсек для ходьбы, скорость может быть установлена примерно на 20 см / с и отключена при беге около 2 с. Затем установите скорость 18 см/с. Осторожно постучите по спине крысы перегородкой, если крыса делает паузу или отступает во время ходьбы. Старайтесь постепенно снижать скорость с 18 см/с до 10 см/с. Если крыса в конечном итоге не сможет выполнить тест, допустимо выбрать другую крысу для теста. - Медленно увеличивайте скорость беговой дорожки, пока она не достигнет целевой скорости (18 см/с). Снимайте не менее 5 с видео непрерывного движения крысы с помощью высокоскоростной цифровой видеокамеры, установленной под прозрачным поясом беговой дорожки.
- Протестируйте каждую крысу с интервалом не менее 5 минут, чтобы получить по крайней мере три непрерывных пробега.
- Нарисуйте «ограничительную рамку», чтобы определить границу изображения ходячего животного в программном обеспечении для визуализации, и введите скорость бега для каждого видео. Выберите видео как группу и автоматически обрабатывайте видео с помощью программного обеспечения. После обработки видео программное обеспечение выведет несколько электронных таблиц для отчета об индексах походки, включая стойку, поворот, торможение, движение, частоту педалирования, последовательность шагов и т. Д.
- Рассчитайте общую площадь лап (см2), среднюю длину шага (см) и объедините длину шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая площадь лап - это среднее значение общей площади четырех лап каждой группы крыс, а площадь лап определяется как максимальная площадь лапы, контактирующая с беговой дорожкой во время фазы стойки цикла шага. Длина шага - это расстояние между начальными контактами одной и той же лапы в одном полном шаге. Единичная длина шага = средняя длина шага (см)/длина тела (см).
3. Гистопатологические и иммуногистохимические анализы
- Усыпляют крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия по 150 мг/кг (готовят в физиологическом растворе). Немедленно резецируйте коленные суставы для гистологических анализов.
- Зафиксируйте суставы в 10% формалине в течение 24 ч, декальцинируйте 10% ЭДТА в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 8 недель, а затем встраивайте суставы в парафин.
ВНИМАНИЕ: Формалин может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. С ним следует обращаться в капюшоне. - Секционируйте парафиновые встроенные соединения толщиной 3 мм с микротомом и плавайте на водяной бане 40 °C, содержащей дистиллированную воду.
- Перенесите секции на стеклянные горки. Сушите горки в течение ночи и храните слайды при комнатной температуре (RT), чтобы продолжить последующее окрашивание.
- Поместите слайды в духовку с температурой 60 °C на 4 ч для депарафинизации.
- Погружайте слайды последовательно в ксилол, ксилол, 100% этанол, 100% этанол, 95% этанол, 80% этанол и 75% этанол в течение 5 мин, соответственно, на РТ.
- Окрашивание участков гематоксилином и эозином (H&E), сафранином-О (SO) и альциановым синим гематоксилином (ABH), а также антителами против коллагена типа II крыс (Col2), коллагена типа X (Col10) и матриксной металлопротеиназы 13 (MMP13), как описано на этапах 3.8−3.12.
- Окрашивание H&E
- Промойте горки деионизированнымH2Oв течение 3 мин. Окрашивание гематоксилином в течение 3−5 мин.
- Промойте горки деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый, пока на поверхности не останется гематоксилина.
- Окрашивание горок эозином на 30 с. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый, пока на поверхности не останется эозина.
- Погружайте слайды в 0,1% аммиака на 10−20 с. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый.
- Погружайте слайды последовательно в 95% этанол, 100% этанол, ксилол, ксилол и ксилол в течение 1 мин соответственно.
- Закрывайте слайды нейтральной смолой.
- ОКРАШИВАНИЕ SO
- Промойте горки деионизированнымH2Oв течение 3 мин. Окрашивание гематоксилином в течение 3−5 мин.
- Дифференцируют быстро в 1% кислом спирте (около 3 с). Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый, пока на поверхности не останется гематоксилина.
- Окрашивание горок раствором Fast Green (FCF) в течение 5 мин. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый.
- Окрашивание слайдов с SO в течение 1−2 мин. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый.
- Промойте слайды 1% уксусной кислотой в течение 1−2 мин, чтобы удалить остаточный FCF. Промойте горки деионизированным H2O в течение 1 мин.
- Погружайте слайды последовательно в 95% этанол, 100% этанол, ксилол, ксилол и ксилол в течение 1 мин соответственно.
- Закрывайте слайды нейтральной смолой.
- Окрашивание ABH
- Промойте горки деионизированнымH2Oв течение 3 мин. Погружайте слайды в 1% кислый спирт на 30 с и ненадолго сливайте на бумажном полотенце (не смывайте).
- Погружайте слайды в ABH на 1 ч. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый, пока на поверхности не останется ABH.
- Дифференцируют быстро в 1% кислом спирте (около 3 с). Промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждая.
- Погружайте горки в 0,5% аммонийной воды на 15 с. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый.
- Погружайте слайды в 95% этанол на 1 мин. Погружайте слайды в раствор эозина/апельсина G на 1,5 мин.
- Погружайте слайды последовательно в 95% этанол, 100% этанол, ксилол, ксилол и ксилол в течение 1 мин соответственно.
- Закрывайте слайды нейтральной смолой.
- Изучите все слайды под микроскопом и статистически оцените по шкале 0−13 путем двойного слепого наблюдения, согласно системе оценки Манкина14.
- Иммуногистохимия
- Промойте горки деионизированнымH2Oв течение 3 мин.
- Погрузите слайды в цитрат натрия 0,1 М и поместите слайды в духовку с температурой 60 °C на 4 ч, чтобы извлечь антиген.
- Погружайте слайды в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут. Затем промойте слайды PBS 2x, по 3 мин каждый.
- Инкубировать срезы в 3% раствореН2О2в метаноле на РТ в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазной активности. Промойте слайды с помощью PBS 2x, 3 мин каждый.
- Инкубировать секции с 5% козьей сывороткой в PBS в течение 30 мин при RT, чтобы блокировать любое неспецифическое связывание. Промойте слайды с помощью PBS 2x, 3 мин каждый.
- Инкубировать участки в течение ночи при 4 °C со 100 мкл разбавленных PBS (1:1000) первичных антител против коллагена типа II крыс (Col2), коллагена типа X (Col10) и матриксной металлопротеиназы 13 (MMP13). Промойте слайды с помощью PBS 2x, 3 мин каждый.
- Инкубировать участки со 100 мкл разбавленного PBS (1:1000) вторичного антитела (козьего антимышего вторичного или козьего антимышечного вторичного) в течение 20 мин на RT. Промыть слайды PBS 2x, 3 мин каждый.
- Инкубировать секции со 100 мкл рабочего раствора 3,3'-диаминобензидина (DAB). Следите за реакцией, так как хромогенная реакция превращает участки эпитопа в коричневый цвет.
ВНИМАНИЕ: DAB является канцерогеном. Всегда надевайте перчатки и работайте в капюшоне при работе с DAB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время развития цвета может варьироваться от нескольких секунд до 10 минут. - Как только на участках появится коричневый цвет, промойте слайды деионизированным H2O2x, по 3 мин каждая.
- Погружайте слайды в гематоксилин на 1−2 мин, чтобы противодействовать горкам. Затем промойте слайды деионизированным H2O 3x, по 1 мин каждый.
- Погружайте слайды последовательно в 95% этанол, 100% этанол, ксилол, ксилол и ксилол в течение 1 мин соответственно.
- Закрывайте слайды нейтральной смолой.
- Наблюдайте за цветом окрашивания антител в срезах под микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью этой методологии мы установили модель боли ОА у крысы и обнаружили результирующие изменения. MWT и TWL отражали механическую аллодинию и термическую гипералгезию соответственно. Как показано на рисунке 1, МИА индуцировала механическую аллодинию и термическую гипералгезию, присутствующие в зависимости от дозы. Примечательно, что снижение MWT достигло пика с 21 дня до 28 дней, а затем восстановилось, предполагая, что на этом этапе может произойти восстановление суставов, но MWT группы 3 мг MIA все еще находился на низком уровне. Изменение TWL примерно соответствовало MWT (рисунок 2).
Исходя из этого, мы выбрали 1,5 мг МИА в качестве конечной дозы и оценили характер походки и гистологические изменения через 28 дней после инъекции. Параметры походки (общая площадь лапы и длина шага единицы) отражали поведение, связанное с болью. Уровни параметров походки, включая общую площадь лап (рисунок 3A) и единичную длину шага (рисунок 3B), были значительно снижены в группе MIA через 28 дней, предполагая, что МВД индуцировало боль в суставах, связанную с остеоартритом, у крыс. С увеличением оценки Манкина на гистопатологических слайдах, дегенерация хряща, нарушение коллагена и дезорганизация матрицы были явно замечены в группе MIA (рисунок 4). Как показано на рисунке 5, 1,5 мг МВД вызвали значительное повышение регуляции MMP13 и Col10 и значительное снижение регуляции Col2.
Рисунок 1: Разработка МТЗ после инъекции МВД. Пороги механического изъятия задних лап оценивали после инъекции МИА (0,5, 1,5 или 3 мг/крыса) и физиологического раствора (0,9% NaCl), n = 10 крыс на группу. Значения представлены в виде средней ± SD. **P < 0,01 по сравнению с группой, обработанной физиологическим раствором; Односторонняя ANOVA, за которой следует сравнение Фишера с наименее значимой разницей (ЛСД). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Развитие TWL после инъекции MIA. Задержку термического вывода задних лап оценивали после инъекции МИА (0,5, 1,5 или 3 мг/крыса) и физиологического раствора (0,9% NaCl), n = 10 крыс/группа. Значения представлены как среднее ± SD. **P < 0,01 по сравнению с группой, обработанной физиологическим раствором (NC); Односторонняя ANOVA, за которой последовало сравнение ЛСД Фишера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ походки через 28 дней после инъекции МИА. (A) Общая площадь лап (см2). Общая площадь лап: среднее значение общей площади четырех лап каждой группы крыс. (B) Единичная длина шага. Единичная длина шага = средняя длина шага (см)/длина тела (см). n = 10 крыс на группу. Значения представлены как среднее ± SD. ##P < 0,01 по сравнению с группой, обработанной физиологическим раствором (NC) на 28-й день. Эта цифра была изменена по сравнению с Yan et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистопатологическое наблюдение (окрашивание HE, SO и AHB) и оценка Манкина коленных суставов крыс на 28-й день после лечения МИА. n = 10 крыс на группу. Шкала шкалы = 40 мкм. Значения представлены как среднее ± SD. ##P < 0,01 по сравнению с группой, обработанной физиологическим раствором (NC). Односторонняя ANOVA, за которой последовало сравнение ЛСД Фишера. Эта цифра была изменена по сравнению с Yan et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммуногистохимическое наблюдение за экспрессиями MMP13, Col2 и Col10 в хряще крыс на 28-й день. Шкала бар = 50 мкм. N = 10 крыс на группу. Эта цифра была изменена по сравнению с Yan et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крысиная модель ОА, индуцированная МВД, является устоявшейся, широко используемой моделью. Внутрисуставное введение МИА первоначально вызывает тяжелое и острое воспаление, которое приводит к более длительной и дегенеративной фазе ОА17,18. В этом исследовании мы измерили ноцицептивную чувствительность MWT и TWL и оценили изменения походки с помощью системы визуализации. Предыдущие отчеты показали, что инъекция МИА может повысить чувствительность афферентных волокон коленного сустава, что приводит к ноцицепции, что отражается термической гипералгезией и снижением механического порога19,20. Было доказано, что изменения походки были связаны с усиленной ноцицепцией, предполагая, что паттерны походки могут быть использованы для оценки моделейболи 21. Соответственно, модели, индуцированные МИА, в основном используются для оценки боли, связанной с ОА, и скрининга пероральных препаратов, а также препаратов для инъекций в суставы 3,6.
Хотя по сравнению с хирургически индуцированной моделью ОА, проще и быстрее вводить MIA в полость сустава, в моделировании все еще есть критические точки. Прежде всего, суставная полость крыс крошечная, и ее расположение должно быть подтверждено перед инъекцией. Во-вторых, МИА токсична, поэтому доза МВД должна быть тщательно подобрана. Сообщалось, что МИА может индуцировать повреждение суставного хряща дозо- и временно-зависимым образом (оцениваемым по гистологической оценке OARSI и шкале Манкина), что указывает на то, что прогрессирование и тяжесть суставных поражений могут модулироваться путем регулирования концентрации MIA22,23. Было обнаружено, что MIA индуцирует боль и маркеры окислительного стресса при высоких дозах 10,18,24. Предыдущие отчеты предполагали, что доза инъекции МИА 1,5 мг у крыс вызывала воспалительный процесс, который похож на ОАколенного сустава человека 18,25. Кроме того, важно использовать одного и того же экспериментатора на протяжении всего поведенческого теста и заранее знакомить крыс с окружающей средой, чтобы уменьшить беспокойство и избежать влияния на результаты экспериментов.
Как упоминалось выше, животные модели ОА обычно делятся на спонтанные и индуцированные модели. Внутрисуставная инъекция МИА широко применяется благодаря ряду преимуществ: 1) простота операции; 2) легкость индукции и воспроизводимость; 3) контролируемая доза и степень тяжести; 4) короткое время моделирования; и 5) пригодность как для мелких, так и для крупных животных. Однако, как и другие модели животных, модели ОА, индуцированные МВД, также имеют несколько недостатков. Обширная гибель клеток и быстрое разрушение суставов после инъекции МИА несовместимы со спонтанным или посттравматическим ОА у людей26. Кроме того, остаточная МИА в суставной полости может влиять на эффекты последующей внутрисуставной терапии, что приводит к неопределенному результату при использовании модели МИА. Следует ли промывать суставную полость перед терапевтической инъекцией в этой модели, остается вопросом без ответа. В целом, не существует единой животной модели, которая идеально повторяет все аспекты ОА человека, но широкое разнообразие доступных моделей позволяет применять несколько моделей к наиболее актуальным вопросам синтетически.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Китайским фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант No: LY17H270016), Национальным фондом естественных наук Китая (грант No: 81774331, 81873049 и 81673997) и Научно-техническим проектом традиционной китайской медицины Китая провинции Чжэцзян (грант No: 2013ZQ007 и 2016ZZ011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam(UK) | 34712 | Primary antibody for immunohistochemistry (IHC) |
| Anti-Collagen X (Col10) antibody | Abcam(UK) | 49945 | Primary antibody for IHC |
| DigiGait Imaging System | Mouse Specifics (Boston, MA, USA) | Equipment for gait patterns analyses | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| MIA | Sigma-Aldrich | I4386-10G | powder |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks. |
| Plantar Test apparatus | UgoBasile (Italy) | 37370 | Equipment for TWL assay |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China) | RR037A | Extracte total RNA from cultured cells |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections. |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor |
References
- Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).
- Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).
- Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. C. Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis. AAPS Journal. 15 (2), 438-446 (2013).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Bijlsma, J. W., Berenbaum, F., Lafeber, F. P. Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet. 377 (9783), 2115-2126 (2011).
- McCoy, A. M. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
- O'Neill, T. W., Felson, D. T.
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
- Takahashi, I., Matsuzaki, T., Hoso, M. Long-term histopathological developments in knee-joint components in a rat model of osteoarthritis induced by monosodium iodoacetate. Journal of Physical Therapy Science. 29 (4), 590-597 (2017).
- Liu, P., et al.
- Combe, R., Bramwell, S., Field, M. J. The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats. Neuroscience Letters. 370 (2-3), 236-240 (2004).
- Pomonis, J. D., et al. Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain. Pain. 114 (3), 339-346 (2005).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. 53 (3), 523-537 (1971).
- Yan, L., et al. Chondroprotective effects of platelet lysate towards monoiodoacetate-induced arthritis by suppression of TNF-α-induced activation of NF-ĸB pathway in chondrocytes. Aging. 11 (9), 2797-2811 (2019).
- Yan, B., et al. Intra-Articular Injection of Extract Attenuates Pain Behavior and Cartilage Degeneration in Mono-Iodoacetate Induced Osteoarthritic Rats. Frontiers in Pharmacology. 9, 1360 (2018).
- Wang, C., et al. Agkistrodon ameliorates pain response and prevents cartilage degradation in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritic rats by inhibiting chondrocyte hypertrophy and apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 231, 545-554 (2019).
- Yamada, E. F., et al. Evaluation of monosodium iodoacetate dosage to induce knee osteoarthritis: Relation with oxidative stress and pain. International Journal of Rheumatic Diseases. 22 (3), 399-410 (2019).
- Schuelert, N., McDougall, J. J. Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).
- Lee, S. E. Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model. Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).
- Piesla, M. J., et al. Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models. Brain Research. 1295, 89-98 (2009).
- Udo, M., et al. Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).
- Guingamp, C., et al. Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry. Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).
- Jeong, J. H., et al. Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes. PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).
- Cook, J. L., et al.
- Little, C. B., Zaki, S. What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).
