Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

النيسرية السحائية عدوى الخلايا البطانية الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

يسلط البروتوكول الموصوف هنا الضوء على الخطوات الرئيسية في التمييز بين الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، وإعداد النيسرية السحائية للعدوى ، وجمع العينات للتحليلات الجزيئية الأخرى.

Abstract

التهاب السحايا بالمكورات السحائية هو عدوى تهدد الحياة تحدث عندما تتمكن النيسرية السحائية (المكورات السحائية ، نانومتر) من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن طريق اختراق الخلايا البطانية الدماغية عالية التخصص (BECs). نظرا لأن Nm هو ممرض خاص بالإنسان ، فإن عدم وجود أنظمة نموذجية قوية في الجسم الحي يجعل دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض بين Nm و BECs أمرا صعبا ويؤسس الحاجة إلى نموذج قائم على الإنسان يحاكي BECs الأصلية. تمتلك BECs خصائص حاجز أكثر إحكاما عند مقارنتها بالخلايا البطانية المحيطية التي تتميز بتقاطعات ضيقة معقدة ومقاومة كهربائية مرتفعة عبر البطانة (TEER). ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج في المختبر ، مثل BECs الأولية و BECs الخالدة ، إما تفتقر أو تفقد خصائصها الحاجزة بسرعة بعد إزالتها من البيئة المكروية العصبية الأصلية. طورت التطورات الحديثة في تقنيات الخلايا الجذعية البشرية طرقا لاشتقاق الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التي تعمل على تحسين BECs الظاهرية عند مقارنتها بالنماذج البشرية الأخرى في المختبر . إن استخدام BECs المشتقة من iPSC (iPSC-BECs) لنمذجة تفاعل Nm-BEC له فائدة في استخدام الخلايا البشرية التي تمتلك خصائص حاجز BEC ، ويمكن استخدامه لفحص تدمير الحاجز ، والتنشيط المناعي الفطري ، والتفاعل البكتيري. نوضح هنا كيفية اشتقاق iPSC-BECs من iPSCs بالإضافة إلى التحضير البكتيري والعدوى وجمع العينات للتحليل.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، وحاجز الدم السحائي CSF (mBCSFB) عبارة عن حواجز خلوية ضيقة للغاية تفصل الدورة الدموية عن الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتكون بشكل أساسي من خلايا بطانة الدماغ عالية التخصص (BECs)1,2. معا ، تحافظ BECs على توازن الدماغ المناسب من خلال تنظيم العناصر الغذائية ومنتجات النفايات داخل وخارج الدماغ ، مع استبعاد العديد من السموم والأدوية ومسببات الأمراض 1,2. يحدث التهاب السحايا الجرثومي عندما تكون البكتيريا المنقولة بالدم قادرة على التفاعل مع الحاجز الذي تشكله BECs واختراقه وتسبب الالتهاب. النيسرية السحائية (Nm، المكورات السحائية) هي بكتيريا سالبة الجرام تستعمر الأنفية من 10-40٪ من الأفراد الأصحاء، ولكن في بعض الحالات يمكن أن تسبب مرضا جهازيا خطيرا3. في الأفراد المصابين ، يمكن أن يتمكن Nm من الوصول إلى مجرى الدم حيث يمكن أن يسبب فرفرية خاطفة وكذلك اختراق BECs للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي مما يسبب التهاب السحايا3. Nm هو السبب الرئيسي لالتهاب السحايا الجرثومي في جميع أنحاء العالم ، وعلى الرغم من جهود التطعيم ، لا يزال السبب الرئيسي لالتهاب السحايا4. التدخل الطبي الحديث ، مثل العلاج بالمضادات الحيوية ، جعل هذه الظروف قابلة للبقاء على قيد الحياة ، ولكن المصابين بالتهاب السحايا غالبا ما يتركون مع تلف عصبي دائم 5,6.

حددت الدراسات السابقة العوامل البكتيرية وإشارات المضيف التي تساهم في تفاعلات Nm-BEC7،8،9،10،11. تم إجراء الالتصاقات والغزوات المحددة مثل بروتين العتامة Opc ، والنوع الرابع من البيلي ، بالإضافة إلى مستقبلات مثل CD147 ، على نماذج BEC المختلفة في المختبر ، ولكن هذه النماذج تفتقر إلى العديد من خصائص BBB المحددة7،9،11،12. لا يزال الفهم الكامل لتفاعلات Nm-BEC بعيد المنال ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم القدرة على استخدام النماذج في الجسم الحي ، وحماية التطعيم غير الكاملة ، ونقص نماذج BEC البشرية القوية في المختبر.

كانت نمذجة hBECs في المختبر صعبة بسبب الخصائص الفريدة ل BECs. بالمقارنة مع الخلايا البطانية المحيطية ، تحتوي BECs على عدد من الأنماط الظاهرية التي تعزز خصائص حاجزها مثل المقاومة الكهربائية العالية عبر البطانية (TEER) بسبب التقاطعات الضيقةالمعقدة 12. بمجرد إزالتها من البيئة المكروية للدماغ ، تفقد BECs بسرعة خصائصها الحاجزة التي تحد من فائدة النماذج الأولية أو الخالدة في المختبر التي تشكل فقط حاجزا ضعيفا12,13. إن الجمع بين الخصوصية البشرية للعدوى ب Nm ، وعدم وجود نماذج قوية في الجسم الحي ، والتحديات التي تواجه نمذجة BECs البشرية في المختبر يخلق حاجة إلى نماذج أفضل لفهم التفاعل المعقد بين المضيف والممرض بين Nm و BECs. في الآونة الأخيرة ، باستخدام تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) النموذجية التي يسببها الإنسان ، تم اشتقاق الخلايا الشبيهة ب BEC من iPSCs التي تحاكي بشكل أفضل BECs في الجسم الحي12،13،14،15. iPSC-BECs من أصل بشري ، وقابلة للتطوير بسهولة ، وتمتلك الأنماط الظاهرية المتوقعة ل BEC مقارنة بنظيراتها الأولية أو الخالدة12،13،14،15. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا نحن وآخرون أن iPSC-BECs مفيدة لنمذجة الأمراض المختلفة للجهاز العصبي المركزي مثل التفاعل بين المضيف والممرض ، ومرض هنتنغتون ، ونقص MCT8 الذي يسبب متلازمة آلان هورندون دادلي16،17،18،19،20،21. نوضح هنا كيفية اشتقاق iPSC-BECs من مصادر iPSC المتجددة وإصابة iPSC-BECs ب Nm مما يؤدي إلى تنشيط الاستجابة المناعية الفطرية. نعتقد أن هذا النموذج مفيد لاستجواب التفاعل بين المضيف ومسبب المرض الذي لا يمكن تلخيصه في نماذج أخرى في المختبر ، وهو مفيد بشكل خاص عند فحص التفاعلات مع مسببات الأمراض البشرية المحددة مثل Nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تكييف جميع وسائل الإعلام / تحضير الكاشف ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وخطوات التمايز من Stebbins et al.22.

1. إعداد المواد اللازمة لثقافة iPSC وتمايز BEC.

  1. طلاء مصفوفة من البلاستيك زراعة الأنسجة (TC) لثقافة IMR90-4 iPSC
    1. هلام مصفوفة الغشاء القاعدي القسمة (على سبيل المثال ، Matrigel) إلى 2.5 ملغ من القسامات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: اعمل بسرعة عند التعامل مع هلام المصفوفة والقسمة على الثلج ، حيث إنها تشكل مادة هلامية أعلى من 4 درجات مئوية ولا يمكن أن تكون معدلة بمجرد أن تتصلب.
    2. لطلاء بلاستيك TC ، أضف بسرعة حصة واحدة من هلام المصفوفة إلى 30 مل من وسيط النسر المعدل (DMEM) / F12 من Dulbecco في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 1 مل من الوسط إلى هلام المصفوفة المجمد ، والماصة لأعلى ولأسفل حتى يذوب ، وانقلها على الفور إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع الوسط المتبقي.
    3. استخدم 1 مل من محلول طلاء الهلام المصفوفة هذا لكل بئر من صفيحة 6 آبار و 12 مل لكل قارورة T75.
      ملاحظة: يمكن تحضير بلاستيك TC المطلي بالهلام المصفوفي لمدة تصل إلى أسبوعين قبل استخدامه. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان تجنب جفاف محلول هلام المصفوفة ، الأمر الذي قد يتطلب إضافة المزيد من DMEM / F12 من حين لآخر فوق الآبار.
  2. تحضير وسط صيانة الخلايا الجذعية عن طريق إضافة 50 مل من مكمل 50x إلى 450 مل من الوسط القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية في البيئة المعقمة لخزانة السلامة الحيوية.
    ملاحظة: تم استخدام وسائط صيانة الخلايا الجذعية الأخرى (mTeSR و E8) في دراسات أخرى 13،14،15 ، 22،23،24،25.
  3. لتحضير 500 مل من الوسط غير المشروط (UM) ، امزج 392.5 مل من DMEM / F12 مع 100 مل من استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و L-glutamine بتركيز نهائي قدره 1 mM ، و 3.5 ميكرولتر من β-mercaptoethanol. قم بتعقيمه وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  4. لتحضير 200 مل من وسط الخلايا البطانية (EC) بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA) بالإضافة إلى bFGF ، ادمج 198 مل من الوسط الخالي من مصل البطانة البشرية (hESFM) ، و 2 مل من المصل المشتق من الصفائح الدموية المعقم بالترشيح (PDS) ، و 20 نانوغرام / مل bFGF. قم بتعقيمه وتخزينه لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. قبل الإضافة إلى الخلايا مباشرة ، أضف 10 ميكرومتر من RA إلى وسط EC.
    ملاحظة: نظرا لإيقاف PDS وبالتالي قد يكون محدودا ، فقد تم إجراء هذا البروتوكول بنجاح باستخدام B27 بدلا من PDS15،23،26.
  5. لتحضير 200 مل من وسط EC بدون RA أو bFGF ، اجمع بين 198 مل من hESFM و 2 مل من PDS المعقم بالمرشح وتعقيم المرشح. يحفظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية.

2. صيانة IMR90-4 ثقافة الخلية

ملاحظة: هنا نستخدم خط الخلايا IMR90-4 كمثال ، ولكن تم استخدام خطوط الخلايا الجذعية الأخرى المستحثة متعددة القدرات مثل CC3 و CD10 و CD12 و DF19-9-11T و 83iCTR و 00iCTR و CS03iCTRn2 بنجاح للتمايز إلى BECs 13،14،15،16،17،23،27،28.

  1. استزراع iPSCs عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 ويتم الاحتفاظ به عادة على ألواح 6 آبار بكثافات مختلفة مع2 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل بئر.
  2. للحفاظ على ثقافة iPSC ، حدد بئرا واحدا للمرور غير متلاقى وله مسافات مفتوحة بين المستعمرات.
    1. نضح وسط الاستزراع ، أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. أثناء الحضانة ، استبدل محلول هلام المصفوفة ، على لوحة جديدة من 6 آبار ، ب 2 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة لكل بئر.
    2. قم بشفط كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية بعناية مع الحرص على عدم نضح الخلايا التي لا تزال متصلة باللوحة.
    3. أضف 6 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية واشطف قاع البئر عدة مرات حتى تنفصل جميع الخلايا تماما. بعد ذلك ، قم بزرع اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار بكثافات متفاوتة ، عادة 1: 6 أو 1:12 للصيانة العادية.
      ملاحظة: باستخدام النسب المذكورة أعلاه ، يتم تقسيم الخلايا مرتين في الأسبوع تقريبا.
    4. حرك اللوحة إلى الحاضنة ووزع الخلايا المصنفة بالتساوي عبر الآبار عن طريق هز اللوحة ذهابا وإيابا ومن اليسار إلى اليمين ، والتوقف مؤقتا بين حركات الاهتزاز المتناوبة حتى يستقر الوسط.

3. تمايز الخلايا البطانية للدماغ عن iPSCs البشرية

  1. طلاء iPSCs للتمايز (اليوم -3 من بروتوكول التمايز)
    1. لكل IMR90-4 ثقافة صيانة تستخدم جيدا للوحة التمايز ، ونضح وسط الثقافة ، وإضافة 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية لكل بئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. قم بتعطيل كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية عن طريق نقل 1 مل من معلق الخلية المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 2 مل على الأقل من وسط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة لكل 1 مل من الخلايا. قم بتدوير تعليق الخلية عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل بئر من خلايا IMR90-4 المستخدمة ، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: قد يكون من المفيد تخفيف 1: 1 باستخدام 0.4٪ تريبان أزرق للتمييز بين الخلايا الحية والميتة عند العد. اعتمادا على كثافة iPSCs ، عادة ما ينتج بئر واحد من لوحة6 آبار 1-10 6 خلايا.
    4. للتمايز في دورق T75 ، أضف 7.5 × 105 خلايا إلى 12 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية ومثبط ROCK (Y27632 ثنائي هيدروكلوريد) بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. نضح محلول طلاء هلام مصفوفة من قارورة T75 ونقل تعليق الخلية إلى القارورة. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق هز القارورة ذهابا وإيابا ومن اليسار إلى اليمين (انظر الخطوة 2.2.4) واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان إضافة مثبط ROCK في هذه الخطوة لتعزيز بقاء الخلايا الجذعية المفردة المنفصلة25,29. يجب توزيع الخلايا بالتساوي عبر القارورة وفي مفردات تظهر مورفولوجيا منتشرة تشبه اللحمة المتوسطة بسبب علاج مثبطات ROCK22.
  2. في اليوم -2 واليوم -1 ، قم بتغيير الوسائط إلى وسيط صيانة الخلايا الجذعية الجديدة ؛ 12 مل لكل T75.
  3. في اليوم 0 ، ابدأ التمايز عن طريق تغيير الوسائط إلى UM ؛ 12 مل لكل T75.
  4. قم بتغيير UM يوميا (اليوم 1 - اليوم 5).
    ملاحظة: تصل الخلايا عادة إلى نقطة التقاء بعد 2 إلى 3 أيام في UM ، والتي يمكن ملاحظتها بالعين المجردة أو من خلال مجهر المجال الساطع المقلوب. مع تقدم التمايز ، تصبح "المسالك العصبية" nestin + مرئية مع خلايا PECAM-1 + بينهما كما هو موضح سابقا13,14.
  5. قم بتوسيع عدد الخلايا البطانية بشكل انتقائي عن طريق التبديل إلى وسط EC مع 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA) (اليوم 6) والحضانة لمدة يومين. يمكن تحضير وسط EC مع bFGF قبل أسبوعين من ذلك. يضاف RA من المخزون المجمد في يوم الاستخدام (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر من مخزون RA 10 mM لكل 1 مل من EC + bFGF).
    ملاحظة: يمكن أيضا تحقيق التمايز الناجح دون مكملات التهاب المفاصل الروماتويدي في اليومين 6 و 8. ومع ذلك ، فإن إغفال RA سيؤدي إلى BECs مع انخفاض TEER12،13،14.
  6. لوحات زراعة خلايا معطف وإدراج غشاء (على سبيل المثال ، Transwell) مع الكولاجين IV و fibronectin (اليوم 7) ، لتنقية BECs والتجارب التالية.
    1. لطلاء حشوات الغشاء ، امزج 4 أجزاء من الكولاجين الوريدي (1 مجم / مل في 0.5 مجم / مل من حمض الأسيتيك) ، وجزء واحد من الفبرونيكتين (1 مجم / مل) و 5 أجزاء من الماء المعقم من درجة الأنسجة. يمكن تخفيف محلول ECM بنسبة 1: 5 لطلاء ألواح زراعة الخلايا (أي 4 أجزاء من الكولاجين الرابع ، 1 جزء من الفبرونيكتين ، 45 جزءا من الماء). احتضان بمحلول طلاء عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يمكن أيضا طلاء الألواح وحشوات الغشاء لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الزراعة الفرعية في نفس يوم خطوة التنقية.
  7. تنقية BECs عن طريق زراعة الخلايا المتمايزة على الكولاجين الوريدي والصفائح المغلفة بالفبرونيكتين أو إدخالات الغشاء (اليوم 8).
    1. نضح وسط EC وإضافة كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية (12 مل لكل T75). احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل 90٪ من الخلايا عن القارورة.
      ملاحظة: يمكن أن يستغرق تفكك الخلايا ما يصل إلى 1 ساعة.
    2. خلال فترة الحضانة ، قم بإزالة محلول طلاء الكولاجين الوريدي / الفبرونيكتين من الألواح / الحشوات المعدة مسبقا واتركها تجف في غطاء معقم. يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة حتى تجف الحشوات.
    3. بمجرد انفصال الخلايا ، اغسلها من القارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل. ماصة صعودا وهبوطا لتحقيق تعليق خلية واحدة.
      ملاحظة: يعد التعليق أحادي الخلية مهما لعد الخلايا بشكل موثوق ولتحقيق طبقة أحادية صلبة.
    4. تمييع مع حجم متساو على الأقل من hESFM الطازجة في أنبوب مخروطي 50 مل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    5. حبيبات الخلايا في 1500 × غرام لمدة 10 دقائق.
    6. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من EC + bFGF + RA المحضرة حديثا لتحقيق تعليق 2 × 106 خلايا / مل للبذر على إدخالات الغشاء. أضف 500 ميكرولتر (1 × 106 خلايا) فوق ملحق 12 بئرا و 1.5 مل من وسط EC + bFGF + RA في الأسفل. للبذر على ألواح 24 و 48 بئرا ، قم بتخفيف تعليق الخلية 1: 2 وإضافة 500 ميكرولتر (5 × 10 5 خلايا) و 250 ميكرولتر (2.5 × 105 خلايا) لكل بئر ، على التوالي. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر / الإدراج (انظر الخطوة 2.2.4) واحتضانها عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  8. قم بتغيير الوسائط على الألواح / الإرسال إلى EC بدون bFGF أو RA (اليوم 9).
  9. قم بإجراء تجارب العدوى ، وقياس TEER ، وتلطيخ التألق المناعي كما هو موضح في الأقسام التالية (اليوم 10).
    ملاحظة: عادة ما تصل BECs المتمايزة والمنقاة بنجاح إلى ذروة TEER في اليوم 10 وتعبر عن علامات مميزة للخلايا البطانية للدماغ مثل PECAM-1 (CD31) و VE-cadherin ، وناقل الجلوكوز GLUT-1 ، وناقلات التدفق مثل p-glycoprotein ، ومكونات الوصلات الضيقة ZO-1 و Occludin و Claudin-5 13،14،16،17،19،22. ارجع إلى Lippmann et al. و Stebbins et al. وآخرون للحصول على مزيد من التفاصيل والصور لأنواع الخلايا والأشكال والتعبير عن العلامات الخاصة بنوع الخلية أثناء عملية التمايز13،14،15،16،17،19،22. يمكن العثور على صور تمثيلية لخلايا IMR90-4 في مراحل مختلفة من عملية تمايز BEC في الشكل التكميلي 1.

4. المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) كمقياس لضيق الحاجز

ملاحظة: عادة ما يقرأ TEER على إدخالات الغشاء في اليومين 9 و 10 من التمايز لتأكيد التوليد الناجح للحاجز الذي يشكل iPSC-BECs (الشكل 1A).

  1. ضع مقياس الفولت-أوم الظهاري (EVOM) في البيئة المعقمة لغطاء السلامة الحيوية وقم بتوصيل القطب ب EVOM.
  2. قم بتطهير القطب عن طريق غمره في 70٪ EtOH لمدة 5 دقائق على الأقل واتركه يجف تماما.
    ملاحظة: حضانة أطول في 70٪ EtOH أو إزالة التلوث من القطب باستخدام محلول هيبوكلوريت 5٪ ممكن إذا لزم الأمر.
  3. استرجع iPSC-BECs على إدخالات الغشاء من الحاضنة وقم بقياس TEER.
    ملاحظة: من المهم قراءة TEER بسرعة بعد إزالتها من الحاضنة لأن تغير درجة الحرارة قد يؤثر على قياس TEER.
  4. اقرأ TEER عن طريق غمس القطب في الوسط بحيث يتم وضع القطب الأقصر أعلى الملحق ويصل القطب الأطول إلى الوسط المحيط بالإدخال.
    ملاحظة: تأكد من أن الأقطاب الكهربائية الموجودة على أطراف "عيدان تناول الطعام" مغطاة بالكامل بالسائل. إذا لزم الأمر ، قم بإمالة البئر لتحقيق ذلك قبل وضع اللوحة مرة أخرى للقياس.

5. تلطيخ المناعي (IF) للتحقق من صحة النمط الظاهري BEC

ملاحظة: للتحقق من جودة الخلايا المتمايزة والمنقاة بالكامل، يتم تلطيخ الطبقات الأحادية iPSC-BEC للعلامات المميزة للخلايا البطانية للدماغ في اليوم العاشر من عملية التمايز كما هو موضح سابقا (الشكل 1B\u2012G) 13،14،15،16،17،19،22.

  1. نضح المتوسطة وغسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
  2. ثبت الخلايا بالميثانول البارد المثلج في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل 3x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وكتله بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في PBS في RT لمدة 1 ساعة.
  4. نضح وإضافة الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حجب. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد و Stebbins et al. للحصول على معلومات تتعلق بمصدر وتخفيف الأجسام المضادة22.
  5. اغسل 3x باستخدام برنامج تلفزيوني قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الحظر. احتضان في RT لمدة 1 ساعة. حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  6. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني. ثم أضف DAPI بتخفيف 1: 5,000 في PBS وصمة عار في RT لمدة 15 دقيقة.
  7. اغسل 1x مع ترك PBS قيد التشغيل والتقط الصور باستخدام مجهر مضان.

6. تحضير البكتيريا وعدوى iPSC-BECs

  1. في اليوم السابق لتجربة العدوى (اليوم 9 من التمايز) ، ابدأ زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها من المخزون المجمد. للعدوى ب Nm ، قم بخط البكتيريا على أجار كولومبيا بنسبة 5٪ من دم الأغنام (أجار الدم). احتضان المزارع البكتيرية في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي (اليوم 10) ، قم بإعداد PPM + طازج عن طريق استكمال وسائط البروتياز الببتون (PPM) ب 50 ميكرولتر من 2 M MgCl 2 ، و 50 ميكرولتر من2 M NaHCO3 ، و 100 ميكرولتر مكمل Kellogg لكل 10 مل. قم بتلقيح 10 مل من وسط PPM + في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع نيوتن متر من لوحة الاستزراع الليلي باستخدام قطعة قطن معقمة. احتضان الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة (أي حتى تصبح البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي).
  3. أثناء الحضانة البكتيرية ، قم بإعداد iPSC-BECs في لوحة 24 بئرا أو على إدخالات غشائية للعدوى عن طريق استبدال الوسط القديم ب 400 ميكرولتر من وسط EC الطازج (بدون bFGF أو RA) لكل بئر / أعلى إدخال الغشاء.
  4. ثقافة بكتيرية بالطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق ونضح الوسائط. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  5. في 4 مل من برنامج تلفزيوني طازج ، استخدم جزءا من تعليق الخلايا البكتيرية واضبط على OD600 من 0.4 (حوالي 1 × 108 CFU / mL).
  6. بعد ذلك ، قم بتخفيف البكتيريا في وسط زراعة الخلايا (وسط EC) وفقا لتعدد العدوى المطلوب (MOI).
    ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة ل MOI من 10 ، قم بتخفيف 1:10 أو 1: 5 عند إصابة iPSC-BECs في لوحة 24 بئرا أو على إدخالات غشائية ، على التوالي (1 × 105 خلايا لكل طبقة أحادية في لوحة 24 بئرا). لم يتم تضمين إضافة المصل البشري في تحضير نانومتر للعدوى كما هو موضح في مخطوطات أخرى حيث لوحظ أن لها تأثيرا ضارا على النمط الظاهري لحاجز iPSC-BEC كما تم قياسه بواسطة TEER (البيانات غير معروضة) 30,31. ومع ذلك ، فإن تفاعل Nm و iPSC-BECs لا يتأثر بمصل بشري أو بدونه (البيانات غير معروضة).
  7. تصيب iPSC-BECs في كل بئر ب 100 ميكرولتر من معلق البكتيريا المحضر وتحتضنها في الوقت المطلوب للعدوى.
    ملاحظة: يرتفع التعبير عن عدد من السيتوكينات والكيموكينات المسببة للالتهابات في iPSC-BECs عند الإصابة ب Nm ، وبشكل بارز بعد 8 ساعات من العدوى كما هو موضح سابقا من قبل Martins-Gomes et al (الشكل 2) 19.

7. التنشيط المناعي الفطري عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي

ملاحظة: باستخدام عزل الحمض النووي الريبي المفضل ، وتخليق cDNA ، وبروتوكول qPCR ، قم بجمع العينات وتشغيل qPCR على السيتوكينات المحددة.

  1. 7.1. جمع الحمض النووي الريبي من عينات BEC بعد الإصابة في اليوم 10 من بروتوكول التمايز ، باستخدام الكواشف تشكل مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تجنب تلوث العينات بالنوكلياز من خلال العمل بعناية في بيئة نظيفة ومعقمة.
    1. قم بإعداد مخزن التحلل المؤقت وأضف 350 ميكرولتر إلى كل بئر / طبقة أحادية من iPSC-BECs.
    2. اجمع العينات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات (على سبيل المثال ، 20x) ونقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي.
    3. اتبع البروتوكول المرفق مع مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي من الخلايا والأنسجة المزروعة.
    4. بعد الشطف في الماء الخالي من النيوكلياز ، احتفظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد لتقليل أي نشاط محتمل ل RNase.
    5. تقدير تركيزات الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop).
  2. قم بإنشاء مكتبة cDNA من الحمض النووي الريبي الذي تم جمعه باستخدام مجموعة تخليق cDNA (انظر جدول المواد).
    1. قم بإعداد تفاعلات تتكون من مزيج رئيسي لتخليق cDNA ، على الأقل 200 نانوغرام (من الناحية المثالية 500 نانوغرام) من عينة الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من النيوكلياز في حجم تفاعل إجمالي محدد كما هو موضح في بروتوكول مجموعة تخليق cDNA.
    2. على جهاز تدوير حراري قياسي ، قم بتشغيل برنامج مناسب لكواشف مجموعة تخليق cDNA المستخدمة. على سبيل المثال: 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. بعد التوليف ، قم بتخفيف cDNA حتى 1:10 في الماء الخالي من النيوكلياز وانقل العينات إلى 4 درجات مئوية على المدى القصير أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
      ملاحظة: قد يكون التخفيف المنخفض ضروريا إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفضا (على سبيل المثال ، أقل من 50 نانوغرام). يمكن تخزين cDNA المخفف عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
  3. قم بإجراء qPCR على عينات cDNA التي تستهدف نسخ جينات الاستجابة المناعية الفطرية مثل السيتوكينات والكيموكينات باستخدام مواد أولية مصممة بعناية ومعتمدة من صحتها.
    ملاحظة: نظرا لأن تصميم التمهيدي مهم جدا لجودة نتائج qPCR ، يجب اختبار كفاءة التمهيدي لإجراء سلسلة تخفيف ويجب تأكيد عدم وجود منتجات متعددة على هلام الحمض النووي.
    1. لكل تفاعل 25 ميكرولتر ، استخدم 0.5 ميكرولتر أمامي و 0.5 ميكرولتر عكسي التمهيدي (10 مللي مول في الماء الخالي من النيوكلياز) ، 1 ميكرولتر cDNA ، 10.5 ميكرولتر من النيوكلياز الخالي من H2O ، و 12.5 ميكرولتر qPCR المزيج الرئيسي.
    2. قم بإجراء التفاعل على جهاز qPCR باستخدام بروتوكول cycler التالي: (أ) 4 °C لمدة 2 دقيقة ؛ (ب) 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ (ج) 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ (د) 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ دورة من خلال (ج) و (د) 45 مرة ؛ (ه) منحنى الذوبان الاختياري: 30-99 درجة مئوية بزيادات قدرها 1 درجة مئوية؛ 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. لتحليل البيانات ، استخدم حساب ΔΔCT لمقارنة مستويات تعبير السيتوكين والكيموكين بجين التدبير المنزلي المرجعي مثل 18S أو GAPDH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول الموصوف هنا مقتبس من Stebbins et al. ويسلط الضوء على عملية التمييز بين iPSCs إلى خلايا بطانية تشبه الدماغ تمتلك خصائص BBB ، وكيفية استخدام هذا النموذج لدراسات العدوى باستخدام iPSC-BECs مع Nm19,22. وعند تمييز المستضدات ثنائية السلسلة ونقاط الضعف والإحصاء، عند تمييزها بشكل صحيح، تظهر خصائص حاجز محكم يقاس بواسطة TEER والتي غالبا ما تكون أكبر من 2000 Ω·سم 2، وتعبر عن علامات البطانة مثل VE-cadherin وCD31 (PECAM) (الشكل 1A\u2012C). بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تعبر عن علامات التقاطع الضيقة Claudin-5 و Occludin و ZO-1 (الشكل 1 D-F) وتحدد موقعها، والناقلات مثل Glut-1 (الشكل 1G). عند الإصابة ب Nm ، تستجيب iPSC-BECs للعدوى من خلال تنظيم السيتوكينات الالتهابية للعدلات كما تم قياسها بواسطة qPCR مثل IL-8 (CXCL8) و CXCL1 و CXCL2 و CCL20 و IL6 (الشكل 2A\u2012E). توضح هذه النتائج التمثيلية كيفية ضمان التمييز بين iPSC-BECs بشكل موثوق ، وكيفية فحص استجابة iPSC-BECs للعدوى ب Nm.

Figure 1
الشكل 1: توصيف iPSC-BECs. (أ) TEER من تمايزين فرديين منفصلين ، يقرأ في الأيام 9-12. البيانات المقدمة كوسيط لثلاث نسخ. تمثل أشرطة الخطأ ± SD. (B\u2012G) بيانات التألق المناعي التمثيلية التي تظهر التعبير عن علامات الخلايا البطانية VE-cadherin (B) وPECAM-1 (CD31; C) ، مكونات التقاطع الضيقة Claudin-5 (D) ، Occludin (E) ، و ZO-1 (F) ، وناقل الجلوكوز GLUT-1 (G). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. وقد استخدمت اللوحات B\u2012G من هذا الرقم بإذن من كيم وآخرين نشرت في الأصل في Fluids and Barriers of the CNS، وهي مجلةBMC 17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: زيادة تنظيم السيتوكينات بواسطة iPSC-BECs عند الإصابة بالنيسرية السحائية. تظهر بيانات qPCR التمثيلية التعبير النسبي لنصوص CXCL8 (A) و CXCL1 (B) و CXCL2 (C) و CCL20 (D) و IL6 (E) بعد 8 ساعات من الإصابة ، ومقارنة المصابين بطبقة أحادية iPSC-BEC غير مصابة. تم تقديم البيانات كمتوسط لثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. تمثل أشرطة الخطأ ± S.D. اختبار t للطالب المستخدم لتحديد الأهمية. * ص < 0.05 ؛ ** ع < 0.01 ؛ ص < 0.001. تم تعديل هذا الرقم واستخدامه بإذن من Martins Gomes et al. نشر في الأصل في Frontiers in Microbiology19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: خلايا IMR90-4 في مراحل مختلفة من عملية تمايز BEC. صور تمثيلية لثقافة الصيانة IMR90-4 جاهزة للمرور (A) والخلايا في مراحل مختلفة من عملية تمايز BEC: (B) بعد البذر بمثبط ROCK (اليوم -2) ، (C) في بداية التمايز (اليوم 0) ، (D) اليوم الأول من الالتقاء (اليوم 3) ، (E) نهاية مرحلة UM (اليوم 6) ، (F) قبل تنقية BEC (اليوم 8) ، و (G و H) بعد تنقية BEC (اليوم 9 واليوم 10). يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واجهت نمذجة BECs و BBB تحديات ، حيث تميل BECs البشرية الأولية والخالدة ، في المختبر ، إلى الافتقار إلى الأنماط الظاهرية القوية للحواجز. سمح ظهور تقنيات الخلايا الجذعية البشرية بتوليد خلايا شبيهة ب BEC مشتقة من iPSC والتي تحتفظ بالأنماط الظاهرية BBB المميزة المتوقعة مثل العلامات البطانية ، وتعبير الوصلة الضيقة ، وخصائص الحاجز ، والاستجابة لأنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الأخرى ، وناقلات التدفق الوظيفي 12،13،14،15 ، 22 ، 24 ، 25. وقد مكن ذلك الباحثين من استخدام BECs في المختبر التي تحاكي عن كثب BECs في الجسم الحي ونمذجة الأمراض المختلفة مع خلل BBB المبلغ عنه16،17،19،20،21،32. Nm هو السبب الرئيسي لالتهاب السحايا الجرثومي وهو ممرض خاص بالإنسان يفتقر إلى نماذج قوية في الجسم الحي 19. وقد استلزم هذا القيد استخدام نماذج هندسية أفضل لدفع اكتشاف تفاعل جديد بين المضيف والممرض بين Nm و BBB. لقد أثبتنا مؤخرا أن iPSC-BECs هي نموذج قابل للتطبيق لاستجواب تفاعل Nm-BEC19.

نصف هنا طريقة عامة لاشتقاق iPSC-BECs والإصابة ب Nm مما يؤدي إلى زيادة تنظيم السيتوكينات المسببة للالتهابات التي تسببها عادة العدوىالبكتيرية 19. بالنسبة لاشتقاق iPSC-BECs ، نتبع البروتوكول بشكل عام كما هو موضح في Stebbins et al. لتوليد iPSC-BECs ، مع تعديلات طفيفة22. على وجه الخصوص ، نستخدم هنا وسائط StemFlex بدلا من mTesR1 ، ولكن يمكن استخدام أي من الوسائط للحفاظ على زراعة الخلايا الجذعية17. لقد ثبت أن هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع العديد من خطوط iPSC ، ولكن من المهم تحديد كثافة البذر المثلى لكل خط iPSC فردي15 ، 24. بالنسبة لهذه المخطوطة ، استخدمنا خط خلية IMR90-4 وقد ثبت سابقا أن 1 × 105 خلايا / سم2 كانت كثافة البذر الأولية المثلى24. أخيرا ، كدليل على هوية BECs التي تم إنشاؤها ، تعبر iPSC-BECs عن علامات الخلايا البطانية المتوقعة والوصلات الضيقة بينما تظهر TEER عالية (الشكل 1) 13،14،15،24. هذه الأنماط الظاهرية ، بالإضافة إلى كونها من أصل بشري ، تجعل iPSC-BECs أداة قوية لاستجواب تفاعل Nm-BEC.

تم تكييف إعداد Nm للعدوى من الطرق المنشورة سابقا19,33. لضمان عدم إدخال وسائط النمو البكتيري في تجارب زراعة الخلايا ، تم إجراء خطوة غسيل وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الطرق. أخيرا ، لوحظ سابقا أن MOI من 10 يؤدي إلى تنشيط iPSC-BECs من خلال تنظيم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات19. وقد لوحظ تنشيط BECs استجابة للبكتيريا المختلفة من خلال تنظيم chemokines العدلات والسيتوكينات6. وقد لوحظ سابقا أن iPSC-BECs تنظم الجاذبات الكيميائية القوية للعدلات IL-8 و CXCL1 و CXCL2 بعد الإصابة بالمكورات العقدية من المجموعة B و Nm16,19. توضح هذه الاستجابة الملحوظة ل iPSC-BECs أن هذه الخلايا قادرة على اكتشاف البكتيريا وتنشيط برنامج المناعة الفطري مما يؤدي إلى زيادة تنظيم السيتوكينات. طرق الكشف عن تنظيم هذه السيتوكينات بواسطة qPCR راسخة وموصوفة بإيجاز أعلاه. ومع ذلك ، من المثير للاهتمام ، في حين يتم الكشف عن هذه السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة qPCR ، فإن منتجات البروتين الإحداثي إما غير مكتشفة أو منخفضة جدا16,19. في الوقت الحاضر ، من غير الواضح ما إذا كانت هذه قطعة أثرية من نماذج iPSC-BEC ، أو ما إذا كانت الوفرة المنخفضة الملحوظة للسيتوكينات ذات صلة بيولوجيا. ستكون هناك حاجة إلى أبحاث مستقبلية لتحديد آلية وراء الانفصال بين التعبير والإفراز.

تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لنموذج iPSC-BEC في التعبير عن التقاطعات الضيقة التي تساهم في وظيفة الحاجز وتوطينها كما هو الحال في TEER 12،13،14،15،22. أظهر العمل السابق مع Streptococcus agalactiae (المجموعة B Streptococcus ، GBS) أن تنظيم الحلزون 1 يساهم في تدمير تقاطعات BBB الضيقة في المختبر وفي الجسم الحي34. في الآونة الأخيرة ، تم تأكيد هذه النتيجة في نموذج iPSC-BEC مع كل من GBS و Nm مما يشير إلى آلية لكيفية قدرة البكتيريا على تعطيل سلامة BBB أثناء العدوى16,19. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن Nm يتفاعل مع CD147 على الخلايا البطانية التي تعزز الارتباط البكتيري ، وفي النهاية إعادة تنظيم الوصلات الضيقة مما يؤدي إلى خلل في الحاجز9. لقد أثبتنا أن Nm يتزامن مع CD147 في iPSC-BECs مما يجعل هذا النموذج مثاليا للتوضيح المستقبلي لتفاعلات Nm-CD147 من حيث صلتها بخلل BBB19.

توضح الطريقة المعروضة هنا تمايز iPSC-BECs من مصدر الخلايا الجذعية متعدد القدرات ، والتطبيق مع عدوى Nm. iPSC-BECs هي من أصل بشري ، وعلامات بطانية صريحة ، وتمتلك أنماطا ظاهرية محددة BBB مما يجعلها نموذجا مثاليا لفحص مسببات الأمراض البشرية المحددة مثل Nm. أخيرا ، نحن قادرون على إثبات أن نموذج iPSC-BEC يستجيب للعدوى البكتيرية من خلال تنظيم استجابة السيتوكين العدلات. مجتمعة ، يتمتع نموذج iPSC-BEC بمزايا معينة على أنظمة النماذج الأولية والخالدة لفحص تفاعلات المضيف والممرض في BBB. وينبغي أن يهدف المزيد من العمل إلى توضيح آليات تدمير BBB أثناء التهاب السحايا الجرثومي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم L.M.E. من خلال برنامج التدريب البحثي DFG GRK2157 بعنوان "نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد لدراسة الالتهابات الميكروبية بواسطة مسببات الأمراض البشرية" الممنوحة ل A. S-U. يتم دعم BJK من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من قبل مؤسسة Alexander von Humboldt. بالإضافة إلى ذلك ، نعترف ب Lena Wolter لمساعدتها الفنية في إنشاء iPSC-BECs في الثقافة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Tags

النيسرية السحائية التهاب السحايا بالمكورات السحائية الخلايا البطانية الدماغية تفاعلات المضيف الممرض أنظمة النماذج في الجسم الحي نموذج قائم على الإنسان تقاطعات ضيقة المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) نماذج في المختبر BECs الأولية BECs الخالدة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) BECs المشتقة من IPSC (IPSC-BECs) تدمير الحاجز تنشيط المناعة الفطري التفاعل البكتيري

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>النيسرية السحائية</em> عدوى الخلايا البطانية الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter