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Immunology and Infection

निसेरिया मेनिनजाइटिस प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल व्युत्पन्न मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं का संक्रमण

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल व्युत्पन्न मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने, संक्रमण के लिए नीसेरिया मेनिन्जाइटिस की तैयारी और अन्य आणविक विश्लेषणों के लिए नमूना संग्रह में प्रमुख चरणों पर प्रकाश डालता है।

Abstract

मेनिंगोकोकल मेनिन्जाइटिस एक जीवन-धमकी देने वाला संक्रमण है जो तब होता है जब नीसेरिया मेनिन्जाइटिस (मेनिंगोकोकस, एनएम) अत्यधिक विशिष्ट मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीईसी) को भेदकर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक पहुंच प्राप्त कर सकता है। चूंकि एनएम एक मानव-विशिष्ट रोगज़नक़ है, विवो मॉडल सिस्टम में मजबूत की कमी एनएम और बीईसी के बीच मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के अध्ययन को चुनौतीपूर्ण बनाती है और एक मानव आधारित मॉडल की आवश्यकता को स्थापित करती है जो देशी बीईसी की नकल करता है। जटिल तंग जंक्शनों और ऊंचा ट्रांस-एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईआर) की विशेषता वाले परिधीय एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में बीईसी में सख्त बाधा गुण होते हैं। हालांकि, कई इन विट्रो मॉडल, जैसे कि प्राथमिक बीईसी और अमर बीईसी, देशी तंत्रिका माइक्रोएन्वायरमेंट से हटाने के बाद या तो अपने बाधा गुणों की कमी या तेजी से खो देते हैं। मानव स्टेम-सेल प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल (आईपीएससी) से मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के तरीके विकसित किए हैं जो अन्य इन विट्रो मानव मॉडल की तुलना में बीईसी की बेहतर फेनोकॉपी करते हैं। एनएम-बीईसी इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न बीईसी (आईपीएससी-बीईसी) के उपयोग से मानव कोशिकाओं का उपयोग करने का लाभ होता है जिनके पास बीईसी बाधा गुण होते हैं, और इसका उपयोग बाधा विनाश, जन्मजात प्रतिरक्षा सक्रियण और जीवाणु संपर्क की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि विश्लेषण के लिए बैक्टीरिया की तैयारी, संक्रमण और नमूना संग्रह के अलावा आईपीएससी से आईपीएससी-बीईसी कैसे प्राप्त करें।

Introduction

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), और मेनिंगियल रक्त-सीएसएफ बाधा (एमबीसीएसएफबी) बेहद तंग सेलुलर बाधाएं हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से परिसंचरण को अलग करती हैं और मुख्य रूप से अत्यधिक विशिष्ट मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीईसी) 1,2 से युक्त होती हैं। साथ में, बीईसी मस्तिष्क के अंदर और बाहर पोषक तत्वों और अपशिष्ट उत्पादों को विनियमित करके उचित मस्तिष्क होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं, जबकि कई विषाक्त पदार्थों, दवाओं और रोगजनकोंको छोड़कर 1,2। बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस तब होता है जब रक्त-जनित बैक्टीरिया बीईसी द्वारा गठित बाधा के साथ बातचीत करने और प्रवेश करने में सक्षम होते हैं और सूजन का कारण बनते हैं। नीसेरिया मेनिन्जाइटिस (एनएम, मेनिंगोकोकस) एक ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो स्वस्थ व्यक्तियों के 10-40% के नासोफैरैनक्स को उपनिवेशित करता है, लेकिन कुछ मामलों में गंभीरप्रणालीगत बीमारी का कारण बन सकता है। प्रभावित व्यक्तियों में, एनएम रक्त प्रवाह तक पहुंच प्राप्त कर सकता है जहां यह पुरपुरा फुलमिनन्स का कारण बन सकता है और साथ ही बीईसी में प्रवेश कर सकता है जो मेनिन्जाइटिस3 के कारण सीएनएस तक पहुंच प्राप्त कर सकता है। एनएम दुनिया भर में बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस का एक प्रमुख कारण है, और टीकाकरण के प्रयासों के बावजूद, अभी भी मेनिन्जाइटिस4 का एक प्राथमिक कारण है। आधुनिक चिकित्सा हस्तक्षेप, जैसे एंटीबायोटिक उपचार, ने इन स्थितियों को जीवित रखा है, हालांकि मेनिन्जाइटिस से प्रभावित लोगों को अक्सर स्थायी न्यूरोलॉजिकल क्षति 5,6 के साथ छोड़ दिया जाता है।

पिछले अध्ययनों ने जीवाणु कारकों और मेजबान सिग्नलिंग की पहचान की है जो एनएम-बीईसी इंटरैक्शन 7,8,9,10,11 में योगदान करते हैं। पहचाने गए एडेसिन और इनवासिन जैसे कि अपारदर्शिता प्रोटीन ओपीसी, और टाइप -4 पिली, साथ ही सीडी 147 जैसे रिसेप्टर्स, विट्रो में विभिन्न बीईसी मॉडल पर आयोजित किए गए हैं, हालांकि इन मॉडलों में बीबीबी गुणों को परिभाषित करने वाले कई गुणों की कमीहै 7,9,11,12। एनएम-बीईसी इंटरैक्शन की पूरी समझ आंशिक रूप से विवो मॉडल में उपयोग करने में असमर्थता, अपूर्ण टीकाकरण सुरक्षा और विट्रो में मजबूत मानव बीईसी मॉडल की कमी के कारण मुश्किल है।

बीईसी के अद्वितीय गुणों के कारण इन विट्रो में एचबीईसी मॉडलिंग चुनौतीपूर्ण रही है। परिधीय एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में, बीईसी में कई फेनोटाइप होते हैं जो जटिल तंग जंक्शनों के कारण उच्च ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल प्रतिरोध (टीईआर) जैसे उनके बाधा गुणों कोबढ़ाते हैं। एक बार मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट से हटा दिए जाने के बाद, बीईसी तेजी से प्राथमिक या अमर इन विट्रो मॉडल की उपयोगिता को सीमित करने वाले अपने बाधा गुणों को खो देते हैं जो केवल एक कमजोर बाधा12,13 बनाते हैं। एनएम संक्रमण की मानव विशिष्टता का संयोजन, विवो मॉडल में मजबूत की कमी, और विट्रो में मानव बीईसी मॉडलिंग चुनौतियों ने एनएम और बीईसी के बीच जटिल मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत को समझने के लिए बेहतर मॉडल की आवश्यकता पैदा की। हाल ही में मॉडल मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हुए बीईसी जैसी कोशिकाओं को आईपीएससी से प्राप्त किया गया है जो विवो12,13,14,15 में बीईसी की बेहतर नकल करते हैं। आईपीएससी-बीईसी मानव मूल के हैं, आसानी से स्केलेबल हैं, और उनके प्राथमिक या अमर समकक्षों12,13,14,15 की तुलना में अपेक्षित बीईसी फेनोटाइप हैं। इसके अतिरिक्त हमने और अन्य लोगों ने प्रदर्शित किया है कि आईपीएससी-बीईसी सीएनएस के विभिन्न रोगों जैसे मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत, हंटिंगटन की बीमारी और एमसीटी 8 की कमी के मॉडलिंग के लिए उपयोगी हैं जो एलन-हर्ंडन-डडली सिंड्रोम 16,17,18,19,20,21 का कारण बनता है।. यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि नवीकरणीय आईपीएससी स्रोतों से आईपीएससी-बीईसी कैसे प्राप्त करें और एनएम के साथ आईपीएससी-बीईसी के संक्रमण से जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सक्रियता होती है। हमारा मानना है कि यह मॉडल मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए उपयोगी है जो अन्य इन विट्रो मॉडल में पुन: उत्पन्न होने में असमर्थ है और एनएम जैसे मानव विशिष्ट रोगजनकों के साथ बातचीत की जांच करते समय विशेष रूप से उपयोगी है।

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Protocol

नोट: सभी मीडिया / अभिकर्मक तैयारी, स्टेम-सेल रखरखाव, और भेदभाव चरण स्टेबिन्स एट अल .22 से अनुकूलित हैं।

1. आईपीएससी संस्कृति और बीईसी भेदभाव के लिए आवश्यक सामग्री की तैयारी।

  1. आईएमआर 90-4 आईपीएससी संस्कृति के लिए ऊतक संस्कृति (टीसी) प्लास्टिक की मैट्रिक्स कोटिंग
    1. एलिकोट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जेल (जैसे, मैट्रीगेल) को 2.5 मिलीग्राम एलिकोट में और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: बर्फ पर मैट्रिक्स जेल और एलिकोट को संभालते समय जल्दी से काम करें, क्योंकि यह 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर एक जेल बनाता है और एक बार जमने के बाद इसे एलिकोट नहीं किया जा सकता है।
    2. कोटिंग टीसी प्लास्टिक के लिए, जल्दी से 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम)/एफ 12 माध्यम के 30 एमएल में मैट्रिक्स जेल का एक एलिकोट जोड़ें। जमे हुए मैट्रिक्स जेल पर माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें, इसे पिघलाने तक ऊपर और नीचे पिपेट करें, और शेष माध्यम के साथ तुरंत 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में इस मैट्रिक्स जेल-कोटिंग समाधान के 1 एमएल और प्रति टी 75 फ्लास्क में 12 एमएल का उपयोग करें।
      नोट: मैट्रिक्स जेल-लेपित टीसी प्लास्टिक का उपयोग करने से दो सप्ताह पहले तक तैयार किया जा सकता है। हालांकि, यह बचना महत्वपूर्ण है कि मैट्रिक्स जेल समाधान सूख जाता है, जिसके लिए कुओं के शीर्ष पर कभी-कभी अधिक डीएमईएम / एफ 12 जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाँझ वातावरण में स्टेम सेल रखरखाव बेसल माध्यम के 450 एमएल में 50 x पूरक के 50 मिलीलीटर जोड़कर स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम तैयार करें।
    नोट: अन्य स्टेम-सेल रखरखाव मीडिया (एमटीईएसआर और ई 8) का उपयोग अन्य अध्ययनों 13,14,15, 22,23,24,25 में किया गया है।
  3. 500 एमएल अनकंडीशंड मीडियम (यूएम) तैयार करने के लिए, 392.5 एमएल डीएमईएम/एफ12 को 100 एमएल नॉक आउट सीरम रिप्लेसमेंट (केओएसआर), 5 एमएल गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, एल-ग्लूटामाइन को 1 एमएम की अंतिम सांद्रता पर और 3.5 μL β-मर्कैप्टोएथेनॉल के साथ मिलाएं। फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंडोथेलियल सेल (ईसी) मीडियम प्लस रेटिनोइक एसिड (आरए) प्लस बीएफजीएफ के 200 एमएल तैयार करने के लिए, 198 एमएल मानव एंडोथेलियल सीरम फ्री मीडियम (एचईएसएफएम), 2 एमएल फिल्टर-स्टरलाइज्ड प्लेटलेट-खराब व्युत्पन्न सीरम (पीडीएस), और 20 एनजी / एमएल बीएफजीएफ को मिलाएं। फ़िल्टर करें, निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें। कोशिकाओं के अलावा, ईसी माध्यम में आरए के 10 μM जोड़ें।
    नोट: चूंकि पीडीएस को बंद कर दिया गया है और इसलिए इसे सीमित किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल को पीडीएस15,23,26 के स्थान पर बी 27 का उपयोग करके सफलतापूर्वक आयोजित किया गया है।
  5. आरए या बीएफजीएफ के बिना ईसी माध्यम के 200 एमएल तैयार करने के लिए, 198 एमएल एचईएसएफएम और 2 एमएल फिल्टर स्टरलाइज्ड पीडीएस को मिलाएं और फ़िल्टर स्टरलाइज़ करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह तक स्टोर करें।

2. रखरखाव आईएमआर 90-4 सेल संस्कृति

नोट: यहां हम एक उदाहरण के रूप में आईएमआर 90-4 सेल लाइन का उपयोग करते हैं, हालांकि अन्य प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल लाइनें जैसे सीसी 3, सीडी 10, सीडी 12, डीएफ 19-9-11 टी, 83 आईसीटीआर, 00आईसीटीआर, और सीएस 03 आईसीटीआरएन 2 को बीईसी 13,14,15,16,17,23,27,28 में भेदभाव के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है।

  1. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर आईपीएससी की संस्कृति करें और आमतौर पर प्रति कुएं2 एमएल स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम के साथ विभिन्न घनत्वों पर 6-वेल प्लेटों पर बनाए रखें।
  2. आईपीएससी संस्कृति के रखरखाव के लिए, मार्ग के लिए एक एकल कुएं का चयन करें जो सुसंगत नहीं है और कॉलोनियों के बीच खुली जगह है।
    1. कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें, गैर-एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़ें, और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जबकि इनक्यूबेशन चल रहा है, मैट्रिक्स जेल समाधान को एक नई 6-वेल प्लेट पर बदलें, प्रति कुएं 2 एमएल ताजा स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम के साथ।
    2. गैर-एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक को ध्यान से एस्पिरेट करें ताकि प्लेट से जुड़ी कोशिकाओं को एस्पिरेट न किया जा सके।
    3. स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम के 6 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से नीचे कुछ बार कुल्ला करें जब तक कि सभी कोशिकाएं पूरी तरह से अलग न हो जाएं। फिर, अलग-अलग घनत्व के साथ नई 6-वेल प्लेट को बीज दें, आमतौर पर सामान्य रखरखाव के लिए 1: 6 या 1: 12।
      नोट: उपरोक्त अनुपात का उपयोग करके, कोशिकाओं को सप्ताह में लगभग दो बार विभाजित किया जाता है।
    4. प्लेट को इनक्यूबेटर में ले जाएं और प्लेट को आगे और पीछे और बाएं से दाएं हिलाकर, बारी-बारी से हिलने की गति के बीच में रोककर कुओं में बीज वाली कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें जब तक कि माध्यम व्यवस्थित न हो जाए।

3. मानव आईपीएससी से मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं का भेदभाव

  1. विभेदन के लिए आईपीएससी की चढ़ाना (विभेदन प्रोटोकॉल का दिन -3 )।
    1. प्रति आईएमआर 90-4 रखरखाव संस्कृति का उपयोग भेदभाव के लिए प्लेट करने, कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करने, प्रति कुएं 1 एमएल एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ने और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए किया जाता है।
    2. 1 एमएल विघटित सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करके एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक को निष्क्रिय करें, जिसमें प्रति 1 एमएल कोशिकाओं में कम से कम 2 एमएल ताजा स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम हो। सेल सस्पेंशन को 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर घुमाएं।
    3. आईएमआर 90-4 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से स्टेम सेल रखरखाव माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
      नोट: गिनती करते समय जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए 0.4% ट्राइपैन ब्लू के साथ 1: 1 को पतला करना सहायक हो सकता है। आईपीएससी के घनत्व के आधार पर, 6-वेल प्लेट का एक कुआं आमतौर पर 1-2 x 106 कोशिकाओं का उत्पादन करता है।
    4. टी 75 फ्लास्क में भेदभाव के लिए, 10 μM की अंतिम सांद्रता पर स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम और रॉक अवरोधक (Y27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड) के 12 मिलीलीटर में 7.5 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें और टी 75 फ्लास्क से एस्पिरेट मैट्रिक्स जेल-कोटिंग समाधान और सेल निलंबन को फ्लास्क में स्थानांतरित करें। फ्लास्क को आगे और पीछे और बाएं से दाएं हिलाकर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें (चरण 2.2.4 देखें) और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: अलग किए गए एकल स्टेम कोशिकाओं25,29 के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए इस चरण में रॉक अवरोधक जोड़ना महत्वपूर्ण है। रॉक अवरोधक उपचार22 के कारण कोशिकाओं को फ्लास्क में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए और एक प्रसार, मेसेनकाइमल जैसी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करने वाले सिंगल्स में वितरित किया जाना चाहिए।
  2. दिन -2 और दिन -1 पर, मीडिया को नए स्टेम-सेल रखरखाव माध्यम में बदलें; 12 एमएल प्रति टी 75।
  3. दिन 0 पर, मीडिया को यूएम में बदलकर भेदभाव शुरू करें; 12 एमएल प्रति टी 75।
  4. दैनिक यूएम बदलें (दिन 1 - दिन 5)।
    नोट: कोशिकाएं आमतौर पर यूएम में 2 से 3 दिनों के बाद संगम तक पहुंचती हैं, जिसे नग्न आंखों से या उल्टे उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा जा सकता है। जैसे-जैसे भेदभाव बढ़ता है, नेस्टीन + "तंत्रिका ट्रैक्ट" पीईसीएएम -1 + कोशिकाओं के साथ दिखाई देने लगते हैं जैसा कि पहले वर्णित13,14 था।
  5. 20 एनजी / एमएल बीएफजीएफ और 10 μM रेटिनोइक एसिड (आरए) (दिन 6) के साथ ईसी माध्यम पर स्विच करके और दो दिनों के लिए इनक्यूबेट करके एंडोथेलियल सेल आबादी का चुनिंदा विस्तार करें। बीएफजीएफ के साथ ईसी माध्यम दो सप्ताह पहले तक तैयार किया जा सकता है। आरए को उपयोग के दिन जमे हुए स्टॉक से जोड़ा जाता है (उदाहरण के लिए, ईसी + बीएफजीएफ के प्रति 1 एमएल प्रति 10 एमएम आरए स्टॉक का 1 μL)।
    नोट: 6 और 8 दिनों में आरए के पूरक के बिना सफल भेदभाव भी प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, आरए को हटाने से बीईसी को टीईआर12,13,14 में कमी आएगी।
  6. बीईसी के शुद्धिकरण और निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कोलेजन IV और फाइब्रोनेक्टिन (दिन 7) के साथ कोट सेल कल्चर प्लेटें और झिल्ली सम्मिलित (जैसे, ट्रांसवेल)।
    1. झिल्ली डालने की कोटिंग के लिए, 4 भागों कोलेजन IV (0.5 मिलीग्राम / एमएल एसिटिक एसिड में 1 मिलीग्राम / एमएल), 1 भाग फाइब्रोनेक्टिन (1 मिलीग्राम / एमएल) और 5 भागों बाँझ ऊतक-ग्रेड पानी को मिलाएं। ईसीएम समाधान को कोटिंग सेल कल्चर प्लेटों (यानी, 4 भाग कोलेजन IV, 1 भाग फाइब्रोनेक्टिन, 45 भाग पानी) के लिए 1: 5 पतला किया जा सकता है। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोटिंग घोल के साथ इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्लेटों और झिल्ली के आवेषण को शुद्धिकरण चरण के उसी दिन उप-संवर्धन से पहले कम से कम 4 घंटे के लिए लेपित किया जा सकता है।
  7. कोलेजन IV और फाइब्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों या झिल्ली सम्मिलित (दिन 8) पर विभेदित कोशिकाओं को उप-संवर्धन करके बीईसी को शुद्ध करें।
    1. एस्पिरेट ईसी माध्यम और एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण अभिकर्मक (12 एमएल प्रति टी 75) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि 90% कोशिकाएं फ्लास्क से अलग न हो जाएं।
      नोट: सेल पृथक्करण में 1 घंटे तक का समय लग सकता है।
    2. इनक्यूबेशन समय के दौरान, पहले से तैयार प्लेटों / डालने से कोलेजन IV / फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान को हटा दें और उन्हें बाँझ हुड में सूखने दें। इंसर्ट को सूखने में लगभग 20 मिनट लगते हैं।
    3. एक बार जब कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो उन्हें 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क से धो लें। एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
      नोट: एकल सेल निलंबन विश्वसनीय सेल गिनती के लिए और ठोस मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ताजा एचईएसएफएम की कम से कम बराबर मात्रा के साथ पतला करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    5. 10 मिनट के लिए 1,500 x g पर कोशिकाओं को गोली दें।
    6. झिल्ली डालने पर बीज बोने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के निलंबन को प्राप्त करने के लिए ताजा तैयार ईसी + बीएफजीएफ + आरए की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। 12-वेल इंसर्ट के शीर्ष पर 500 μL (1 x 106 सेल) और नीचे ईसी + bFGF + RA माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। 24 और 48-वेल प्लेटों पर बोने के लिए, सेल सस्पेंशन 1: 2 को पतला करें और क्रमशः प्रति कुएं 500 μL (5 x 10 5 सेल) और 250 μL (2.5 x 105 सेल) जोड़ें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से वितरित करें / डालें (चरण 2.2.4 देखें) और 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. बीएफजीएफ या आरए के बिना प्लेटों / ट्रांसवेल पर मीडिया को ईसी में बदलें (दिन 9)।
  9. निम्नलिखित खंडों (दिन 10) में वर्णित संक्रमण प्रयोगों, टीईआर माप और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का संचालन करें।
    नोट: सफलतापूर्वक विभेदित और शुद्ध बीईसी आमतौर पर 10 वें दिन चरम टीईआर तक पहुंचते हैं और मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे पीईसीएएम -1 (सीडी 31) और वीई-कैडरिन, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर ग्लूट -1, पी-ग्लाइकोप्रोटीन जैसे एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स, और तंग जंक्शन घटक जेडओ -1, ऑक्लुडिन और क्लॉडिन -5 13,14,16,17,19,22 के विशिष्ट मार्करों को व्यक्त करते हैं।. विभेदन प्रक्रिया 13,14,15,16,17,19,22 के दौरान सेल प्रकार, आकृति विज्ञान और सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के अधिक विवरण और छवियों के लिए लिपमैन एट अल, स्टेबिन्स एट अल और अन्य को देखें। बीईसी भेदभाव प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में आईएमआर 90-4 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां पूरक चित्र 1 में पाई जा सकती हैं।

4. बाधा जकड़न के उपाय के रूप में ट्रांसेंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईआर)

नोट: टीईआर आमतौर पर आईपीएससी-बीईसी बनाने वाली बाधा की सफल पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए विभेदन के दिन 9 और 10 पर झिल्ली सम्मिलित पर पढ़ा जाता है (चित्रा 1 ए)।

  1. उपकला वोल्ट-ओम मीटर (ईवीओएम) को जैव सुरक्षा हुड के बाँझ वातावरण में रखें और इलेक्ट्रोड को ईवीओएम से कनेक्ट करें।
  2. इलेक्ट्रोड को कम से कम 5 मिनट के लिए 70% ईटीओएच में डुबोकर कीटाणुरहित करें और इसे पूरी तरह से सूखने दें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो 70% ईटीओएच में लंबे समय तक इनक्यूबेशन या 5% हाइपोक्लोराइट समाधान का उपयोग करके इलेक्ट्रोड का परिशोधन संभव है।
  3. इनक्यूबेटर से झिल्ली डालने पर आईपीएससी-बीईसी को पुनः प्राप्त करें और टीईआर को मापें।
    नोट: इनक्यूबेटर से हटाने के बाद टीईआर को तेजी से पढ़ना महत्वपूर्ण है क्योंकि तापमान परिवर्तन टीईआर माप को प्रभावित कर सकता है।
  4. इलेक्ट्रोड को माध्यम में डुबोकर टीईआर पढ़ें ताकि छोटे इलेक्ट्रोड को डालने के शीर्ष पर रखा जाए और लंबा इलेक्ट्रोड सम्मिलित के आसपास के माध्यम में पहुंच जाए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि "चॉपस्टिक्स" की युक्तियों पर इलेक्ट्रोड पूरी तरह से तरल द्वारा कवर किए गए हैं। यदि आवश्यक हो, तो मापने के लिए प्लेट को फिर से सेट करने से पहले इसे प्राप्त करने के लिए कुएं को झुकाएं।

5. बीईसी फेनोटाइप को मान्य करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला होना।

नोट: पूरी तरह से विभेदित और शुद्ध कोशिकाओं की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए, आईपीएससी-बीईसी मोनोलेयर को विभेदन प्रक्रिया के 10 वें दिन मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के विशिष्ट मार्करों के लिए दाग दिया जाता है जैसा कि पहले वर्णित है (चित्रा 1 बी-जी) 13,14,15,16,17,19,22।

  1. माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ 1 x धो लें।
  2. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बर्फ ठंडे मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 3x धोएं और 1 घंटे के लिए आरटी पर पीबीएस में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ ब्लॉक करें।
  4. एस्पिरेट करें और ब्लॉकिंग समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीबॉडी22 के स्रोत और कमजोर पड़ने से संबंधित जानकारी के लिए सामग्री और स्टेबिन्स एट अल की तालिका देखें।
  5. ब्लॉकिंग समाधान में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ 3x धोएं। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। इस बिंदु से प्रकाश से नमूने की रक्षा करें।
  6. पीबीएस के साथ 2x धो लें। फिर, पीबीएस में 1: 5,000 कमजोर पड़ने पर DAPI जोड़ें और 15 मिनट के लिए RT पर दाग दें।
  7. पीबीएस को छोड़कर 1x धोएं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्र लें।

6. आईपीएससी-बीईसी के बैक्टीरिया और संक्रमण की तैयारी

  1. संक्रमण प्रयोग से पहले दिन (भेदभाव के दिन 9 ), जमे हुए स्टॉक से बैक्टीरिया की रातोंरात संस्कृति शुरू करें। एनएम के संक्रमण के लिए, 5% भेड़ के रक्त (रक्त-आगर) के साथ कोलंबिया एगर पर स्ट्रीक बैक्टीरिया। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रात भर बैक्टीरिया संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन (दिन 10), प्रोटीज पेप्टोन मीडिया (पीपीएम) को 2 एम एमजीसीएल 2 के 50 μL,2 M NaHCO3 के 50 μL, और 100 μL केलॉग के पूरक प्रति 10 एमएल के साथ पूरक करके ताजा पीपीएम + तैयार करें। बाँझ कपास के फाहे का उपयोग करके रात भर कल्चर प्लेट से एनएम के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर पीपीएम + माध्यम को टीका लगाएं। 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर झटकों को इनक्यूबेट करें (यानी, जब तक बैक्टीरिया लघुगणकीय विकास चरण में न हों)।
  3. बैक्टीरियल इनक्यूबेशन के दौरान, आईपीएससी-बीईसी को 24-वेल प्लेट में या झिल्ली डालने के लिए पुराने माध्यम को 400 μL ताजा ईसी माध्यम (बीएफजीएफ या आरए के बिना) के साथ बदलकर संक्रमण के लिए तैयार करें।
  4. 10 मिनट के लिए 4000 x g पर सेंट्रीफ्यूज बैक्टीरियल कल्चर करें और मीडिया को एस्पिरेट करें। पीबीएस के 250 μL में बैक्टीरियल गोली को पुन: निलंबित करें।
  5. ताजा पीबीएस के 4 एमएल में, बैक्टीरियल सेल सस्पेंशन के एक हिस्से का उपयोग करें और 0.4 के ओडी600 (लगभग 1 x 108 सीएफयू / एमएल) में समायोजित करें।
  6. फिर, संक्रमण की वांछित बहुलता (एमओआई) के अनुसार सेल कल्चर माध्यम (ईसी माध्यम) में बैक्टीरिया को पतला करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, 10 के एमओआई के लिए, 24-वेल प्लेट में या झिल्ली डालने पर आईपीएससी-बीईसी को संक्रमित करते समय क्रमशः 1: 10 या 1: 5 को पतला करें (24-वेल प्लेट में प्रति मोनोलेयर 1 x 105 कोशिकाएं)। संक्रमण के लिए एनएम की तैयारी में मानव सीरम को शामिल नहीं किया गया है जैसा कि अन्य पांडुलिपियों में वर्णित किया गया था क्योंकि यह टीईआर (डेटा नहीं दिखाया गया) 30,31 द्वारा मापा गया आईपीएससी-बीईसी बैरियर फेनोटाइप पर हानिकारक प्रभाव डालता है। हालांकि, एनएम और आईपीएससी-बीईसी की बातचीत मानव सीरम (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ या उसके बिना अप्रभावित है।
  7. प्रत्येक कुएं में आईपीएससी-बीईसी को तैयार बैक्टीरिया निलंबन के 100 μL के साथ संक्रमित करें और संक्रमण के वांछित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एनएम से संक्रमित होने पर आईपीएससी-बीईसी में कई प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स और केमोकाइन ्स की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, संक्रमण के 8 घंटे के बाद सबसे प्रमुख रूप से जैसा कि पहले मार्टिंस-गोम्स एट अल (चित्रा 2)19 द्वारा वर्णित किया गया था।

7. मात्रात्मक पीसीआर द्वारा जन्मजात प्रतिरक्षा सक्रियण।

नोट: एक पसंदीदा आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण और क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके, नमूने एकत्र करें और चयनित साइटोकिन्स पर क्यूपीसीआर चलाएं।

  1. 7.1. विभेदन प्रोटोकॉल के 10 वें दिन संक्रमण के बाद बीईसी नमूनों से आरएनए एकत्र करें, अभिकर्मकों का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अलगाव किट ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एक साफ और निष्फल वातावरण में सावधानीपूर्वक काम करके नमूनों के न्यूक्लियस संदूषण से बचें।
    1. लाइसिस बफर तैयार करें और आईपीएससी-बीईसी के प्रत्येक कुएं / मोनोलेयर में 350 μL जोड़ें।
    2. कई बार (जैसे, 20x) ऊपर और नीचे पाइप करके नमूने एकत्र करें और निलंबन को बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: आरएनए अलगाव के लिए तैयार होने तक नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    3. सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतक से आरएनए शुद्धिकरण के लिए आरएनए अलगाव किट के साथ प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करें।
    4. न्यूक्लियस-मुक्त पानी में क्षालन के बाद, किसी भी संभावित आरएनएस गतिविधि को कम करने के लिए बर्फ पर आरएनए नमूने रखें।
    5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, नैनोड्रॉप) पर आरएनए सांद्रता का अनुमान लगाएं।
  2. सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके एकत्र आरएनए से एक सीडीएनए लाइब्रेरी उत्पन्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स, नमूना आरएनए के कम से कम 200 एनजी (आदर्श रूप से 500 एनजी) और सीडीएनए संश्लेषण किट के प्रोटोकॉल में वर्णित परिभाषित कुल प्रतिक्रिया मात्रा में न्यूक्लियस-मुक्त पानी से युक्त प्रतिक्रियाओं को सेट करें।
    2. एक मानक थर्मो साइकलर पर, एक प्रोग्राम चलाएं जो उपयोग किए गए सीडीएनए संश्लेषण किट के अभिकर्मकों के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए: 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
    3. संश्लेषण के बाद, न्यूक्लियस-मुक्त पानी में सीडीएनए को 1:10 तक पतला करें और नमूने को अल्पकालिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस तक ले जाएं।
      नोट: यदि आरएनए एकाग्रता कम थी (उदाहरण के लिए, 50 एनजी से नीचे) तो कम कमजोर पड़ना आवश्यक हो सकता है। पतला सीडीएनए को एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किए गए और मान्य प्राइमरों के साथ साइटोकिन्स और केमोकाइन जैसे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीन के प्रतिलेख को लक्षित करने वाले सीडीएनए नमूनों पर क्यूपीसीआर करें।
    नोट: चूंकि क्यूपीसीआर परिणामों की गुणवत्ता के लिए प्राइमर डिजाइन बहुत महत्वपूर्ण है, प्राइमर दक्षता को एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का संचालन करके परीक्षण किया जाना चाहिए और डीएनए जेल पर कई उत्पादों की अनुपस्थिति की पुष्टि की जानी चाहिए।
    1. प्रति 25 μL प्रतिक्रिया, 0.5 μL आगे और 0.5 μL रिवर्स प्राइमर (न्यूक्लियस-मुक्त पानी में 10 mM), 1 μL cDNA, 10.5 μL न्यूक्लियस मुक्त H2O, और 12.5 μL QPCR मास्टर मिश्रण का उपयोग करें।
    2. निम्नलिखित साइकलर प्रोटोकॉल का उपयोग करके क्यूपीसीआर मशीन पर प्रतिक्रिया करें: (ए) 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस; (बी) 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; (ग) 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; (डी) 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; (c) और (d) के माध्यम से 45 बार चक्र; (ई) वैकल्पिक पिघल वक्र: 1 डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि में 30-99 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस।
    3. डेटा विश्लेषण के लिए, साइटोकिन और केमोकाइन अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना 18 एस या जीएपीडीएच जैसे संदर्भ हाउसकीपिंग जीन से करने के लिए त्रिभुज सीटी गणना का उपयोग करें।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्टेबिन्स एट अल से अनुकूलित है और आईपीएससी को मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं में अलग करने की प्रक्रिया पर प्रकाश डालता है जिनके पास बीबीबी गुण होते हैं, और एनएम19,22 के साथ आईपीएससी-बीईसी का उपयोग करके संक्रमण अध्ययन के लिए इस मॉडल का उपयोग कैसे करें। आईपीएससी-बीईसी, जब ठीक से विभेदित होते हैं, तो टीईआर द्वारा मापा गया तंग अवरोध गुण प्रदर्शित करते हैं जो अक्सर 2000 Ω.सेमी2 से अधिक होते हैं, और वीई-कैडरिन और सीडी 31 (पीईसीएएम) जैसे एंडोथेलियल मार्करों को व्यक्त करते हैं (चित्रा 1ए -सी)। इसके अतिरिक्त, वे तंग जंक्शन मार्कर क्लाउडिन -5, ऑक्लुडिन और जेडओ -1 (चित्रा 1 डी -एफ) और ट्रांसपोर्टरों जैसे ग्लूट -1 (चित्रा 1 जी) को व्यक्त और स्थानीयकृत करते हैं। एनएम के साथ संक्रमण पर, आईपीएससी-बीईसी न्यूट्रोफिलिक प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स के अपरेग्यूलेशन के माध्यम से संक्रमण का जवाब देते हैं, जैसा कि आईएल -8 (आईएल 8), आईएल 1, आईएल 2, सीसीएल 20 और आईएल 6 (चित्रा 2ए -ई) जैसे क्यूपीसीआर द्वारा मापा जाता है। ये प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि यह कैसे सुनिश्चित किया जाए कि आईपीएससी-बीईसी को मज़बूती से विभेदित किया जा रहा है, और एनएम संक्रमण के लिए आईपीएससी-बीईसी की प्रतिक्रिया की जांच कैसे करें।

Figure 1
चित्र 1: आईपीएससी-बीईसी का लक्षण वर्णन। (ए) दो अलग-अलग, व्यक्तिगत भेदभावों का टीईआर, 9-12 दिनों में पढ़ा जाता है। डेटा को तीन प्रतियों के माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ±(बी-जी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा जो एंडोथेलियल सेल मार्कर वीई-कैडरिन (बी) और पीईसीएएम -1 (सीडी 31) की अभिव्यक्ति को दर्शाता है; सी), तंग जंक्शन घटक क्लॉडिन -5 (डी), ऑक्लुडिन (ई), और जेडओ -1 (एफ), और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर ग्लूट -1 (जी)। स्केल बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े के पैनल बी-जी का उपयोग किम एट अल की अनुमति से किया गया है, जो मूल रूप से बीएमसी पत्रिका17 के तरल पदार्थ और अवरोध में प्रकाशित हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नीसेरिया मेनिन्जाइटिस के संक्रमण पर आईपीएससी-बीईसी द्वारा साइटोकिन्स का अपरेग्यूलेशन। प्रतिनिधि क्यूपीसीआर डेटा संक्रमण के 8 घंटे के बाद संक्रमित आईपीएससी-बीईसी मोनोलेयर के साथ संक्रमित की तुलना करते हुए संक्रमण के 8 घंटे के बाद सी8 (ए), पीएम1 (बी), सी2 (सी), सीसीएल 20 (डी), और आईएल 6 (ई) प्रतिलेख की सापेक्ष अभिव्यक्ति को दर्शाता है। डेटा को तीन प्रतियों में आयोजित तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत के रूप में प्रस्तुत किया गया। त्रुटि पट्टियाँ महत्व निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसडी छात्र के टी-टेस्ट ± प्रतिनिधित्व करती हैं। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001. इस आंकड़े को मार्टिन्स गोम्स एट अल की अनुमति से संशोधित और उपयोग किया गया है, जो मूल रूप से फ्रंटियर्स इन माइक्रोबायोलॉजी19 में प्रकाशित हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: बीईसी भेदभाव प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में आईएमआर 90-4 कोशिकाएं। बीईसी विभेदन प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में रखरखाव आईएमआर 90-4 संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां (ए) और कोशिकाओं को पारित करने के लिए तैयार हैं: (बी) रॉक अवरोधक (दिन -2) के साथ सीडिंग के बाद, (सी) विभेदन की शुरुआत में (दिन 0), (डी) संगम का पहला दिन (दिन 3), (ई) यूएम चरण का अंत (दिन 6), (एफ) बीईसी शुद्धिकरण से पहले (दिन 8), और (जी और एच) बीईसी शुद्धिकरण (दिन 9 और दिन 10) के बाद। स्केल पट्टी 500 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बीईसी और बीबीबी मॉडलिंग में चुनौतियां हैं, क्योंकि प्राथमिक और अमर मानव बीईसी, इन विट्रो में, मजबूत बाधा फेनोटाइप की कमी होती है। मानव स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों के आगमन ने आईपीएससी व्युत्पन्न बीईसी जैसी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है जो एंडोथेलियल मार्कर, तंग जंक्शन अभिव्यक्ति, बाधा गुण, अन्य सीएनएस सेल प्रकारों की प्रतिक्रिया और कार्यात्मक एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स 12,13,14,15,22, 24, 25 जैसे अपेक्षित हॉलमार्क बीबीबी फेनोटाइप को बनाए रखते हैं। इसने शोधकर्ताओं को इन विट्रो में बीईसी का उपयोग करने में सक्षम बनाया है जो विवो बीईसी में बारीकी से नकल करते हैं और बीबीबी डिसफंक्शन 16,17,19,20,21,32 के साथ विभिन्न बीमारियों का मॉडल करते हैं। एनएम बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस का एक प्रमुख कारण है और एक मानव विशिष्ट रोगज़नक़ है जिसमें विवो मॉडल19 में मजबूत की कमी है। इस सीमा ने एनएम और बीबीबी के बीच नोवेल होस्ट-पैथोजन इंटरैक्शन की खोज को चलाने के लिए बेहतर इंजीनियर मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है। हाल ही में, हमने प्रदर्शित किया है कि आईपीएससी-बीईसी एनएम-बीईसी इंटरैक्शन19 से पूछताछ करने के लिए एक व्यवहार्य मॉडल हैं।

यहां हम आईपीएससी-बीईसी प्राप्त करने और एनएम के साथ संक्रमित करने के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स का अपरेग्यूलेशन होता है जो आमतौर पर जीवाणु संक्रमण19 से प्रेरित होते हैं। आईपीएससी-बीईसी की व्युत्पत्ति के लिए हम आम तौर पर आईपीएससी-बीईसी की पीढ़ी के लिए स्टेबिन्स एट अल में वर्णित प्रोटोकॉल का पालनकरते हैं, मामूली संशोधनों के साथ। विशेष रूप से यहां हम mTesR1 के बजाय StemFlex मीडिया का उपयोग करते हैं, हालांकि या तो मीडिया का उपयोग स्टेम सेल संस्कृति17 के रखरखाव के लिए किया जा सकता है। यह स्थापित किया गया है कि यह प्रोटोकॉल कई आईपीएससी लाइनों के साथ अच्छी तरह से काम करता है, हालांकि यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक व्यक्तिगत आईपीएससी लाइन15, 24 के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व निर्धारित किया जाए। इस पांडुलिपि के लिए हमने आईएमआर 90-4 सेल लाइन का उपयोग किया और यह पहले स्थापित किया गया था कि 1 x 105 सेल / सेमी2 इष्टतम प्रारंभिक सीडिंग घनत्व24 था। अंत में उत्पन्न बीईसी की पहचान के प्रदर्शन के रूप में, आईपीएससी-बीईसी उच्च टीईआर (चित्रा 1) 13,14,15,24 का प्रदर्शन करते हुए अपेक्षित एंडोथेलियल सेल मार्कर और तंग जंक्शनों को व्यक्त करते हैं। ये फेनोटाइप, साथ ही मानव मूल के होने के नाते, आईपीएससी-बीईसी को एनएम-बीईसी इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं।

संक्रमण के लिए एनएम की तैयारी को पहले प्रकाशित विधियों19,33 से अनुकूलित किया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बैक्टीरिया के विकास मीडिया को सेल कल्चर प्रयोगों में पेश नहीं किया गया था, पीबीएस में एक धोने का कदम और पुन: निलंबन विधियों में वर्णित के रूप में आयोजित किया गया था। अंत में, 10 के एमओआई को पहले प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स19 के अपरेगुलेशन के माध्यम से आईपीएससी-बीईसी के सक्रियण के परिणामस्वरूप देखा गया था। विभिन्न जीवाणुओं के जवाब में बीईसी की सक्रियता देखी गई है, अर्थात् न्यूट्रोफिलिक केमोकाइन्स और साइटोकिन्स6 के अपरेग्यूलेशन के माध्यम से। पहले यह देखा गया है कि आईपीएससी-बीईसी ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस और एनएम16,19 के संक्रमण के बाद शक्तिशाली न्यूट्रोफिल केमोअट्रैक्टेंट्स आईएल -8, आईएल 1, और आईएल 2 को विनियमित करते हैं। आईपीएससी-बीईसी की यह देखी गई प्रतिक्रिया दर्शाती है कि ये कोशिकाएं बैक्टीरिया का पता लगाने और एक जन्मजात प्रतिरक्षा कार्यक्रम को सक्रिय करने में सक्षम हैं जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिन्स का उत्थान होता है। क्यूपीसीआर द्वारा इन साइटोकिन्स के अपरेग्यूलेशन का पता लगाने के तरीके अच्छी तरह से स्थापित हैं और संक्षेप में ऊपर वर्णित हैं। हालांकि दिलचस्प बात यह है कि जब इन प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का पता क्यूपीसीआर द्वारा लगाया जाता है, तो समन्वय प्रोटीन उत्पाद या तो अज्ञात होते हैं या बहुत कम16,19 होते हैं। वर्तमान में, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या यह आईपीएससी-बीईसी मॉडल की एक कलाकृति है, या यदि साइटोकिन्स की कम बहुतायत जैविक रूप से प्रासंगिक है। अभिव्यक्ति और स्राव के बीच डिस्कनेक्ट के पीछे एक तंत्र निर्धारित करने के लिए भविष्य के शोध की आवश्यकता होगी।

आईपीएससी-बीईसी मॉडल की एक बड़ी ताकत तंग जंक्शनों की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण है जो टीईआर 12,13,14,15,22 के रूप में बाधा कार्य में योगदान करते हैं। स्ट्रेप्टोकोकस अगालैक्टिया (ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस, जीबीएस) के साथ पिछले काम से पता चला है कि स्नेल 1 का अपरेग्यूलेशन विट्रो और विवो34 में बीबीबी तंग जंक्शनों के विनाश में योगदान देता है। हाल ही में, इस खोज की पुष्टि आईपीएससी-बीईसी मॉडल में जीबीएस और एनएम दोनों के साथ की गई थी, जो एक तंत्र का सुझाव देते हैं कि बैक्टीरिया संक्रमण16,19 के दौरान बीबीबी अखंडता को बाधित करने में कैसे सक्षम हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया था कि एनएम एंडोथेलियल कोशिकाओं पर सीडी 147 के साथ बातचीत करता है जो बैक्टीरिया लगाव को बढ़ावा देता है, और अंततः तंग जंक्शनों का पुनर्गठन होता है जिससे बाधा शिथिलता9 होती है। हमने दिखाया है कि आईपीएससी-बीईसी में सीडी 147 के साथ एनएम कोलोकलाइज संभावित रूप से इस मॉडल को एनएम-सीडी 147 इंटरैक्शन के भविष्य के स्पष्टीकरण के लिए आदर्श बनाता है क्योंकि वे बीबीबी डिसफंक्शन19 से संबंधित हैं।

यहां प्रस्तुत विधि एक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल स्रोत से आईपीएससी-बीईसी के भेदभाव और एनएम संक्रमण के साथ आवेदन को प्रदर्शित करती है। आईपीएससी-बीईसी मानव मूल के हैं, एंडोथेलियल मार्करों को व्यक्त करते हैं, और बीबीबी विशिष्ट फेनोटाइप ्स रखते हैं जो उन्हें एनएम जैसे मानव विशिष्ट रोगजनकों की परीक्षा के लिए एक आदर्श मॉडल बनाते हैं। अंत में, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम हैं कि आईपीएससी-बीईसी मॉडल एक न्यूट्रोफिलिक साइटोकिन प्रतिक्रिया के अपरेग्यूलेशन के माध्यम से जीवाणु संक्रमण का जवाब देता है। एक साथ लिया गया, आईपीएससी-बीईसी मॉडल में बीबीबी में मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की जांच करने के लिए प्राथमिक और अमर मॉडल सिस्टम पर कुछ फायदे हैं। आगे के काम का उद्देश्य बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के दौरान बीबीबी विनाश के तंत्र को स्पष्ट करना होना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एलएमई डीएफजी अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित है, GRK2157 जिसका शीर्षक है "मानव रोगजनकों द्वारा माइक्रोबियल संक्रमण का अध्ययन करने के लिए 3 डी ऊतक मॉडल" शीर्षक है। बीजेके को अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन द्वारा पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया है। इसके अतिरिक्त, हम संस्कृति में आईपीएससी-बीईसी की पीढ़ी में अपनी तकनीकी सहायता के लिए लीना वोल्टर को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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References

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Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>निसेरिया मेनिनजाइटिस</em> प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल व्युत्पन्न मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं का संक्रमण
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Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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