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Immunology and Infection

Neisseria meningitidis 유도만능줄기세포 유래 뇌내피세포의 감염

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

여기에 설명된 프로토콜은 유도만능줄기세포 유래 뇌유사 내피세포의 분화, 감염을 위한 Neisseria meningitidis 준비 및 기타 분자 분석을 위한 샘플 수집의 주요 단계를 강조합니다.

Abstract

수막구균성 뇌수막염은 나이세리아 수막염(Neisseria meningitidis , 수막구균, Nm)이 고도로 전문화된 뇌 내피 세포(BEC)에 침투하여 중추신경계(CNS)에 접근할 수 있을 때 발생하는 생명을 위협하는 감염입니다. Nm은 인간 특이적 병원체이기 때문에 강력한 in vivo 모델 시스템이 없기 때문에 Nm과 BEC 간의 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구가 어려워지고 네이티브 BEC를 모방하는 인간 기반 모델이 필요합니다. BEC는 복잡한 밀착 접합부와 높은 경내피 전기 저항(TEER)을 특징으로 하는 말초 내피 세포와 비교할 때 더 단단한 장벽 특성을 가지고 있습니다. 그러나 1차 BEC 및 불멸화된 BEC와 같은 많은 in vitro 모델은 기본 신경 미세환경에서 제거된 후 장벽 특성이 부족하거나 빠르게 손실됩니다. 최근 인간 줄기세포 기술의 발전으로 유도만능줄기세포(iPSC)에서 뇌와 유사한 내피세포를 유도하는 방법이 개발되어 다른 체외 인간 모델과 비교할 때 BEC를 더 잘 표현할 수 있습니다. Nm-BEC 상호작용을 모델링하기 위해 iPSC 유래 BEC(iPSC-BEC)를 사용하면 BEC 장벽 특성을 가진 인간 세포를 사용할 수 있다는 이점이 있으며, 장벽 파괴, 선천성 면역 활성화 및 박테리아 상호작용을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 분석을 위한 박테리아 준비, 감염 및 샘플 수집 외에도 iPSC에서 iPSC-BEC를 도출하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

혈액-뇌 장벽(BBB)과 수막 혈액-CSF 장벽(mBCSFB)은 중추신경계(CNS)에서 순환을 분리하는 매우 단단한 세포 장벽이며 주로 고도로 전문화된 뇌 내피 세포(BEC)로 구성되어 있습니다1,2. BEC는 뇌 안팎의 영양소와 노폐물을 조절하고 많은 독소, 약물 및 병원균을 배제하여 적절한 뇌 항상성을 유지합니다 1,2. 세균성 뇌수막염은 혈액 매개 박테리아가 BEC에 의해 형성된 장벽과 상호 작용하고 이를 뚫고 들어가 염증을 일으킬 때 발생합니다. Neisseria meningitidis(Nm, 수막구균)는 건강한 사람의 10-10%의 비염을 집락화하는 그람 음성 박테리아이지만 경우에 따라 심각한 전신 질환을 유발할 수 있습니다3. 영향을 받은 개인에서 Nm은 자반증을 유발할 수 있는 혈류에 접근할 수 있을 뿐만 아니라 BEC를 관통하여 뇌수막염을 유발하는 중추신경계에 접근할 수 있다3. Nm은 전 세계적으로 세균성 뇌수막염의 주요 원인이며, 백신 접종 노력에도 불구하고 여전히 뇌수막염의 주요 원인이다4. 항생제 치료와 같은 현대 의학적 개입으로 이러한 질환은 생존할 수 있게 되었지만, 뇌수막염에 걸린 사람들은 종종 영구적인 신경학적 손상을 입게 된다 5,6.

이전 연구에서는 Nm-BEC 상호 작용에 기여하는 박테리아 요인 및 숙주 신호 전달을 확인했습니다 7,8,9,10,11. CD147과 같은 수용체뿐만 아니라 불투명도 단백질 Opc 및 type-IV pili와 같은 확인된 부착 및 침습은 다양한 BEC 모델에서 시험관 내에서 수행되었지만 이러한 모델에는 BBB 특성을 정의하는 많은 것이 부족합니다 7,9,11,12. Nm-BEC 상호 작용에 대한 완전한 이해는 부분적으로 in vivo 모델을 활용할 수 없고, 불완전한 백신 보호 및 in vitro에서 강력한 인간 BEC 모델의 부족으로 인해 여전히 어렵습니다.

시험관 내 hBEC를 모델링하는 것은 BEC의 고유한 특성으로 인해 어려운 일이었습니다. 말초 내피 세포와 비교하여, BEC는 복잡한 밀착 접합부로 인한 높은 경내피 전기 저항(trans-endothelial electrical resistance, TEER)과 같은 장벽 특성을 강화하는 다수의 표현형을 가지고 있다12. 일단 뇌 미세환경으로부터 제거되면, BEC는 그들의 장벽 특성을 빠르게 상실하여 약한 장벽만을 형성하는 1차 또는 불멸화된 시험관 내 모델의 유용성을 제한한다12,13. Nm 감염의 인체 특이성, 강력한 in vivo 모델의 부족, in vitro에서 인간 BEC를 모델링하는 데 어려움이 결합되어 Nm과 BEC 간의 복잡한 숙주-병원체 상호 작용을 이해하기 위한 더 나은 모델이 필요합니다. 최근에는 모델 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 기술을 사용하여 생체 내 BEC를 더 잘 모방하는 iPSC로부터 BEC 유사 세포를 유도했습니다 12,13,14,15. iPSC-BEC는 인간에서 유래하고, 쉽게 확장할 수 있으며, 1차 또는 불멸 표현형에 비해 예상되는 BEC 표현형을 가지고 있습니다12,13,14,15. 또한, iPSC-BEC가 숙주-병원체 상호작용, 헌팅턴병, 앨런-허른던-더들리 증후군을 유발하는 MCT8 결핍과 같은 중추신경계의 다양한 질병을 모델링하는 데 유용하다는 것을 입증했습니다 16,17,18,19,20,21. 여기서는 재생 가능한 iPSC 공급원에서 iPSC-BEC를 유도하는 방법과 Nm에 의한 iPSC-BEC의 감염이 선천성 면역 반응의 활성화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이 모델이 다른 in vitro 모델에서 재현할 수 없는 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 데 유용하며 Nm과 같은 인간 특이적 병원체와의 상호작용을 검사할 때 특히 유용하다고 믿습니다.

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Protocol

참고: 모든 배지/시약 준비, 줄기 세포 유지 및 분화 단계는 Stebbins et al.22에서 채택되었습니다.

1. iPSC 배양 및 BEC 분화에 필요한 물질 준비.

  1. IMR90-4 iPSC 배양을 위한 조직 배양(TC) 플라스틱의 매트릭스 코팅
    1. 기저막 매트릭스 겔(예: Matrigel)을 2.5mg 분취액으로 추출하고 -20°C에서 보관합니다.
      알림: 매트릭스 겔과 부분 표본을 얼음 위에서 취급할 때는 4°C 이상의 겔을 형성하고 일단 응고되면 분취할 수 없으므로 신속하게 작업하십시오.
    2. TC 플라스틱을 코팅하려면 50mL 원뿔형 튜브에 있는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12 배지 30mL에 매트릭스 겔 부분 표본 1개를 빠르게 추가합니다. 1mL의 배지를 냉동 매트릭스 겔에 추가하고 해동될 때까지 위아래로 피펫팅한 다음 나머지 배지와 함께 50mL 코니컬 튜브로 즉시 옮깁니다.
    3. 6웰 플레이트의 웰당 1mL의 이 매트릭스 겔 코팅 용액을 사용하고 T75 플라스크당 12mL를 사용합니다.
      알림: 매트릭스 젤 코팅 TC 플라스틱은 사용하기 최대 2주 전에 준비할 수 있습니다. 그러나 매트릭스 겔 용액이 건조되지 않도록 하는 것이 중요하며, 이로 인해 웰 위에 DMEM/F12를 더 추가해야 할 수도 있습니다.
  2. 생물 안전 캐비닛의 멸균 환경에서 50배 보충제 50mL를 줄기 세포 유지 기초 배지 450mL에 추가하여 줄기 세포 유지 배지를 준비합니다.
    참고: 다른 줄기세포 유지 배지(mTeSR 및 E8)는 다른 연구에서 사용되었다 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. 500mL의 무조건 배지(UM)를 준비하려면 DMEM/F12 392.5mL와 녹아웃 혈청 치환(KOSR) 100mL, 비필수 아미노산 5mL, 최종 농도 1mM의 L-글루타민 및 β-메르캅토에탄올 3.5μL를 결합합니다. 필터 멸균 후 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
  4. 200mL의 내피 세포(EC) 배지와 레티노산(RA)과 bFGF를 준비하려면 198mL의 인간 내피 혈청 무함유 배지(hESFM), 2mL의 필터 멸균 혈소판 부족 유래 혈청(PDS) 및 20ng/mL bFGF를 결합합니다. 필터를 멸균하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 세포에 첨가하기 직전에 10μM의 RA를 EC 배지에 첨가합니다.
    알림: PDS가 중단되어 제한될 수 있으므로 이 프로토콜은 PDS 27 대신B15,23,26을 사용하여 성공적으로 수행되었습니다.
  5. RA 또는 bFGF 없이 200mL의 EC 배지를 준비하려면 hESFM 198mL와 필터 멸균 PDS 2mL를 결합하고 필터 멸균합니다. 4 °C에서 최대 4주 동안 보관하십시오.

2. 유지 보수 IMR90-4 세포 배양

참고: 여기서는 IMR90-4 세포주를 예로 들지만, CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR 및 CS03iCTRn2와 같은 다른 유도만능줄기세포주는 BECs 13,14,15,16,17,23,27,28로의 분화를 위해 성공적으로 사용되었습니다.

  1. 5%CO2 에서 37°C에서 iPSC를 배양하고 일반적으로 웰당 2mL의 줄기 세포 유지 배지를 사용하여 다양한 밀도의 6웰 플레이트에 유지합니다.
  2. iPSC 배양을 유지하기 위해 합류하지 않고 군집 사이에 열린 공간이 있는 단일 우물을 선택합니다.
    1. 배양 배지를 흡인하고 1mL의 비효소 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 7분 동안 배양합니다. 배양이 진행되는 동안 새로운 6웰 플레이트의 매트릭스 겔 용액을 웰당 2mL의 신선한 줄기 세포 유지 배지로 교체합니다.
    2. 비효소 세포 해리 시약을 조심스럽게 흡인하고 플레이트에 부착된 세포를 흡인하지 않도록 주의합니다.
    3. 줄기 세포 유지 배지 6mL를 넣고 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 웰 바닥을 몇 번 헹굽니다. 그런 다음 일반적인 유지 관리를 위해 일반적으로 1:6 또는 1:12의 다양한 밀도로 새 6웰 플레이트를 시드합니다.
      알림: 앞서 언급한 비율을 사용하여 셀은 일주일에 약 두 번 분할됩니다.
    4. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 플레이트를 앞뒤로 왼쪽에서 오른쪽으로 흔들면서 배지가 가라앉을 때까지 번갈아 흔들면서 잠시 멈춰 서서 파종된 세포를 웰 전체에 균등하게 분배합니다.

3. 인간 iPSC와 뇌 내피 세포의 분화

  1. 분화를 위한 iPSC 도금(분화 프로토콜의 -3일차 )
    1. 분화를 위해 도금하는 데 사용되는 IMR90-4 유지 배양 웰에 따라 배양 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 효소 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 7분 동안 배양합니다.
    2. 1mL의 해리된 세포 현탁액을 세포 1mL당 최소 2mL의 신선한 줄기 세포 유지 배지가 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮겨 효소 세포 해리 시약을 비활성화합니다. 셀 현탁액을 1,500 x g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
    3. 사용된 IMR90-4 세포의 웰당 줄기 세포 유지 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
      알림: 계수할 때 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 1% 트리판 블루로 0.4:0.4로 희석하는 것이 도움이 될 수 있습니다. iPSC의 밀도에 따라 6웰 플레이트의 웰 1개는 일반적으로 1\u20122 x 106 세포를 생성합니다.
    4. T75 플라스크에서 분화하려면 7.5 x 105 세포를 12mL의 줄기 세포 유지 배지와 ROCK 억제제(Y27632 디하이드로클로라이드)를 최종 농도 10μM로 추가합니다. T75 플라스크에서 매트릭스 겔 코팅 용액을 흡입하고 세포 현탁액을 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 앞뒤로 흔들어 세포를 균등하게 분포시키고(2.2.4단계 참조) 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
      참고: 해리된 단일 줄기 세포25,29의 생존을 향상시키기 위해 이 단계에서 ROCK 억제제를 추가하는 것이 중요합니다. 세포는 플라스크 전체에 걸쳐 고르게 분포되어야 하며, ROCK 억제제 처리로 인해 확산된 중간엽 유사 형태를 나타내는 단일항에서 분포되어야 한다22.
  2. -2일째와 -1일째에 배지를 신선한 줄기세포 유지 배지로 변경합니다. T75당 12mL.
  3. 0일째에 미디어를 UM으로 변경하여 미분을 시작합니다. T75당 12mL.
  4. UM을 매일 변경합니다(1일차 – 5일차).
    참고: 세포는 일반적으로 UM에서 2-3일 후에 합류에 도달하며, 육안 또는 도립 명시야 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다. 분화가 진행됨에 따라, nestin+ "신경관"은 앞서 설명한 바와 같이 PECAM-1+ 세포와 함께 가시화된다13,14.
  5. 20ng/mL bFGF 및 10μM 레티노산(RA)이 포함된 EC 배지로 전환하고(6일차) 2일 동안 배양하여 내피 세포 집단을 선택적으로 확장합니다. bFGF가 함유된 EC 배지는 최대 2주 전에 준비할 수 있습니다. RA는 사용 당일에 냉동 스톡으로부터 첨가됩니다(예: EC + bFGF 1mL당 10mM RA 스톡 1μL).
    참고: 성공적인 분화는 6일과 8일에 RA를 보충하지 않고도 달성할 수 있습니다. 그러나 RA를 생략하면 TEER12,13,14가 감소한 BEC가 생성됩니다.
  6. BEC 정제 및 후속 실험을 위해 세포 배양 플레이트와 멤브레인 삽입물(예: Transwell)을 콜라겐 IV 및 피브로넥틴(7일)으로 코팅합니다.
    1. 멤브레인 인서트 코팅의 경우 콜라겐 IV 4부(0.5mg/mL 아세트산에 1mg/mL), 피브로넥틴 1부(1mg/mL) 및 멸균 조직 등급 물 5부를 혼합합니다. ECM 용액은 세포 배양 플레이트를 코팅하기 위해 1:5로 희석할 수 있습니다(즉, 콜라겐 IV 4부, 피브로넥틴 1부, 물 45부). 코팅 용액으로 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 플레이트와 멤브레인 인서트는 정제 단계의 당일에 하위 배양하기 전에 최소 4시간 동안 코팅할 수도 있습니다.
  7. 콜라겐 IV 및 피브로넥틴 코팅 플레이트 또는 멤브레인 삽입물에서 분화된 세포를 과배양하여 BEC를 정제합니다(8일차).
    1. EC 배지를 흡입하고 효소 세포 해리 시약(T75당 12mL)을 추가합니다. 세포의 90%가 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다.
      알림: 셀 해리에는 최대 1시간이 소요될 수 있습니다.
    2. 배양 시간 동안 이전에 준비된 플레이트/인서트에서 콜라겐 IV/피브로넥틴 코팅 용액을 제거하고 멸균 후드에서 건조시킵니다. 인서트가 건조되는 데 약 20분이 걸립니다.
    3. 세포가 분리되면 10mL 피펫을 사용하여 플라스크에서 세포를 씻어냅니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
      참고: 단일 세포 현탁액은 신뢰할 수 있는 세포 계수와 고체 단층을 달성하는 데 중요합니다.
    4. 50mL 원뿔형 튜브에 적어도 동일한 부피의 신선한 hESFM으로 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다.
    5. 세포를 1,500 x g에서 10분 동안 펠렛합니다.
    6. 멤브레인 삽입체에 파종하기 위해 2 x 106 cells/mL의 현탁액을 달성하기 위해 새로 준비된 EC + bFGF + RA의 적절한 부피에 세포를 재현탁시킵니다. 12웰 인서트 위에 500μL(1 x 106셀)를 추가하고 하단에 1.5mL의 EC + bFGF + RA 배지를 추가합니다. 24웰 및 48웰 플레이트에 파종하는 경우 셀 현탁액을 1:2로 희석하고 웰당 각각 500μL(5 x 10 5셀) 및 250μL(2.5 x 105셀)를 추가합니다. 웰/삽입물 전체에 세포를 고르게 분포시키고(2.2.4단계 참조) 37°C에서 5%CO2 미만으로 배양합니다.
  8. 플레이트/트랜스웰의 배지를 bFGF 또는 RA 없이 EC로 변경합니다(9일).
  9. 다음 섹션(10일)에 설명된 대로 감염 실험, TEER 측정 및 면역형광 염색을 수행합니다.
    참고: 성공적으로 분화되고 정제된 BEC는 일반적으로 10일째에 최대 TEER에 도달하고 PECAM-1(CD31) 및 VE-cadherin과 같은 뇌 내피 세포, 포도당 수송체 GLUT-1, p-당단백질과 같은 유출 수송체 및 밀착 접합 성분 ZO-1, Occludin 및 Claudin-5 13,14,16,17,19,22의 특징적인 마커를 발현합니다. 분화 과정동안 세포 유형, 형태 및 세포 유형 특이적 마커의 발현에 대한 자세한 내용 및 이미지는 Lippmann et al., Stebbins et al. 및 기타 문헌을 참조하십시오 13,14,15,16,17,19,22. BEC 분화 과정의 여러 단계에서 IMR90-4 세포의 대표 이미지는 보충 그림 1에서 확인할 수 있습니다.

4. 장벽 기밀성의 척도로서의 경내피 전기 저항(TEER)

참고: TEER은 일반적으로 장벽 형성 iPSC-BEC의 성공적인 생성을 확인하기 위해 분화 9일과 10 일에 멤브레인 삽입물에서 판독됩니다(그림 1A).

  1. 상피 전압-옴 측정기(EVOM)를 생물 안전 후드의 멸균 환경에 놓고 전극을 EVOM에 연결합니다.
  2. 전극을 70% EtOH에 최소 5분 동안 담가 소독하고 완전히 건조시킵니다.
    참고: 필요한 경우 70% EtOH에서 더 오래 배양하거나 5% 차아염소산염 용액을 사용하여 전극의 오염을 제거할 수 있습니다.
  3. 인큐베이터에서 멤브레인 인서트의 iPSC-BEC를 회수하고 TEER을 측정합니다.
    알림: 온도 변화가 TEER 측정에 영향을 미칠 수 있으므로 인큐베이터에서 꺼낸 후 TEER을 빠르게 읽는 것이 중요합니다.
  4. 짧은 전극이 인서트 위에 배치되고 긴 전극이 인서트를 둘러싼 매체에 도달하도록 전극을 매체에 담그고 TEER을 읽습니다.
    알림: "젓가락" 끝의 전극이 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 측정을 위해 플레이트를 다시 내려놓기 전에 이를 위해 우물을 기울이십시오.

5. BEC 표현형을 검증하기 위한 면역형광(IF) 염색

참고: 완전히 분화되고 정제된 세포의 품질을 검증하기 위해 iPSC-BEC 단층은 앞서 설명한 분화 과정의 10일째에 뇌 내피 세포의 특징적인 마커에 대해 염색됩니다(그림 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22).

  1. 배지를 흡인하고 PBS로 1회 세척합니다.
  2. 얼음처럼 차가운 메탄올로 세포를 실온(RT)에서 15분 동안 고정합니다.
  3. 인산염 완충 식염수(PBS)로 3배 세척하고 PBS에서 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 RT에서 1시간 동안 차단합니다.
  4. 차단 용액에 희석된 1차 항체를 흡인하고 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 항체22의 출처 및 희석에 관한 정보는 Table of Materials and Stebbins et al.을 참조한다.
  5. 차단 용액에 희석된 2차 항체를 추가하기 전에 PBS로 3회 세척합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 이 시점부터 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.
  6. PBS로 2번 세탁하세요. 그런 다음 PBS에서 1:5,000 희석으로 DAPI를 추가하고 실온에서 15분 동안 염색합니다.
  7. PBS를 켠 상태에서 1x 세척하고 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다.

6. iPSC-BEC의 박테리아 제조 및 감염

  1. 감염 실험 전날(분화 9일 차)에 냉동 육수에서 박테리아의 야간 배양을 시작합니다. Nm에 감염된 경우 5% 양의 피(혈액 한천)로 Columbia 한천에 박테리아를 줄무늬로 만듭니다. 박테리아 배양액을 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 배양합니다.
  2. 다음날(10일째) 프로테아제 펩톤 배지(PPM)에 50μL의 2MMgCl2, 50μL의 2M NaHCO3 및 10mL당 100μL의 Kellogg's 보충제를 보충하여 신선한 PPM+를 준비합니다. 멸균 면봉을 사용하여 하룻밤 배양 플레이트의 Nm과 함께 50mL 원뿔형 튜브에 10mL의 PPM+ 배지를 접종합니다. 37°C에서 200rpm으로 1.5시간 동안 진탕하여 배양합니다(즉, 박테리아가 로그 성장 단계에 있을 때까지).
  3. 박테리아 배양 중에 기존 배지를 멤브레인 삽입물의 웰/상단당 400μL의 신선한 EC 배지(bFGF 또는 RA 제외)로 교체하여 감염을 위해 24웰 플레이트 또는 멤브레인 인서트에서 iPSC-BEC를 준비합니다.
  4. 4000 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양을 원심분리하고 배지를 흡입합니다. 박테리아 펠릿을 250μL의 PBS에 재현탁시킵니다.
  5. 신선한 PBS 4mL에 박테리아 세포 현탁액의 일부를 사용하고 OD600 0.4(약 1 x 108 CFU/mL)로 조정합니다.
  6. 그런 다음 원하는 감염 다중도(MOI)에 따라 세포 배양 배지(EC 배지)에서 박테리아를 희석합니다.
    참고: 예를 들어, MOI가 10인 경우 24웰 플레이트 또는 멤브레인 인서트에서 각각 iPSC-BEC를 감염시킬 때 1:10 또는 1:5로 희석합니다(24웰 플레이트의 단층당 1 x 105 세포). 인간 혈청의 첨가는 TEER에 의해 측정된 iPSC-BEC 장벽 표현형에 해로운 영향을 미치는 것으로 관찰되었기 때문에 다른 원고에서 기술된 바와 같이 감염을 위한 Nm의 제조에 포함되지 않습니다(데이터 미도시)30,31. 그러나 Nm과 iPSC-BEC의 상호 작용은 인간 혈청의 유무에 관계없이 영향을 받지 않습니다(데이터는 표시되지 않음).
  7. 준비된 박테리아 현탁액 100μL로 각 웰의 iPSC-BEC를 감염시키고 원하는 감염 시간 동안 배양합니다.
    참고: 많은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현은 Nm에 감염되었을 때 iPSC-BEC에서 증가하며, Martins-Gomes 등(그림 2)이 이전에 설명한 바와 같이 감염 8시간 후에 가장 두드러집니다(그림 2)19).

7. 정량적 PCR에 의한 선천성 면역 활성화

참고: 선호하는 RNA 분리, cDNA 합성 및 qPCR 프로토콜을 사용하여 샘플을 수집하고 선택한 사이토카인에서 qPCR을 실행합니다.

  1. 7.1. 시판되는 RNA 분리 키트에서 시약을 사용하여 분화 프로토콜 10일차에 감염 후 BEC 샘플에서 RNA를 수집합니다( 재료 표 참조).
    참고: 세척 및 멸균된 환경에서 조심스럽게 작업하여 샘플의 뉴클레아제 오염을 방지하십시오.
    1. 용해 완충액을 준비하고 iPSC-BEC의 각 웰/단층에 350μL를 추가합니다.
    2. 위아래로 여러 번(예: 20x) 피펫팅하고 현탁액을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 샘플을 수집합니다.
      참고: 샘플은 RNA 분리 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
    3. 배양된 세포 및 조직에서 RNA 정제를 위해 RNA 분리 키트와 함께 제공된 프로토콜을 따르십시오.
    4. 뉴클레아제가 없는 물에서 용출한 후 RNA 샘플을 얼음 위에 보관하여 잠재적인 RNase 활성을 최소화합니다.
    5. 분광광도계(예: Nanodrop)에서 RNA 농도를 추정합니다.
  2. cDNA 합성 키트를 사용하여 수집된 RNA에서 cDNA 라이브러리를 생성합니다( 재료 표 참조).
    1. cDNA 합성 키트의 프로토콜에 설명된 대로 정의된 총 반응 부피에서 cDNA 합성 마스터 믹스, 최소 200ng(이상적으로는 500ng)의 샘플 RNA 및 뉴클레아제가 없는 물로 구성된 반응을 설정합니다.
    2. 표준 열 순환기에서 사용된 cDNA 합성 키트의 시약에 적합한 프로그램을 실행합니다. 예: 25°C에서 2분, 55°C에서 10분, 95°C에서 1분
    3. 합성 후 cDNA를 뉴클레아제가 없는 물에 최대 1:10까지 희석하고 샘플을 단기 보관의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -20°C로 이동합니다.
      참고: RNA 농도가 낮은 경우(예: 50ng 미만) 더 낮은 희석이 필요할 수 있습니다. 희석된 cDNA는 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 세심하게 설계되고 검증된 프라이머를 사용하여 사이토카인 및 케모카인과 같은 선천성 면역 반응 유전자의 전사체를 표적으로 하는 cDNA 샘플에 대해 qPCR을 수행합니다.
    참고: 프라이머 설계는 qPCR 결과의 품질에 매우 중요하기 때문에 희석 시리즈를 수행하여 프라이머 효율을 테스트해야 하며 DNA 겔에서 여러 산물이 없는지 확인해야 합니다.
    1. 25μL 반응당 0.5μL 전방 프라이머 및 0.5μL 역방향 프라이머(뉴클레아제가 없는 물에서 10mM), 1μL cDNA, 10.5μL 뉴클레아제가 없는 H2O및 12.5μL qPCR 마스터 믹스를 사용합니다.
    2. 다음 사이클러 프로토콜을 사용하여 qPCR 기계에서 반응을 수행합니다: (a) 2분 동안 4°C; (b) 95분 동안 15°C; (c) 15초 동안 95°C; (d) 1분 동안 60°C; (c)와 (d)를 45회 순환합니다. (e) 선택적 용융 곡선: 30\u201299 °C(1°C 단위); 25 °C에서 5분 동안
    3. 데이터 분석을 위해 ΔΔCT 계산을 사용하여 사이토카인 및 케모카인 발현 수준을 18S 또는 GAPDH와 같은 참조 하우스키핑 유전자와 비교합니다.

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Representative Results

여기에 설명된 프로토콜은 Stebbins et al.에서 채택한 것으로, iPSC를 BBB 특성을 가진 뇌 유사 내피 세포로 분화하는 과정과 Nm19,22의 iPSC-BEC를 사용하는 감염 연구에 이 모델을 활용하는 방법을 강조합니다. iPSC-BEC는 적절하게 분화될 경우 TEER로 측정한 2000 Ω·cm2보다 큰 단단한 장벽 특성을 나타내며 VE-cadherin 및 CD31(PECAM)과 같은 내피 마커를 발현합니다(그림 1A\u2012C). 또한 긴밀한 접합 마커인 Claudin-5, Occludin, ZO-1(그림 1 D\u2012F)과 Glut-1(그림 1G)과 같은 수송체를 발현하고 위치를 파악합니다. Nm에 감염되면 iPSC-BEC는 IL-8(CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 및 IL6과 같은 qPCR로 측정한 호중구성 전염증성 사이토카인의 상향 조절을 통해 감염에 반응합니다(그림 2A\u2012E). 이러한 대표적인 결과는 iPSC-BEC가 안정적으로 분화되고 있는지 확인하는 방법과 Nm 감염에 대한 iPSC-BEC의 반응을 검사하는 방법을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: iPSC-BEC의 특성화. (A) 9-12일에 읽은 두 개의 분리된 개별 차별화의 TEER. 삼중도의 평균으로 표시되는 데이터입니다. 오차 막대는 ± SD를 나타냅니다. (B\u2012G) 내피 세포 마커 VE-cadherin(B) 및 PECAM-1(CD31; C), 단단한 접합 성분 Claudin-5 (D), Occludin (E) 및 ZO-1 (F) 및 글루코스 수송체 GLUT-1 (G). 눈금 막대는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 패널 B\u2012G는 BMC 저널17인 Fluids and Barriers of the CNS에 처음 발표된 Kim et al.의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Neisseria meningitidis에 감염 시 iPSC-BEC에 의한 사이토카인의 상향 조절. 감염 8시간 후 CXCL8(A), CXCL1(B), CXCL2(C), CCL20(D) 및 IL6(E) 전사체의 상대적 발현을 보여주는 대표적인 qPCR 데이터로, 감염되지 않은 iPSC-BEC 단층과 비교됩니다. 세 번에 걸쳐 수행된 세 가지 독립적인 실험의 평균으로 제시된 데이터. 오차 막대는 유의성을 결정하는 데 사용되는 S.D. Student의 t-검정± 나타냅니다. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001입니다. 이 그림은 원래 Frontiers in Microbiology19에 발표된 Martins Gomes et al.의 허가를 받아 수정 및 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: BEC 분화 과정의 여러 단계에 있는 IMR90-4 세포. BEC 분화 과정의 여러 단계에서 (A) 및 세포를 통과할 준비가 된 유지 IMR90-4 배양의 대표 이미지: (B) ROCK 억제제로 파종한 후(-2일), (C) 분화 시작(0일), (D) 합류 첫날(3일), (E) UM 단계 종료(6일), (F) BEC 정제 전(8일), 및 BEC 정제 후(9일 및 10일) (G 및 H). 눈금 막대는 500μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

시험관 내 1차 및 불멸화된 인간 BEC는 강력한 장벽 표현형이 부족한 경향이 있기 때문에 BEC와 BBB를 모델링하는 데 어려움이 있었습니다. 인간 줄기 세포 기술의 출현으로 내피 마커, 단단한 접합 발현, 장벽 특성, 다른 CNS 세포 유형에 대한 반응 및 기능적 유출 수송체와 같은 예상되는 특징적인 BBB 표현형을 유지하는 iPSC 유래 BEC 유사 세포의 생성이 가능해졌습니다 12,13,14,15,22, 24 , 25. 이를 통해 연구자들은 in vivo BEC를 밀접하게 모방하고 BBB 기능 장애가 보고된 다양한 질병을 모델링하는 in vitro BEC를 활용할 수 있었습니다 16,17,19,20,21,32. Nm은 세균성 뇌수막염의 주요 원인이며, 강력한 in vivo 모델이 결여된 인간 특이적 병원체이다19. 이러한 한계로 인해 Nm과 BBB 사이의 새로운 숙주-병원체 상호 작용의 발견을 주도하기 위해 더 잘 설계된 모델을 사용해야 했습니다. 최근에, 우리는 iPSC-BEC가 Nm-BEC 상호작용을 조사하기 위한 실행 가능한 모델임을 입증했다19.

여기서는 iPSC-BEC를 유도하고 Nm에 감염시켜 전형적으로 세균 감염에 의해 유발되는 전염증성 사이토카인의 상향조절을 초래하는 일반적인 방법을 설명한다19. iPSC-BEC의 유도를 위해 우리는 일반적으로 약간의 수정을 가하여 iPSC-BEC의 생성을 위해 Stebbins et al.에 설명된 프로토콜을 따릅니다22. 특히 여기서는 mTesR1 대신 StemFlex 배지를 사용하지만, 줄기세포 배양의 유지를 위해 배지 중 하나를 사용할 수 있다17. 이 프로토콜은 많은 iPSC 라인에서 잘 작동한다는 것이 확인되었지만, 각각의 개별 iPSC 라인(15, 24)에 대해 최적의 시딩 밀도가 결정되는 것이 중요하다. 이 원고에서는 IMR90-4 세포주를 사용하였으며, 1 x 105 cells/cm2가 최적의 초기 파종 밀도24라는 것이 이전에 확립되었다. 마지막으로, 생성된 BEC의 정체를 입증하기 위해 iPSC-BEC는 높은 TEER를 나타내면서 예상되는 내피 세포 마커와 긴밀한 연접을 발현합니다(그림 1)13,14,15,24. 이러한 표현형은 인간 기원일 뿐만 아니라 iPSC-BEC를 Nm-BEC 상호작용을 조사하는 강력한 도구로 만듭니다.

감염을 위한 Nm의 제조는 이전에 발표된 방법19,33에서 채택되었다. 박테리아 성장 배지가 세포 배양 실험에 도입되지 않도록 하기 위해, PBS에서의 세척 단계 및 재현탁을 방법에 설명된 대로 수행했습니다. 마지막으로, MOI 10은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 상향 조절을 통해 iPSC-BEC의 활성화를 초래하는 것으로 이전에 관찰되었다19. 다양한 박테리아에 반응하는 BEC의 활성화, 즉 호중구성 케모카인과 사이토카인의 상향 조절을 통해 관찰되었다6. iPSC-BEC는 B군 연쇄상구균 감염 후 강력한 호중구 화학유인제 IL-8, CXCL1 및 CXCL2를 상향 조절하는 것으로 이전에 관찰되었습니다(Nm16,19). iPSC-BEC의 관찰된 반응은 이 세포가 박테리아를 감지하고 선천성 면역 프로그램을 활성화하여 사이토카인의 상향 조절을 할 수 있음을 보여줍니다. qPCR에 의해 이러한 사이토카인의 상향 조절을 검출하는 방법은 잘 확립되어 있으며 위에서 간략하게 설명되었습니다. 그러나 흥미롭게도, 이러한 전염증성 사이토카인은 qPCR에 의해 검출되는 반면, 배위 단백질 생성물은 검출되지 않거나 매우 낮습니다16,19. 현재로서는 이것이 iPSC-BEC 모델의 인공물인지, 아니면 관찰된 사이토카인의 낮은 존재가 생물학적으로 관련이 있는지는 불분명합니다. 발현과 분비 사이의 단절 뒤에 있는 메커니즘을 결정하기 위해 향후 연구가 필요할 것입니다.

iPSC-BEC 모델의 주요 강점은 TEER 12,13,14,15,22에서 읽을 수 있듯이 장벽 기능에 기여하는 단단한 접합부의 발현 및 국소화입니다. Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS)에 대한 이전 연구는 Snail1의 상향 조절이 시험관 내 및 생체 내BBB 단단한 접합부의 파괴에 기여한다는 것을 입증했습니다 34. 보다 최근에, 이 발견은 GBS와 Nm 모두에서 iPSC-BEC 모델에서 확인되었으며, 이는 박테리아가 감염 중 BBB 무결성을 방해할 수 있는 방법에 대한 메커니즘을 시사합니다16,19. 또한, Nm은 내피 세포에서 CD147과 상호작용하여 박테리아 부착을 촉진하고, 궁극적으로 장벽 기능 장애를 유발하는 단단한 연접부의 재편성을 유발하는 것으로 입증되었다9. 우리는 Nm이 iPSC-BEC에서 CD147과 공동 국소화됨을 입증했으며, 이는 잠재적으로 이 모델을 BBB 기능 장애와 관련된 Nm-CD147 상호 작용의 향후 설명에 이상적으로 만듭니다19.

여기에 제시된 방법은 만능 줄기 세포 소스에서 iPSC-BEC의 분화 및 Nm 감염에 대한 적용을 보여줍니다. iPSC-BEC는 인간 기원이며, 내피 마커를 발현하고, BBB 특이적 표현형을 가지고 있어 Nm과 같은 인간 특이적 병원체 검사에 이상적인 모델입니다. 마지막으로, iPSC-BEC 모델이 호중구성 사이토카인 반응의 상향 조절을 통해 박테리아 감염에 반응한다는 것을 입증할 수 있습니다. 종합하면, iPSC-BEC 모델은 BBB에서 숙주-병원체 상호작용을 조사하기 위해 1차 및 불멸화 모델 시스템에 비해 특정 이점이 있습니다. 세균성 뇌수막염 중 BBB 파괴 기전을 규명하는 것이 추가 연구되어야 한다.

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Disclosures

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

L.M.E.는 A.S-U.에 수여된 "인간 병원체에 의한 미생물 감염 연구를 위한 3D 조직 모델"이라는 제목의 DFG 연구 교육 프로그램 GRK2157 지원을 받습니다. B.J.K.는 알렉산더 폰 훔볼트 재단(Alexander von Humboldt Foundation)의 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다. 또한, 문화 분야에서 iPSC-BEC를 생성하는 데 기술적 도움을 준 Lena Wolter에게 감사의 뜻을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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References

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Neisseria Meningitidis 수막구균성 뇌수막염 뇌 내피 세포 숙주-병원체 상호 작용 생체 내 모델 시스템 인간 기반 모델 밀착 접합 경내피 전기 저항(TEER) In vitro 모델 일차 BEC 불멸화된 BEC 유도만능줄기세포(iPSC) IPSC 유래 BEC(iPSC-BEC) 장벽 파괴 선천성 면역 활성화 박테리아 상호 작용

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Neisseria meningitidis</em> 유도만능줄기세포 유래 뇌내피세포의 감염
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Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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