Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Neisseria meningitidis Infeksjon av induserte pluripotente stamcelleavledede hjerneendotelceller

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen beskrevet her fremhever de viktigste trinnene i differensiering av induserte pluripotente stamcelleavledede hjernelignende endotelceller, fremstilling av Neisseria meningitidis for infeksjon og prøveinnsamling for andre molekylære analyser.

Abstract

Meningokokkmeningitt er en livstruende infeksjon som oppstår når Neisseria meningitidis (meningokokker , Nm) kan få tilgang til sentralnervesystemet (CNS) ved å trenge inn i høyt spesialiserte hjerneendotelceller (BEC). Siden Nm er et menneskespesifikt patogen, gjør mangelen på robuste in vivo-modellsystemer studier av vertspatogeninteraksjonene mellom Nm og BECs utfordrende og etablerer et behov for en menneskelig basert modell som etterligner innfødte BEC. BEC har strammere barriereegenskaper sammenlignet med perifere endotelceller karakterisert ved komplekse tette kryss og forhøyet transendotelial elektrisk motstand (TEER). Imidlertid mangler mange in vitro-modeller , som primære BECer og immortaliserte BEC-er, enten eller mister raskt barriereegenskapene etter fjerning fra det opprinnelige nevrale mikromiljøet. Nylige fremskritt innen humane stamcelleteknologier har utviklet metoder for å utlede hjernelignende endotelceller fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) som bedre fenokopi BEC sammenlignet med andre in vitro humane modeller. Bruken av iPSC-avledede BECer (iPSC-BEC) for å modellere Nm-BEC-interaksjon har fordelen av å bruke humane celler som har BEC-barriereegenskaper, og kan brukes til å undersøke barriereødeleggelse, medfødt immunaktivering og bakteriell interaksjon. Her demonstrerer vi hvordan man utleder iPSC-BECs fra iPSCs i tillegg til bakteriell forberedelse, infeksjon og prøveinnsamling for analyse.

Introduction

Blod-hjernebarrieren (BBB) og meningeal blod-CSF-barrieren (mBCSFB) er ekstremt tette cellulære barrierer som skiller sirkulasjonen fra sentralnervesystemet (CNS) og består hovedsakelig av høyt spesialiserte hjerneendotelceller (BECs)1,2. Sammen opprettholder BEC riktig hjernehomeostase ved å regulere næringsstoffer og avfallsprodukter inn og ut av hjernen, mens de utelukker mange toksiner, stoffer og patogener 1,2. Bakteriell meningitt oppstår når blodbårne bakterier er i stand til å samhandle med, og trenge gjennom barrieren dannet av BEC og forårsake betennelse. Neisseria meningitidis (Nm, meningokokker) er en gramnegativ bakterie som koloniserer nasofaraynx hos 10-1240 % av friske individer, men kan i noen tilfeller gi alvorlig systemisk sykdom3. Hos berørte individer kan Nm få tilgang til blodstrømmen der det kan forårsake purpura fulminans samt trenge inn i BECs som får tilgang til CNS som forårsaker meningitt3. Nm er en ledende årsak til bakteriell meningitt over hele verden, og til tross for vaksinasjonsinnsats, er fortsatt en primær årsak til meningitt4. Moderne medisinsk intervensjon, som antibiotikabehandling, har gjort disse forholdene overlevbare, men de som er rammet av hjernehinnebetennelse blir ofte igjen med permanent nevrologisk skade 5,6.

Tidligere studier har identifisert bakterielle faktorer og vertssignalering som bidrar til Nm-BEC-interaksjoner 7,8,9,10,11. De identifiserte adhesinene og invasjonene som opasitetsproteinet Opc og type-IV pili, samt reseptorer som CD147, har blitt utført på forskjellige BEC-modeller in vitro, men disse modellene mangler mange definerende BBB-egenskaper 7,9,11,12. Fullstendig forståelse av Nm-BEC-interaksjoner forblir unnvikende delvis på grunn av manglende evne til å utnytte in vivo-modeller, ufullstendig vaksinasjonsbeskyttelse og mangel på robuste humane BEC-modeller in vitro.

Modellering av hBECs in vitro har vært utfordrende på grunn av de unike egenskapene til BEC. Sammenlignet med perifere endotelceller har BEC en rekke fenotyper som forbedrer deres barriereegenskaper som høy transendotelial elektrisk motstand (TEER) på grunn av komplekse tette kryss12. Når de er fjernet fra hjernens mikromiljø, mister BECs raskt sine barriereegenskaper som begrenser nytten av primære eller udødeliggjorte in vitro-modeller som bare danner en svak barriere12,13. Kombinasjonen av den menneskelige spesifisiteten til Nm-infeksjoner, mangel på robuste in vivo-modeller og utfordrer modellering av humane BEC-er in vitro, skaper et behov for bedre modeller for å forstå den komplekse vertspatogeninteraksjonen mellom Nm og BEC. Nylig, ved hjelp av modell humanindusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier, har BEC-lignende celler blitt avledet fra iPSCs som bedre etterligner BECs in vivo12,13,14,15. iPSC-BEC-er er av menneskelig opprinnelse, lett skalerbare og har forventede BEC-fenotyper sammenlignet med deres primære eller udødeliggjorte kolleger12,13,14,15. I tillegg har vi og andre vist at iPSC-BECs er nyttige for modellering av ulike sykdommer i CNS som vertspatogeninteraksjon, Huntingtons sykdom og MCT8-mangel som forårsaker Allan-Hurndon-Dudley syndrom 16,17,18,19,20,21. Her demonstrerer vi hvordan man kan utlede iPSC-BECs fra fornybare iPSC-kilder og infeksjon av iPSC-BECs med Nm som fører til aktivering av den medfødte immunresponsen. Vi tror at denne modellen er nyttig for å forhøre vert-patogen-interaksjon som ikke kan rekapituleres i andre in vitro-modeller, og er spesielt nyttig når man undersøker interaksjoner med humane spesifikke patogener som Nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle medier / reagensfremstilling, stamcellevedlikehold og differensieringstrinn er tilpasset fra Stebbins et al.22.

1. Forberedelse av materialer som kreves for iPSC-kultur og BEC-differensiering.

  1. Matriksbelegg av vevskultur (TC) plast for IMR90-4 iPSC kultur
    1. Aliquot kjellermembranmatriksgel (f.eks. Matrigel) til 2,5 mg alikoter og oppbevares ved -20 °C.
      MERK: Arbeid raskt når du håndterer matriksgelen og alikoten på is, da den danner en gel over 4 °C og ikke kan aliseres når den har størknet.
    2. For å belegge TC-plast, tilsett raskt en alikot av matriksgel til 30 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) / F12-medium i et 50 ml konisk rør. Tilsett 1 ml av mediet på den frosne matriksgelen, pipetten opp og ned til den er tint, og overfør umiddelbart til 50 ml konisk rør med gjenværende medium.
    3. Bruk 1 ml av denne matriksgelbeleggløsningen per brønn på en 6-brønnsplate og 12 ml per T75-kolbe.
      MERK: Matrix gelbelagt TC-plast kan tilberedes opptil to uker før den brukes. Det er imidlertid kritisk å unngå at matriksgelløsningen tørker ut, noe som kan kreve sporadisk tilsetning av mer DMEM/F12 på toppen av brønnene.
  2. Forbered stamcelle vedlikeholdsmedium ved å legge 50 ml av 50x supplement til 450 ml av stamcelle vedlikehold basal medium i det sterile miljøet i en biosafety skap.
    MERK: Andre stamcellevedlikeholdsmedier (mTeSR og E8) har blitt brukt i andre studier 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. For å forberede 500 ml ubetinget medium (UM), kombiner 392,5 ml DMEM/F12 med 100 ml knock out serumerstatning (KOSR), 5 ml ikke-essensielle aminosyrer, L-glutamin ved en endelig konsentrasjon på 1 mM og 3,5 μL β-merkaptoetanol. Filtrer og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
  4. For å forberede 200 ml endotelcelle (EC) medium pluss retinsyre (RA) pluss bFGF, kombiner 198 ml humant endotelialt serumfritt medium (hESFM), 2 ml filtersterilisert blodplatefattig avledet serum (PDS) og 20 ng / ml bFGF. Filtrer sterilisering og oppbevar i opptil 2 uker ved 4 °C. Like før tilsetning til celler, tilsett 10 μM RA til EC-medium.
    MERK: Siden PDS er avviklet og derfor kan være begrenset, har denne protokollen blitt utført med B27 i stedet for PDS 15,23,26.
  5. For å forberede 200 ml EC-medium uten RA eller bFGF, kombiner 198 ml hESFM og 2 ml filtersterilisert PDS og filtrer sterilisering. Oppbevares i opptil 4 uker ved 4 °C.

2. Vedlikehold IMR90-4 cellekultur

MERK: Her bruker vi IMR90-4-cellelinjen som et eksempel, men andre induserte pluripotente stamcellelinjer som CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR og CS03iCTRn2 har blitt brukt til differensiering i BECs 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Dyrkning av iPSC ved 37 °C i 5 % CO 2 og opprettholdes typisk på 6-brønnsplater ved forskjellige tettheter med2 ml stamcellevedlikeholdsmedium per brønn.
  2. For vedlikehold av iPSC-kulturen, velg en enkelt brønn for passasje som ikke er sammenflytende og har åpne rom mellom kolonier.
    1. Aspirer kulturmediet, tilsett 1 ml ikke-enzymatisk celledissosiasjonsreagens og inkuber ved 37 °C i 7 minutter. Mens inkubering pågår, erstatt matriksgelløsningen på en ny 6-brønnsplate med 2 ml ferskt stamcellevedlikeholdsmedium per brønn.
    2. Aspirer forsiktig det ikke-enzymatiske celledissosiasjonsreagenset, pass på at du ikke aspirerer celler som fortsatt er festet til platen.
    3. Tilsett 6 ml stamcellevedlikeholdsmedium og skyll brønnbunnen noen ganger til alle cellene er helt løsrevet. Deretter frø den nye 6-brønnsplaten med varierende tetthet, vanligvis 1:6 eller 1:12 for normalt vedlikehold.
      MERK: Ved hjelp av de nevnte forholdene deles cellene omtrent to ganger i uken.
    4. Flytt platen til inkubatoren og fordel de frøede cellene likt over brønnene ved å riste platen frem og tilbake og venstre til høyre, pause mellom vekslende ristende bevegelser til mediet har avgjort.

3. Differensiering av hjerneendotelceller fra humane iPSCer

  1. Plating av iPSCs for differensiering (dag -3 i differensieringsprotokollen)
    1. Per IMR90-4 vedlikeholdskultur som er godt brukt til å plate for differensiering, aspirere kulturmediet, tilsette 1 ml enzymatisk celledissosiasjonsreagens per brønn og inkubere ved 37 °C i 7 minutter.
    2. Inaktiver det enzymatiske celledissosiasjonsreagenset ved å overføre 1 ml dissosiert cellesuspensjon til et 15 ml konisk rør med minst 2 ml ferskt stamcellevedlikeholdsmedium per 1 ml celler. Spinn ned celleopphenget på 1,500 x g i 5 minutter.
    3. Resuspender cellepelleten i 1 ml stamcellevedlikeholdsmedium per brønn av IMR90-4-celler som brukes, og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
      MERK: Det kan være nyttig å fortynne 1:1 med 0,4 % trypanblå for å skille mellom levende og døde celler når du teller. Avhengig av tettheten til iPSCs, gir en brønn med en 6-brønnsplate vanligvis 1\u20122 x 106 celler.
    4. For differensiering i en T75-kolbe, tilsett 7,5 x 105 celler til 12 ml stamcellevedlikeholdsmedium og ROCK-hemmer (Y27632 dihydroklorid) ved en endelig konsentrasjon på 10 μM. Aspirat matriks gelbeleggsløsning fra en T75-kolbe og overfør cellesuspensjonen til kolben. Fordel cellene likt ved å riste kolben frem og tilbake og fra venstre mot høyre (se trinn 2.2.4) og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Det er viktig å legge til ROCK-hemmer på dette trinnet for å forbedre overlevelsen av de dissosierte enkle stamceller25,29. Cellene skal fordeles jevnt over kolben og i singleter med spredning, mesenkymallignende morfologi på grunn av ROCK-hemmerbehandling22.
  2. På dag -2 og dag -1, bytt media til ferskt stamcellevedlikeholdsmedium; 12 ml per T75.
  3. På dag 0, start differensiering ved å endre media til UM; 12 ml per T75.
  4. Endre UM daglig (dag 1 – dag 5).
    MERK: Cellene når vanligvis sammenløp etter 2 til 3 dager i UM, som kan observeres med det blotte øye eller gjennom et omvendt lysfeltmikroskop. Etter hvert som differensieringen utvikler seg, blir nestin+ "nevrale kanaler" synlige med PECAM-1+ celler i mellom som tidligere beskrevet13,14.
  5. Selektivt utvide endotelcellepopulasjonen ved å bytte til EC-medium med 20 ng / ml bFGF og 10 μM retinsyre (RA) (dag 6) og inkubere i to dager. EC-medium med bFGF kan tilberedes opptil to uker før. RA tilsettes fra fryst lager på bruksdagen (f.eks. 1 μL 10 mM RA-lager per 1 ml EC + bFGF).
    MERK: Vellykket differensiering kan også oppnås uten tilskudd av RA på dagene 6 og 8. Utelatelse av RA vil imidlertid gi BECs med redusert TEER12,13,14.
  6. Belegg cellekulturplater og membraninnsatser (f.eks. Transwell) med kollagen IV og fibronektin (dag 7), for rensing av BEC og følgende eksperimenter.
    1. For belegging av membraninnsatser, kombiner 4 deler kollagen IV (1 mg / ml i 0,5 mg / ml eddiksyre), 1 del fibronektin (1 mg / ml) og 5 deler sterilt vevsvann. ECM-oppløsning kan fortynnes 1:5 for å belegge cellekulturplater (dvs. 4 deler kollagen IV, 1 del fibronektin, 45 deler vann). Inkuber med overflatebehandlingsoppløsning ved 37 °C over natten.
      MERK: Plater og membraninnsatser kan også belegges i minst 4 timer før subkulturering samme dag som rensetrinnet.
  7. Rens BEC ved å subkulturere de differensierte cellene på kollagen IV og fibronektinbelagte plater eller membraninnsatser (dag 8).
    1. Aspirat EC-medium og legg til enzymatisk celledissosiasjonsreagens (12 ml per T75). Inkuber ved 37 °C inntil 90 % av cellene har løsnet fra kolben.
      MERK: Celledissosiasjon kan ta opptil 1 time.
    2. Under inkubasjonstiden, fjern kollagen IV / fibronektinbeleggsoppløsningen fra tidligere tilberedte plater / innsatser og la dem tørke i en steril hette. Det tar ca. 20 min før innsatsene tørker.
    3. Når cellene har løsnet, vask dem av kolben med en 10 ml pipette. Pipett opp og ned for å oppnå en enkeltcellesuspensjon.
      MERK: Enkeltcellesuspensjon er viktig for pålitelig celletelling og for å oppnå faste monolag.
    4. Fortynn med minst like volum fersk hESFM i et 50 ml konisk rør og telle celler ved hjelp av et hemocytometer.
    5. Pellet cellene ved 1,500 x g i 10 minutter.
    6. Resuspender celler i passende volum nytilberedt EC + bFGF + RA for å oppnå en suspensjon på 2 x 106 celler / ml for såing på membraninnsatser. Tilsett 500 μL (1 x 106 celler) på toppen av en 12-brønns innsats og 1,5 ml EC + bFGF + RA-medium på bunnen. For såing på 24 og 48-brønnplater, fortynn cellesuspensjon 1: 2 og tilsett henholdsvis 500 μL (5 x 10 5 celler) og 250 μL (2, 5 x 105 celler) per brønn. Fordel cellene jevnt utover brønnen/innsatsen (se trinn 2.2.4) og inkuber ved 37 °C under 5 % CO2.
  8. Bytt medier på plater/transbrønner til EC uten bFGF eller RA (dag 9).
  9. Gjennomføre infeksjonsforsøk, TEER-måling og immunfluorescensfarging som beskrevet i avsnittene nedenfor (dag 10).
    MERK: Vellykket differensierte og rensede BECs når vanligvis topp TEER på dag 10 og uttrykker karakteristiske markører for hjerneendotelceller som PECAM-1 (CD31) og VE-cadherin, glukosetransportøren GLUT-1, efflukstransportører som p-glykoprotein og tette krysskomponenter ZO-1, Occludin og Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Se Lippmann et al., Stebbins et al. og andre for ytterligere detaljer og bilder av celletyper, morfologier og uttrykk for celletypespesifikke markører under differensieringsprosessen 13,14,15,16,17,19,22. Representative bilder av IMR90-4-cellene på ulike stadier i BEC-differensieringsprosessen finnes i tilleggsfigur 1.

4. Transendotelial elektrisk motstand (TEER) som et mål på barrieretetthet

MERK: TEER leses vanligvis på membraninnsatser på dag 9 og 10 av differensiering for å bekrefte vellykket generering av barrieredannende iPSC-BECs (figur 1A).

  1. Plasser epithelial volt-ohm meter (EVOM) i det sterile miljøet til en biosikkerhetshette og koble elektroden til EVOM.
  2. Desinfiser elektroden ved å senke den i 70% EtOH i minst 5 minutter og la den tørke helt.
    MERK: Lengre inkubasjon i 70% EtOH eller dekontaminering av elektroden ved bruk av 5% hypoklorittoppløsning er mulig om nødvendig.
  3. Hent iPSC-BECene på membraninnsatser fra inkubatoren og mål TEER.
    MERK: Det er viktig å lese TEER raskt etter fjerning fra inkubatoren, da temperaturendringer kan påvirke TEER-måling.
  4. Les TEER ved å dyppe elektroden i mediet slik at den kortere elektroden plasseres på toppen av innsatsen og den lengre elektroden når inn i mediet som omgir innsatsen.
    MERK: Forsikre deg om at elektrodene på tuppene på "spisepinnene" er helt dekket av væske. Vipp brønnen om nødvendig for å oppnå dette før du setter platen ned igjen for måling.

5. Immunfluorescens (IF) farging for å validere BEC-fenotype

MERK: For å validere kvaliteten på de fullt differensierte og rensede cellene, farges iPSC-BEC-monolayers for de karakteristiske markørene for hjerneendotelceller på dag 10 av differensieringsprosessen som tidligere beskrevet (figur 1B \u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Aspirer mediet og vask 1x med PBS.
  2. Fest celler med iskald metanol ved romtemperatur (RT) i 15 minutter.
  3. Vask 3x med fosfatbufret saltvann (PBS) og blokk med 10% føtal bovint serum (FBS) i PBS ved RT i 1 time.
  4. Aspirat og tilsett primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning. Inkuber ved 4 °C over natten.
    MERK: Se materialfortegnelsen og Stebbins et al. for informasjon relatert til kilde og fortynning av antistoffene22.
  5. Vask 3x med PBS før tilsetning av sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsoppløsning. Inkubere ved RT i 1 time. Beskytt prøver mot lys fra dette punktet.
  6. Vask 2x med PBS. Deretter legger du til DAPI ved en 1:5,000 fortynning i PBS og beis på RT i 15 min.
  7. Vask 1x forlater PBS på og ta bilder ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

6. Fremstilling av bakterier og infeksjon av iPSC-BECs

  1. Dagen før smitteforsøket (dag 9 av differensiering), start en overnattingsdyrkning av bakteriene fra frossen bestand. For infeksjon med Nm, strekbakterier på Columbia-agar med 5% saueblod (blod-agar). Inkuber bakteriekulturer ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
  2. Neste dag (dag 10), tilbered fersk PPM+ ved å supplere proteasepeptonmedier (PPM) med 50 μL 2 M MgCl2, 50 μL 2 M NaHCO3 og 100 μL Kelloggs tilskudd per 10 ml. Inokuler 10 ml PPM+ medium i et 50 ml konisk rør med Nm fra dyrkingsplaten over natten ved hjelp av en steril bomullspinne. Inkuber risting ved 200 o / min ved 37 ° C i 1,5 timer (dvs. til bakterier er i logaritmisk vekstfase).
  3. Under bakteriell inkubasjon, klargjør iPSC-BECs i en 24-brønns plate eller på membraninnsatser for infeksjon ved å erstatte det gamle mediet med 400 μL ferskt EC-medium (uten bFGF eller RA) per brønn / topp membraninnsats.
  4. Sentrifuge bakteriekultur ved 4000 x g i 10 min og aspirere mediet. Resuspender bakteriepelleten i 250 μL PBS.
  5. I 4 ml fersk PBS, bruk en del av bakteriecellesuspensjonen og juster til en OD600 på 0,4 (ca. 1 x 108 CFU / ml).
  6. Deretter fortynnes bakteriene i cellekulturmedium (EC-medium) i henhold til ønsket infeksjonsmangfold (MOI).
    MERK: For eksempel, for en MOI på 10, fortynn 1:10 eller 1:5 når du infiserer iPSC-BEC i henholdsvis en 24-brønnsplate eller på membraninnsatser (1 x 105 celler per monolag i en 24-brønnsplate). Tillegg av humant serum er ikke inkludert i tilberedningen av Nm for infeksjon som ble beskrevet i andre manuskripter, da det ble observert å ha en skadelig innvirkning på iPSC-BEC-barrierefenotypen målt ved TEER (data ikke vist)30,31. Samspillet mellom Nm og iPSC-BECs er imidlertid upåvirket med eller uten humant serum (data ikke vist).
  7. Infiser iPSC-BECs i hver brønn med 100 μL av den tilberedte bakteriesuspensjonen og inkuber for ønsket infeksjonstid.
    MERK: Ekspresjon av en rekke proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner er forhøyet i iPSC-BECs når de er infisert med Nm, mest fremtredende etter 8 timers infeksjon som tidligere beskrevet av Martins-Gomes et al (figur 2) 19.

7. Medfødt immunaktivering ved kvantitativ PCR

MERK: Bruk en foretrukket RNA-isolasjon, cDNA-syntese og qPCR-protokoll, samle prøver og kjør qPCR på utvalgte cytokiner.

  1. 7.1. Samle RNA fra BEC-prøver etter infeksjon på dag 10 i differensieringsprotokollen, ved hjelp av reagenser fra et kommersielt tilgjengelig RNA-isolasjonssett (se materialfortegnelsen).
    MERK: Unngå nukleasekontaminering av prøver ved å arbeide forsiktig i et rengjort og sterilisert miljø.
    1. Forbered lysisbuffer og tilsett 350 μL til hver brønn / monolag av iPSC-BEC.
    2. Samle prøvene ved å pipettere opp og ned flere ganger (f.eks. 20x) og overføre suspensjonen til et sterilt mikrosentrifugerør.
      MERK: Prøver kan lagres ved -80 °C til de er klare for RNA-isolering.
    3. Følg protokollen som følger med RNA-isolasjonssettet for RNA-rensing fra dyrkede celler og vev.
    4. Etter eluering i nukleasefritt vann, hold RNA-prøver på is for å minimere potensiell RNase-aktivitet.
    5. Estimere RNA-konsentrasjoner på et spektrofotometer (f.eks. Nanodrop).
  2. Generer et cDNA-bibliotek fra det innsamlede RNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett (se materialtabell).
    1. Sett opp reaksjoner som består av cDNA-syntesemasterblanding, minst 200 ng (ideelt 500 ng) prøve-RNA og nukleasefritt vann i et definert totalt reaksjonsvolum som beskrevet i protokollen til cDNA-syntesesettet.
    2. På en standard termosyklist, kjør et program som passer for reagensene til cDNA-syntesesettet som brukes. For eksempel: 25 °C i 2 minutter, 55 °C i 10 minutter, 95 °C i 1 min.
    3. Etter syntese, fortynn cDNA opp til 1:10 i nukleasefritt vann og flytt prøver til 4 ° C for kort varighet eller -20 ° C for langtidslagring.
      MERK: Lavere fortynning kan være nødvendig hvis RNA-konsentrasjonen var lav (f.eks. under 50 ng). Det fortynnede cDNA kan lagres ved -20 °C i opptil ett år.
  3. Utfør qPCR på cDNA-prøvene rettet mot transkripsjoner av medfødte immunresponsgener som cytokiner og kjemokiner med nøye utformede og validerte primere.
    MERK: Siden primerdesign er svært viktig for kvaliteten på qPCR-resultatene, bør primereffektiviteten testes ved å utføre en fortynningsserie, og fraværet av flere produkter bør bekreftes på en DNA-gel.
    1. Per 25 μL reaksjon, bruk 0,5 μL fremover og 0,5 μL omvendt primer (10 mM i nukleasefritt vann), 1 μL cDNA, 10,5 μL nukleasefri H2O og12,5μL qPCR-masterblanding.
    2. Utfør reaksjonen på en qPCR-maskin ved å bruke følgende syklistprotokoll: (a) 4 °C i 2 minutter; (b) 95 °C i 15 minutter; c) 95 °C i 15 s, (d) 60 °C i 1 min; Bla gjennom (c) og (d) 45 ganger; (e) valgfri smeltekurve: 30\u201299 °C i trinn på 1 °C; 25 °C i 5 min.
    3. For dataanalyse, bruk ΔΔCT-beregningen for å sammenligne cytokin- og kjemokinuttrykksnivåer med et referansehusgen, for eksempel 18S eller GAPDH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet her er tilpasset fra Stebbins et al. og fremhever prosessen for å differensiere iPSCs til hjernelignende endotelceller som har BBB-egenskaper, og hvordan man bruker denne modellen for infeksjonsstudier ved bruk av iPSC-BECs med Nm19,22. iPSC-BEC-ene, når de differensieres riktig, viser tette barriereegenskaper målt ved TEER som ofte er større enn 2000 Ω · cm2, og uttrykker endotelmarkører som VE-cadherin og CD31 (PECAM) (figur 1A \u2012C). I tillegg uttrykker og lokaliserer de tette kryssmarkørene Claudin-5, Occludin og ZO-1 (figur 1 D\u2012F), og transportører som Glut-1 (figur 1G). Ved infeksjon med Nm responderer iPSC-BECs på infeksjon ved oppregulering av nøytrofile proinflammatoriske cytokiner målt ved qPCR som IL-8 (CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 og IL6 (figur 2A\u2012E). Disse representative resultatene demonstrerer hvordan man sikrer at iPSC-BECs blir differensiert pålitelig, og hvordan man undersøker responsen til iPSC-BECs på Nm-infeksjon.

Figure 1
Figur 1: Karakterisering av iPSC-BEC. (A) TEER av to separate, individuelle differensieringer, lest på dag 9-12. Data presentert som gjennomsnitt av triplikater. Feilfelt representerer ± SD. (B\u2012G) Representative immunfluorescensdata som viser ekspresjon av endotelcellemarkørene VE-cadherin (B) og PECAM-1 (CD31; C), tette krysskomponenter Claudin-5 (D), Occludin (E) og ZO-1 (F), og glukosetransportør GLUT-1 (G). Skalastangen representerer 50 μm. Paneler B\u2012G av denne figuren har blitt brukt med tillatelse fra Kim et al. opprinnelig publisert i Fluids and Barriers of the CNS, et BMC-tidsskrift17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Oppregulering av cytokiner med iPSC-BECs ved infeksjon med Neisseria meningitidis. Representative qPCR-data som viser relativ ekspresjon av CXCL8 (A), CXCL1 (B), CXCL2 (C), CCL20 (D) og IL6 (E) transkripsjoner etter 8 timers infeksjon, sammenligning av infiserte iPSC-BEC monolag. Data presentert som gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Feilfelt representerer ± S.D. Student t-test som brukes til å bestemme signifikans. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Denne figuren er modifisert og brukt med tillatelse fra Martins Gomes et al. opprinnelig publisert i Frontiers in Microbiology19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: IMR90-4 celler på ulike stadier i BEC-differensieringsprosessen. Representative bilder av vedlikehold IMR90-4 kultur klar til å bli passert (A) og celler på forskjellige stadier i BEC-differensieringsprosessen: (B) etter såing med ROCK-hemmer (dag -2), (C) ved oppstart av differensiering (dag 0), (D) første konfluensdag (dag 3), (E) slutten av UM-fasen (dag 6), (F) før BEC-rensing (dag 8), og (G og H) etter BEC-rensing (dag 9 og dag 10). Skalastangen representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modellering av BECs og BBB har hatt utfordringer, da primære og udødeliggjorte menneskelige BEC, in vitro, har en tendens til å mangle robuste barrierefenotyper. Fremkomsten av menneskelige stamcelleteknologier har gjort det mulig å generere iPSC-avledede BEC-lignende celler som beholder forventede kjennetegn BBB-fenotyper som endotelmarkører, tett kryssuttrykk, barriereegenskaper, respons på andre CNS-celletyper og funksjonelle efflukstransportører 12,13,14,15,22, 24 , 25. Dette har gjort det mulig for forskere å bruke BECs in vitro som tett etterligner in vivo BECs og modellerer ulike sykdommer med rapportert BBB-dysfunksjon 16,17,19,20,21,32. Nm er en ledende årsak til bakteriell meningitt og er et humant spesifikt patogen som mangler robuste in vivo-modeller 19. Denne begrensningen har nødvendiggjort bruk av bedre konstruerte modeller for å drive oppdagelsen av ny vertspatogen interaksjon mellom Nm og BBB. Nylig har vi demonstrert at iPSC-BECs er en levedyktig modell for å forhøre Nm-BEC interaksjon19.

Her beskriver vi en generell metode for å utlede iPSC-BECs og infisere med Nm som resulterer i oppregulering av proinflammatoriske cytokiner som vanligvis induseres av bakteriell infeksjon19. For utledning av iPSC-BECs følger vi generelt protokollen som beskrevet i Stebbins et al. for generering av iPSC-BEC, med mindre modifikasjoner22. Spesielt her bruker vi StemFlex-medier i stedet for mTesR1, men begge medier kan brukes til vedlikehold av stamcellekulturen17. Det har blitt fastslått at denne protokollen fungerer bra med mange iPSC-linjer, men det er viktig at den optimale såtettheten bestemmes for hver enkelt iPSC-linje15, 24. Til dette manuskriptet brukte vi IMR90-4-cellelinjen, og det er tidligere fastslått at 1 x 105 celler/cm2 var optimal initial såtetthet24. Til slutt, som en demonstrasjon av identiteten til BECs generert, uttrykker iPSC-BECs forventede endotelcellemarkører og stramme kryss mens de viser høy TEER (figur 1) 13,14,15,24. Disse fenotypene, så vel som å være av menneskelig opprinnelse, gjør iPSC-BECs til et kraftig verktøy for å forhøre Nm-BEC-interaksjon.

Klargjøring av Nm for infeksjon ble tilpasset fra tidligere publiserte metoder 19,33. For å sikre at bakterievekstmediet ikke ble introdusert i cellekulturforsøkene, ble det gjennomført vasketrinn og resuspensjon i PBS som beskrevet i metodene. Endelig hadde en MOI på 10 tidligere blitt observert å resultere i aktivering av iPSC-BECs gjennom en oppregulering av proinflammatoriske cytokiner19. Aktivering av BEC som respons på forskjellige bakterier har blitt observert, nemlig gjennom oppregulering av nøytrofile kjemokiner og cytokiner6. Det har tidligere blitt observert at iPSC-BECs oppregulerer de potente nøytrofile kjemoattraktantene IL-8, CXCL1 og CXCL2 etter infeksjon med gruppe B streptokokker, og Nm16,19. Denne observerte responsen fra iPSC-BECs viser at disse cellene er i stand til å oppdage bakterier og aktivere et medfødt immunprogram som resulterer i oppregulering av cytokiner. Metodene for å oppdage oppregulering av disse cytokinene ved qPCR er veletablerte og er kort beskrevet ovenfor. Imidlertid, interessant, mens disse proinflammatoriske cytokinene oppdages av qPCR, er koordinatproteinproduktene enten uoppdagede eller svært lave16,19. For tiden er det uklart om dette er en artefakt av iPSC-BEC-modellene, eller om den observerte lave forekomsten av cytokiner er biologisk relevant. Fremtidig forskning vil være nødvendig for å bestemme en mekanisme bak frakoblingen mellom uttrykk og sekresjon.

En stor styrke ved iPSC-BEC-modellen er uttrykket og lokaliseringen av tette kryss som bidrar til barrierefunksjon som lest være TEER 12,13,14,15,22. Tidligere arbeid med Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptokokker, GBS) har vist at oppregulering av Snail1 bidrar til ødeleggelse av BBB tette kryss in vitro og in vivo 34. Mer nylig ble dette funnet bekreftet i iPSC-BEC-modellen både med GBS og Nm som antyder en mekanisme for hvordan bakterier er i stand til å forstyrre BBB-integriteten under infeksjon16,19. I tillegg ble det demonstrert at Nm interagerer med CD147 på endotelceller som fremmer bakteriell tilknytning, og til slutt omorganisering av stramme kryss som fører til barrieredysfunksjon9. Vi har vist at Nm samlokaliserer med CD147 i iPSC-BEC-ene, noe som potensielt gjør denne modellen ideell for fremtidig belysning av Nm-CD147-interaksjoner når det gjelder BBB-dysfunksjon19.

Metoden som presenteres her demonstrerer differensiering av iPSC-BECs fra en pluripotent stamcellekilde, og anvendelse med Nm-infeksjon. iPSC-BEC-ene er av menneskelig opprinnelse, uttrykker endotelmarkører og har BBB-spesifikke fenotyper, noe som gjør dem til en ideell modell for undersøkelse av humane spesifikke patogener som Nm. Til slutt kan vi demonstrere at iPSC-BEC-modellen reagerer på bakteriell infeksjon gjennom oppregulering av en nøytrofil cytokinrespons. Samlet sett har iPSC-BEC-modellen visse fordeler i forhold til primære og immortaliserte modellsystemer for å undersøke vertspatogeninteraksjonene på BBB. Videre arbeid bør være rettet mot å belyse mekanismer for BBB-ødeleggelse under bakteriell meningitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

L.M.E. støttes av DFGs forskningsopplæringsprogram GRK2157 med tittelen "3D Tissue Models for Study Microbial Infections by Human Pathogens" tildelt A. S-U. B.J.K. støttes av et postdoktorstipend fra Alexander von Humboldt-stiftelsen. I tillegg anerkjenner vi Lena Wolter for hennes tekniske assistanse i genereringen av iPSC-BECs i kultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Tags

Neisseria meningitidis meningokokkmeningitt hjerneendotelceller vertspatogen-interaksjoner in vivo modellsystemer menneskebasert modell tette veikryss transendotelial elektrisk motstand (TEER) in vitro-modeller primære BEC immortaliserte BEC induserte pluripotente stamceller (iPSCs) IPSC-avledede BEC-er (iPSC-BEC) barriereødeleggelse medfødt immunaktivering bakteriell interaksjon

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Neisseria meningitidis</em> Infeksjon av induserte pluripotente stamcelleavledede hjerneendotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter