Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Neisseria meningitidis Infektion af inducerede pluripotente stamcelleafledte hjerneendotelceller

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen beskrevet her fremhæver de vigtigste trin i de differentierende inducerede pluripotente stamcelleafledte hjernelignende endotelceller, forberedelsen af Neisseria meningitidis til infektion og prøveindsamling til andre molekylære analyser.

Abstract

Meningokokmeningitis er en livstruende infektion, der opstår, når Neisseria meningitidis (meningokokker, Nm) kan få adgang til centralnervesystemet (CNS) ved at trænge ind i højt specialiserede hjerneendotelceller (BEC'er). Da Nm er et menneskespecifikt patogen, gør manglen på robuste in vivo-modelsystemer undersøgelse af værtspatogeninteraktionerne mellem Nm og BEC'er udfordrende og etablerer et behov for en menneskebaseret model, der efterligner indfødte BEC'er. BEC'er har strammere barriereegenskaber sammenlignet med perifere endotelceller, der er kendetegnet ved komplekse tætte kryds og forhøjet transendotelial elektrisk modstand (TEER). Imidlertid mangler mange in vitro-modeller , såsom primære BEC'er og udødeliggjorte BEC'er, enten eller mister hurtigt deres barriereegenskaber efter fjernelse fra det oprindelige neurale mikromiljø. Nylige fremskridt inden for humane stamcelleteknologier har udviklet metoder til at udlede hjernelignende endotelceller fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er), der bedre fænokopi-BEC'er sammenlignet med andre in vitro-humane modeller. Brugen af iPSC-afledte BEC'er (iPSC-BEC'er) til at modellere Nm-BEC-interaktion har fordelen ved at bruge humane celler, der besidder BEC-barriereegenskaber, og kan bruges til at undersøge barriereødelæggelse, medfødt immunaktivering og bakteriel interaktion. Her demonstrerer vi, hvordan man udleder iPSC-BEC'er fra iPSC'er ud over bakteriel forberedelse, infektion og prøveindsamling til analyse.

Introduction

Blod-hjerne-barrieren (BBB) og meningeal blod-CSF-barrieren (mBCSFB) er ekstremt stramme cellulære barrierer, der adskiller cirkulationen fra centralnervesystemet (CNS) og består primært af højt specialiserede hjerneendotelceller (BEC'er)1,2. Sammen opretholder BEC'er korrekt hjernehomeostase ved at regulere næringsstoffer og affaldsprodukter ind og ud af hjernen, samtidig med at mange toksiner, lægemidler og patogenerudelukkes 1,2. Bakteriel meningitis opstår, når blodbårne bakterier er i stand til at interagere med og trænge ind i barrieren dannet af BEC'er og forårsage betændelse. Neisseria meningitidis (Nm, meningokokker) er en gramnegativ bakterie, der koloniserer nasopharaynx hos 10-40% af raske individer, men i nogle tilfælde kan forårsage alvorlig systemisk sygdom3. Hos berørte individer kan Nm få adgang til blodstrømmen, hvor det kan forårsage purpura fulminans samt trænge ind i BEC'er, der får adgang til CNS, der forårsager meningitis3. Nm er en førende årsag til bakteriel meningitis på verdensplan, og på trods af vaccinationsindsatsen er det stadig en primær årsag til meningitis4. Moderne medicinsk intervention, såsom antibiotikabehandling, har gjort disse tilstande overlevelige, men de, der er ramt af meningitis, efterlades ofte med permanent neurologisk skade 5,6.

Tidligere undersøgelser har identificeret bakterielle faktorer og værtssignalering, der bidrager til Nm-BEC-interaktioner 7,8,9,10,11. De identificerede adhæsiner og invasiner såsom opacitetsproteinet Opc og type-IV pili samt receptorer såsom CD147 er blevet udført på forskellige BEC-modeller in vitro, men disse modeller mangler mange definerende BBB-egenskaber 7,9,11,12. Fuldstændig forståelse af Nm-BEC-interaktioner forbliver undvigende delvis på grund af manglende evne til at udnytte in vivo-modeller, ufuldstændig vaccinationsbeskyttelse og mangel på robuste humane BEC-modeller in vitro.

Modellering af hBEC'er in vitro har været udfordrende på grund af BEC'ernes unikke egenskaber. Sammenlignet med perifere endotelceller har BEC'er en række fænotyper, der forbedrer deres barriereegenskaber, såsom høj transendotelial elektrisk modstand (TEER) på grund af komplekse tætte kryds12. Når de er fjernet fra hjernens mikromiljø, mister BEC'er hurtigt deres barriereegenskaber, hvilket begrænser anvendeligheden af primære eller udødeliggjorte in vitro-modeller, der kun danner en svag barriere12,13. Kombinationen af den humane specificitet af Nm-infektioner, mangel på robuste in vivo-modeller og udfordringer med modellering af humane BEC'er in vitro skaber et behov for bedre modeller til at forstå den komplekse vært-patogen-interaktion mellem Nm og BEC'er. For nylig ved hjælp af model human induceret pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier BEC-lignende celler er blevet afledt af iPSC'er, der bedre efterligner BEC'er in vivo12,13,14,15. iPSC-BEC'er er af menneskelig oprindelse, let skalerbare og besidder forventede BEC-fænotyper sammenlignet med deres primære eller udødeliggjorte modstykker12,13,14,15. Derudover har vi og andre vist, at iPSC-BEC'er er nyttige til modellering af forskellige sygdomme i CNS, såsom vært-patogen-interaktion, Huntingtons sygdom og MCT8-mangel, der forårsager Allan-Hurndon-Dudley syndrom 16,17,18,19,20,21. Her demonstrerer vi, hvordan man udleder iPSC-BEC'er fra vedvarende iPSC-kilder og infektion af iPSC-BEC'er med Nm, der fører til aktivering af det medfødte immunrespons. Vi mener, at denne model er nyttig til at forhøre vært-patogen-interaktion, der ikke kan rekapituleres i andre in vitro-modeller, og er især nyttig, når man undersøger interaktioner med humane specifikke patogener såsom Nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle medier / reagensforberedelse, stamcellevedligeholdelse og differentieringstrin er tilpasset fra Stebbins et al.22.

1. Forberedelse af materialer, der kræves til iPSC-kultur og BEC-differentiering.

  1. Matrixbelægning af vævskultur (TC) plast til IMR90-4 iPSC-kultur
    1. Alikvote kældermembranmatrixgel (f.eks. Matrigel) i 2,5 mg alikvoter og opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Arbejd hurtigt, når du håndterer matrixgelen og alikvoten på is, da den danner en gel over 4 °C og ikke kan alikveres, når den først er størknet.
    2. Til belægning af TC-plast tilsættes hurtigt en alikvot matrixgel til 30 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM)/F12-medium i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 1 ml af substratet på den frosne matrixgel, pipette op og ned, indtil det er optøet, og overfør straks til det 50 ml koniske rør med det resterende medium.
    3. Brug 1 ml af denne matrixgelbelægningsopløsning pr. hul i en 6-brønds plade og 12 ml pr. T75-kolbe.
      BEMÆRK: Matrix gelbelagt TC-plast kan fremstilles op til to uger før det bruges. Det er dog afgørende at undgå, at matrixgelopløsningen tørrer ud, hvilket kan kræve lejlighedsvis tilsætning af mere DMEM / F12 oven på brøndene.
  2. Forbered stamcellevedligeholdelsesmedium ved at tilføje 50 ml 50x supplement til 450 ml stamcellevedligeholdelsesbasalmedium i det sterile miljø i et biosikkerhedsskab.
    BEMÆRK: Andre stamcellevedligeholdelsesmedier (mTeSR og E8) er blevet anvendt i andre undersøgelser 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. For at forberede 500 ml ukonditioneret medium (UM) kombineres 392,5 ml DMEM / F12 med 100 ml knock out serumerstatning (KOSR), 5 ml ikke-essentielle aminosyrer, L-glutamin i en slutkoncentration på 1 mM og 3,5 μL β-mercaptoethanol. Filtersteriliser og opbevar ved 4 °C i op til 2 uger.
  4. For at forberede 200 ml endotelcellemedium (EC) plus retinsyre (RA) plus bFGF kombineres 198 ml humant endotelserumfrit medium (hESFM), 2 ml filtersteriliseret blodpladefattigt afledt serum (PDS) og 20 ng / ml bFGF. Filtersteriliser og opbevar i op til 2 uger ved 4 °C. Lige før tilsætning til celler tilsættes 10 μM RA til EC-medium.
    BEMÆRK: Da PDS er ophørt og derfor kan være begrænset, er denne protokol blevet gennemført med succes ved hjælp af B27 i stedet for PDS 15,23,26.
  5. For at forberede 200 ml EC-medium uden RA eller bFGF kombineres 198 ml hESFM og 2 ml filtersteriliseret PDS og filtersteriliseres. Opbevares i op til 4 uger ved 4 °C.

2. Vedligeholdelse IMR90-4 cellekultur

BEMÆRK: Her bruger vi IMR90-4-cellelinjen som et eksempel, men andre inducerede pluripotente stamcellelinjer såsom CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR og CS03iCTRn2 er med succes blevet anvendt til differentiering i BEC'er 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. Kultur-iPSC'er ved 37 °C i 5 % CO 2 og vedligeholdes typisk på 6-brøndsplader ved forskellige densiteter med2 ml stamcellevedligeholdelsesmedium pr. brønd.
  2. For vedligeholdelse af iPSC-kulturen skal du vælge en enkelt brønd til passage, der ikke er sammenflydende og har åbne mellemrum mellem kolonier.
    1. Opsug dyrkningsmediet, tilsæt 1 ml ikke-enzymatisk celledissociationsreagens, og inkuber ved 37 °C i 7 minutter. Mens inkubationen pågår, skal matrixgelopløsningen udskiftes på en ny 6-brønds plade med 2 ml frisk stamcellevedligeholdelsesmedium pr. Brønd.
    2. Aspirer forsigtigt det ikke-enzymatiske celledissociationsreagens, og pas på ikke at aspirere celler, der stadig er fastgjort til pladen.
    3. Tilsæt 6 ml stamcellevedligeholdelsesmedium og skyl brøndbunden et par gange, indtil alle celler er helt løsnet. Frø derefter den nye 6-brønds plade med varierende tætheder, typisk 1:6 eller 1:12 til normal vedligeholdelse.
      BEMÆRK: Ved hjælp af de ovennævnte forhold deles cellerne cirka to gange om ugen.
    4. Flyt pladen til inkubatoren og fordel de frøede celler ligeligt over brøndene ved at ryste pladen frem og tilbage og venstre mod højre, pause mellem skiftevis rystebevægelser, indtil mediet har lagt sig.

3. Differentiering af hjerneendotelceller fra humane iPSC'er

  1. Plettering af iPSC'er til differentiering (dag -3 i differentieringsprotokollen)
    1. I henhold til IMR90-4 vedligeholdelseskultur bruges godt til plade til differentiering, aspirer dyrkningsmediet, tilsæt 1 ml enzymatisk celledissociationsreagens pr. Brønd og inkuber ved 37 °C i 7 minutter.
    2. Det enzymatiske celledissociationsreagens inaktiveres ved at overføre 1 ml dissocieret cellesuspension til et 15 ml konisk rør med mindst 2 ml frisk stamcellevedligeholdelsesmedium pr. 1 ml celler. Centrifuger cellesuspensionen ned ved 1.500 x g i 5 min.
    3. Resuspender cellepelleten i 1 ml stamcellevedligeholdelsesmedium pr. hul IMR90-4-celler, der anvendes, og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
      BEMÆRK: Det kan være nyttigt at fortynde 1:1 med 0,4% trypanblå for at skelne mellem levende og døde celler, når man tæller. Afhængigt af tætheden af iPSC'er giver en brønd i en 6-brønds plade normalt 1-106 celler.
    4. Til differentiering i en T75-kolbe tilsættes 7,5 x 105 celler til 12 ml stamcellevedligeholdelsesmedium og ROCK-hæmmer (Y27632-dihydrochlorid) i en slutkoncentration på 10 μM. Aspirat matrix gel-coating opløsning fra en T75-kolbe og cellesuspensionen overføres til kolben. Cellerne fordeles ligeligt ved at ryste kolben frem og tilbage og fra venstre mod højre (se trin 2.2.4) og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Det er afgørende at tilføje ROCK-hæmmer på dette trin for at forbedre overlevelsen af de dissocierede enkeltstamceller25,29. Cellerne skal fordeles jævnt over kolben og i singlets, der udviser en spredt, mesenkymallignende morfologi på grund af ROCK-hæmmerbehandlingen22.
  2. På dag -2 og dag -1 skiftes medie til frisk stamcellevedligeholdelsesmedium; 12 ml pr. T75.
  3. På dag 0 skal du starte differentieringen ved at skifte medie til UM; 12 ml pr. T75.
  4. Skift UM dagligt (dag 1 – dag 5).
    BEMÆRK: Cellerne når typisk sammenløb efter 2 til 3 dage i UM, som kan observeres med det blotte øje eller gennem et omvendt lyst feltmikroskop. Efterhånden som differentieringen skrider frem, bliver nestin+ "neuralkanaler" synlige med PECAM-1+ celler imellem som tidligere beskrevet13,14.
  5. Selektivt udvide endotelcellepopulationen ved at skifte til EC-medium med 20 ng/ml bFGF og 10 μM retinsyre (RA) (dag 6) og inkubere i to dage. EF-medium med bFGF kan fremstilles op til to uger før. RA tilsættes fra frosset lager på brugsdagen (f.eks. 1 μL 10 mM RA lager pr. 1 ml EC + bFGF).
    BEMÆRK: Vellykket differentiering kan også opnås uden tilskud af RA på dag 6 og 8. Udeladelse af RA vil imidlertid give BEC'er med reduceret TEER12,13,14.
  6. Overtræk cellekulturplader og membranindsatser (f.eks. Transwell) med kollagen IV og fibronectin (dag 7) til oprensning af BEC'erne og efterfølgende eksperimenter.
    1. Til belægning af membranindsatser kombineres 4 dele kollagen IV (1 mg/ml i 0,5 mg/ml eddikesyre), 1 del fibronectin (1 mg/ml) og 5 dele sterilt vand af vævskvalitet. ECM-opløsning kan fortyndes 1: 5 til belægning af cellekulturplader (dvs. 4 dele kollagen IV, 1 del fibronectin, 45 dele vand). Der inkuberes med en overfladebehandlingsopløsning ved 37 °C natten over.
      BEMÆRK: Plader og membranindsatser kan også belægges i mindst 4 timer før subkulturering samme dag som rensningstrinnet.
  7. Rens BEC'er ved at subkulturere de differentierede celler på kollagen IV og fibronectinbelagte plader eller membranindsatser (dag 8).
    1. Opsug EC-medium og tilsæt enzymatisk celledissociationsreagens (12 ml pr. T75). Der inkuberes ved 37 °C, indtil 90% af cellerne har løsrevet sig fra kolben.
      BEMÆRK: Celledissociation kan tage op til 1 time.
    2. I løbet af inkubationstiden fjernes kollagen IV / fibronectinbelægningsopløsningen fra tidligere forberedte plader / indsatser og lad dem tørre i en steril hætte. Det tager ca. 20 minutter for indsatserne at tørre.
    3. Når cellerne har løsnet sig, vaskes kolben af med en 10 ml pipette. Pipette op og ned for at opnå en enkelt cellesuspension.
      BEMÆRK: Enkeltcellesuspension er vigtig for pålidelig celletælling og for at opnå faste monolag.
    4. Fortynd med mindst lige så meget frisk hESFM i et 50 ml konisk rør og tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer.
    5. Ppellet cellerne ved 1.500 x g i 10 min.
    6. Resuspender celler i et passende volumen frisklavet EC + bFGF + RA for at opnå en suspension på 2 x 106 celler/ml til såning på membranindsatser. Tilføj 500 μL (1 x 106 celler) oven på en 12-brønds indsats og 1,5 ml EC + bFGF + RA-medium i bunden. Til såning på plader med 24 og 48 brønde fortyndes cellesuspensionen 1:2 og tilsættes henholdsvis 500 μL (5 x 10 5 celler) og 250 μL (2,5 x 105 celler) pr. hul. Cellerne fordeles jævnt over brønden/indsatsen (se trin 2.2.4) og inkuberes ved 37 °C under 5 % CO2.
  8. Skift medier på plader/transrum til EC uden bFGF eller RA (dag 9).
  9. Udfør infektionsforsøg, TEER-måling og immunfluorescensfarvning som beskrevet i de følgende afsnit (dag 10).
    BEMÆRK: Vellykket differentierede og oprensede BEC'er når typisk peak TEER på dag 10 og udtrykker karakteristiske markører for hjerneendotelceller såsom PECAM-1 (CD31) og VE-cadherin, glukosetransportøren GLUT-1, effluxtransportører såsom p-glycoprotein og tætte forbindelseskomponenter ZO-1, Occludin og Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Se Lippmann et al., Stebbins et al. og andre for yderligere detaljer og billeder af celletyper, morfologier og ekspression af celletypespecifikke markører under differentieringsprocessen 13,14,15,16,17,19,22. Repræsentative billeder af IMR90-4-cellerne på forskellige stadier i BEC-differentieringsprocessen findes i supplerende figur 1.

4. Transendotelial elektrisk modstand (TEER) som et mål for barrieretæthed

BEMÆRK: TEER aflæses normalt på membranindsatser på dag 9 og 10 af differentiering for at bekræfte vellykket generering af barrieredannende iPSC-BEC'er (figur 1A).

  1. Placer epitelvolt-ohm-måleren (EVOM) i det sterile miljø i en biosikkerhedshætte, og tilslut elektroden til EVOM.
  2. Desinficer elektroden ved at nedsænke den i 70% EtOH i mindst 5 min og lad den tørre helt.
    BEMÆRK: Længere inkubation i 70% EtOH eller dekontaminering af elektroden ved hjælp af 5% hypochloritopløsning er mulig, hvis det er nødvendigt.
  3. Hent iPSC-BEC'erne på membranindsatser fra inkubatoren og mål TEER.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at aflæse TEER hurtigt efter fjernelse fra inkubatoren, da temperaturændringer kan påvirke TEER-målingen.
  4. Aflæs TEER ved at dyppe elektroden ned i mediet, så den kortere elektrode placeres oven på indsatsen, og den længere elektrode når ind i mediet omkring indsatsen.
    BEMÆRK: Sørg for, at elektroderne på spidsen af "spisepindene" er helt dækket af væske. Vip om nødvendigt brønden for at opnå dette, før du sætter pladen ned igen til måling.

5. Immunofluorescens (IF) farvning for at validere BEC-fænotype

BEMÆRK: For at validere kvaliteten af de fuldt differentierede og oprensede celler farves iPSC-BEC-monolag for de karakteristiske markører for hjerneendotelceller på dag 10 i differentieringsprocessen som tidligere beskrevet (figur 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. Opsug mediet og vask 1x med PBS.
  2. Fastgør celler med iskold methanol ved stuetemperatur (RT) i 15 min.
  3. Vask 3x med fosfatbufret saltvand (PBS) og bloker med 10% føtalt bovint serum (FBS) i PBS ved RT i 1 time.
  4. Aspirer og tilsæt primære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning. Der inkuberes ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: Se tabellen over materialer og Stebbins et al. for information relateret til kilde og fortynding af antistofferne22.
  5. Der vaskes 3x med PBS, før sekundært antistof tilsættes fortyndet i blokerende opløsning. Inkuber ved RT i 1 time. Beskyt prøver mod lys fra dette tidspunkt.
  6. Vask 2x med PBS. Derefter tilsættes DAPI ved en 1:5.000 fortynding i PBS og pletter ved RT i 15 minutter.
  7. Vask 1x lad PBS være tændt og tag billeder ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

6. Forberedelse af bakterier og infektion af iPSC-BEC'er

  1. Dagen før infektionseksperimentet (dag 9 af differentiering) skal du starte en natkultur af bakterierne fra frossen bestand. Ved infektion med Nm skal du stribe bakterier på Columbia agar med 5% fåreblod (blod-agar). Bakteriekulturer inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
  2. Den næste dag (dag 10) tilberedes frisk PPM+ ved at supplere Protease peptone media (PPM) med 50 μL 2 MMgCl2, 50 μL 2 M NaHCO3 og 100 μL Kelloggs tilskud pr. 10 ml. Pod 10 ml PPM+ medium i et 50 ml konisk rør med Nm fra dyrkningspladen natten over ved hjælp af en steril vatpind. Der inkuberes omrystning ved 200 o/min ved 37 °C i 1,5 timer (dvs. indtil bakterierne er i logaritmisk vækstfase).
  3. Under bakteriel inkubation fremstilles iPSC-BEC'er i en plade med 24 huller eller på membranindsatser til infektion ved at erstatte det gamle medium med 400 μL frisk EC-substrat (uden bFGF eller RA) pr. hul / toppen af membranindsatsen.
  4. Centrifuger bakteriekultur ved 4000 x g i 10 min og aspirer mediet. Bakteriepelleten resuspenderes i 250 μL PBS.
  5. I 4 ml frisk PBS anvendes en del af bakteriecellesuspensionen, og der justeres til OD600 på 0,4 (ca. 1 x 108 CFU/ml).
  6. Fortynd derefter bakterierne i cellekulturmedium (EC-medium) i henhold til den ønskede mangfoldighed af infektion (MOI).
    BEMÆRK: For eksempel for en MOI på 10 fortyndes 1:10 eller 1:5, når iPSC-BEC'er inficeres i henholdsvis en 24-brønds plade eller på membranindsatser (1 x 105 celler pr. monolag i en plade med 24 huller). Tilsætning af humant serum er ikke inkluderet i fremstillingen af Nm til infektion, som det blev beskrevet i andre manuskripter, da det blev observeret at have en skadelig virkning på iPSC-BEC-barrierefænotypen målt ved TEER (data ikke vist)30,31. Interaktionen mellem Nm og iPSC-BEC'er påvirkes dog ikke med eller uden humant serum (data ikke vist).
  7. Der inficeres iPSC-BEC'er i hvert hul med 100 μL af den tilberedte bakteriesuspension, og inkuberes på det ønskede infektionstidspunkt.
    BEMÆRK: Ekspression af en række proinflammatoriske cytokiner og kemokiner er forhøjet i iPSC-BEC'er, når de inficeres med Nm, mest fremtrædende efter 8 timers infektion som tidligere beskrevet af Martins-Gomes et al (figur 2)19.

7. Medfødt immunaktivering ved kvantitativ PCR

BEMÆRK: Brug en foretrukken RNA-isolation, cDNA-syntese og qPCR-protokol til at indsamle prøver og køre qPCR på udvalgte cytokiner.

  1. 7.1. RNA'et indsamles fra BEC-prøver efter infektion på dag 10 i differentieringsprotokollen ved hjælp af reagenser fra et kommercielt tilgængeligt RNA-isolationssæt (se materialetabellen).
    BEMÆRK: Undgå nukleasekontaminering af prøver ved at arbejde omhyggeligt i et rengjort og steriliseret miljø.
    1. Forbered lysisbuffer og tilsæt 350 μL til hvert hul / monolag af iPSC-BEC'er.
    2. Prøverne indsamles ved pipettering op og ned adskillige gange (f.eks. 20x) og overførsel af suspensionen til et sterilt mikrocentrifugeglas.
      BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til RNA-isolering.
    3. Følg protokollen, der følger med RNA-isolationssættet til RNA-oprensning fra dyrkede celler og væv.
    4. Efter eluering i nukleasefrit vand skal RNA-prøver opbevares på is for at minimere enhver potentiel RNase-aktivitet.
    5. Anslå RNA-koncentrationer på et spektrofotometer (f.eks. Nanodrop).
  2. Generer et cDNA-bibliotek fra det indsamlede RNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt (se materialetabel).
    1. Opsæt reaktioner bestående af cDNA-syntesemasterblanding, mindst 200 ng (ideelt 500 ng) prøve-RNA og nukleasefrit vand i et defineret totalt reaktionsvolumen som beskrevet i protokollen for cDNA-syntesesættet.
    2. På en standard termocykler skal du køre et program, der passer til reagenserne i det anvendte cDNA-syntesesæt. For eksempel: 25 °C i 2 min, 55 °C i 10 min, 95 °C i 1 min.
    3. Efter syntese fortyndes cDNA'et op til 1:10 i nukleasefrit vand og flyttes prøver til 4 °C for kortvarig eller -20 °C for langtidsopbevaring.
      BEMÆRK: Lavere fortynding kan være nødvendig, hvis RNA-koncentrationen var lav (f.eks. under 50 ng). Det fortyndede cDNA kan opbevares ved -20 °C i op til et år.
  3. Udfør qPCR på cDNA-prøverne rettet mod transkripter af medfødte immunresponsgener såsom cytokiner og kemokiner med omhyggeligt designede og validerede primere.
    BEMÆRK: Da primerdesign er meget vigtigt for kvaliteten af qPCR-resultater, bør primereffektiviteten testes ved at udføre en fortyndingsserie, og fraværet af flere produkter bør bekræftes på en DNA-gel.
    1. Pr. 25 μL reaktion anvendes 0,5 μL fremad og 0,5 μL omvendt primer (10 mM i nukleasefrit vand), 1 μL cDNA, 10,5 μL nukleasefri H2O og 12,5 μL qPCR master mix.
    2. Reaktionen udføres på en qPCR-maskine ved hjælp af følgende cyklerprotokol: a) 4 °C i 2 min; b) 95 °C i 15 minutter c) 95 °C i 15 s d) 60 °C i 1 min. cykle gennem c) og d) 45 gange e) valgfri smeltekurve: 30-1299 °C i trin på 1 °C 25 °C i 5 min.
    3. Til dataanalyse skal du bruge ΔΔCT-beregningen til at sammenligne cytokin- og kemokinekspressionsniveauer med et referencehusholdningsgen såsom 18S eller GAPDH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet her er tilpasset fra Stebbins et al. og fremhæver processen til at differentiere iPSC'er til hjernelignende endotelceller, der besidder BBB-egenskaber, og hvordan man bruger denne model til infektionsundersøgelser ved hjælp af iPSC-BEC'er med Nm19,22. iPSC-BEC'erne udviser tætte barriereegenskaber målt ved TEER, når de er differentieret korrekt, der ofte er større end 2000 Ω·cm2, og udtrykker endotelmarkører såsom VE-cadherin og CD31 (PECAM) (figur 1A\u2012C). Derudover udtrykker og lokaliserer de de stramme krydsmarkører Claudin-5, Occludin og ZO-1 (figur 1 D \ u2012F) og transportører som Glut-1 (figur 1G). Ved infektion med Nm reagerer iPSC-BEC'er på infektion gennem opregulering af neutrofile proinflammatoriske cytokiner målt ved qPCR såsom IL-8 (CXCL8), CXCL1, CXCL2, CCL20 og IL6 (figur 2A \u2012E). Disse repræsentative resultater viser, hvordan man sikrer, at iPSC-BEC'er differentieres pålideligt, og hvordan man undersøger iPSC-BEC'ers respons på Nm-infektion.

Figure 1
Figur 1: Karakterisering af iPSC-BEC'er. (A) TEER af to separate, individuelle differentieringer, læst på dag 9-12. Data præsenteret som gennemsnit af tre eksemplarer. Fejlbjælker repræsenterer ± SD. (B\u2012G) Repræsentative immunofluorescensdata, der viser ekspression af endotelcellemarkørerne VE-cadherin (B) og PECAM-1 (CD31; C), tætte forbindelseskomponenter Claudin-5 (D), Occludin (E) og ZO-1 (F) og glukosetransportør GLUT-1 (G). Skalabjælken repræsenterer 50 μm. Panelerne B\u2012G af denne figur er blevet brugt med tilladelse fra Kim et al. oprindeligt offentliggjort i Fluids and Barriers of the CNS, et BMC-tidsskrift17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Opregulering af cytokiner af iPSC-BECs ved infektion med Neisseria meningitidis. Repræsentative qPCR-data, der viser relativ ekspression af CXCL8 (A), CXCL1 (B), CXCL2 (C), CCL20 (D) og IL6 (E) transkripter efter 8 timers infektion, sammenlignet inficeret med uinficerede iPSC-BEC-monolag. Data præsenteret som gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Fejlbjælker repræsenterer ± SD-studerendes t-test, der bruges til at bestemme signifikans. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Denne figur er blevet ændret og brugt med tilladelse fra Martins Gomes et al., oprindeligt offentliggjort i Frontiers in Microbiology19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: IMR90-4-celler på forskellige stadier i BEC-differentieringsprocessen. Repræsentative billeder af IMR90-4-vedligeholdelseskultur klar til passage (A) og celler på forskellige stadier i BEC-differentieringsprocessen: (B) efter såning med ROCK-hæmmer (dag -2), (C) ved differentieringens begyndelse (dag 0), (D) første sammenløbsdag (dag 3), (E) afslutning af UM-fasen (dag 6), (F) før BEC-oprensning (dag 8), og (G og H) efter BEC-rensning (dag 9 og dag 10). Skalabjælken repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modellering af BEC'er og BBB har haft udfordringer, da primære og udødeliggjorte humane BEC'er in vitro har tendens til at mangle robuste barrierefænotyper. Fremkomsten af humane stamcelleteknologier har muliggjort generering af iPSC-afledte BEC-lignende celler, der bevarer forventede kendetegnende BBB-fænotyper såsom endotelmarkører, tæt krydsekspression, barriereegenskaber, respons på andre CNS-celletyper og funktionelle effluxtransportører 12,13,14,15,22, 24 , 25. Dette har gjort det muligt for forskere at udnytte BEC'er in vitro, der nøje efterligner in vivo BEC'er og modellerer forskellige sygdomme med rapporteret BBB-dysfunktion 16,17,19,20,21,32. Nm er en førende årsag til bakteriel meningitis og er et humant specifikt patogen, der mangler robuste in vivo-modeller 19. Denne begrænsning har nødvendiggjort brugen af bedre konstruerede modeller til at drive opdagelsen af ny vært-patogen interaktion mellem Nm og BBB. For nylig har vi demonstreret, at iPSC-BEC'er er en levedygtig model til at forhøre Nm-BEC-interaktion19.

Her beskriver vi en generel metode til at udlede iPSC-BEC'er og inficere med Nm, hvilket resulterer i opregulering af proinflammatoriske cytokiner, der typisk induceres af bakteriel infektion19. For afledning af iPSC-BEC'er følger vi generelt protokollen som beskrevet i Stebbins et al. for generering af iPSC-BEC'er med mindre ændringer22. Her bruger vi især StemFlex-medier i stedet for mTesR1, men begge medier kan bruges til vedligeholdelse af stamcellekulturen17. Det er blevet fastslået, at denne protokol fungerer godt med mange iPSC-linjer, men det er vigtigt, at den optimale såtæthed bestemmes for hver enkelt iPSC-linje15, 24. Til dette manuskript brugte vi IMR90-4-cellelinjen, og det blev tidligere fastslået, at 1 x 105 celler/cm2 var den optimale indledende såtæthed24. Endelig som en demonstration af identiteten af genererede BEC'er udtrykker iPSC-BEC'er forventede endotelcellemarkører og tætte kryds, mens de udviser høj TEER (figur 1) 13,14,15,24. Disse fænotyper, såvel som at være af menneskelig oprindelse, gør iPSC-BEC'er til et kraftfuldt værktøj til at forhøre Nm-BEC-interaktion.

Præparationen af Nm til infektion blev tilpasset fra tidligere publicerede metoder 19,33. For at sikre, at bakterievækstmediet ikke blev introduceret i cellekulturforsøgene, blev der udført et vasketrin og resuspension i PBS som beskrevet i metoderne. Endelig var en MOI på 10 tidligere blevet observeret for at resultere i aktivering af iPSC-BEC'er gennem en opregulering af proinflammatoriske cytokiner19. Aktivering af BEC'er som reaktion på forskellige bakterier er blevet observeret, nemlig gennem opregulering af neutrofile kemokiner og cytokiner6. Det er tidligere blevet observeret, at iPSC-BEC'er opregulerer de potente neutrofile kemoattractants IL-8, CXCL1 og CXCL2 efter infektion med gruppe B streptokokker og Nm16,19. Dette observerede respons af iPSC-BEC'er viser, at disse celler er i stand til at detektere bakterier og aktivere et medfødt immunprogram, hvilket resulterer i opregulering af cytokiner. Metoderne til påvisning af opregulering af disse cytokiner ved qPCR er veletablerede og er kort beskrevet ovenfor. Men interessant nok, mens disse proinflammatoriske cytokiner detekteres af qPCR, er koordinatproteinprodukterne enten uopdagede eller meget lave16,19. På nuværende tidspunkt er det uklart, om dette er en artefakt af iPSC-BEC-modellerne, eller om den observerede lave forekomst af cytokiner er biologisk relevant. Fremtidig forskning vil være nødvendig for at bestemme en mekanisme bag afbrydelsen mellem ekspression og sekretion.

En stor styrke ved iPSC-BEC-modellen er ekspression og lokalisering af snævre kryds, der bidrager til barrierefunktion som læst være TEER 12,13,14,15,22. Tidligere arbejde med Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus, GBS) har vist, at opregulering af Snail1 bidrager til ødelæggelsen af BBB tætte kryds in vitro og in vivo34. For nylig blev dette fund bekræftet i iPSC-BEC-modellen både med GBS og Nm, hvilket tyder på en mekanisme for, hvordan bakterier er i stand til at forstyrre BBB-integriteten under infektion16,19. Derudover blev det påvist, at Nm interagerer med CD147 på endotelceller, der fremmer bakteriel vedhæftning, og i sidste ende reorganisering af tætte kryds, der fører til barrieredysfunktion9. Vi har demonstreret, at Nm colokaliserer med CD147 i iPSC-BEC'erne, hvilket potentielt gør denne model ideel til fremtidig belysning af Nm-CD147-interaktioner, da de vedrører BBB-dysfunktion19.

Metoden præsenteret her demonstrerer differentieringen af iPSC-BEC'er fra en pluripotent stamcellekilde og anvendelse med Nm-infektion. iPSC-BEC'erne er af menneskelig oprindelse, udtrykker endotelmarkører og besidder BBB-specifikke fænotyper, hvilket gør dem til en ideel model til undersøgelse af humane specifikke patogener såsom Nm. Endelig er vi i stand til at demonstrere, at iPSC-BEC-modellen reagerer på bakteriel infektion gennem opregulering af et neutrofilt cytokinrespons. Samlet set har iPSC-BEC-modellen visse fordele i forhold til primære og udødeliggjorte modelsystemer til at undersøge værtspatogeninteraktionerne ved BBB. Yderligere arbejde bør sigte mod at belyse mekanismer for BBB ødelæggelse under bakteriel meningitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

LME støttes af DFG-forskningsuddannelsesprogrammet GRK2157 med titlen "3D Tissue Models for Study Microbial Infections by Human Pathogens" tildelt A. S-U. B.J.K. støttes af et postdoc-stipendium fra Alexander von Humboldt Foundation. Derudover anerkender vi Lena Wolter for hendes tekniske assistance i genereringen af iPSC-BEC'er i kultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Tags

Neisseria meningitidis meningokokmeningitis hjerneendotelceller værtspatogeninteraktioner in vivo-modelsystemer menneskebaseret model tætte kryds transendotelelektrisk modstand (TEER) in vitro-modeller primære BEC'er udødeliggjorte BEC'er inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) IPSC-afledte BEC'er (iPSC-BEC'er) barrieredestruktion medfødt immunaktivering bakteriel interaktion

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>Neisseria meningitidis</em> Infektion af inducerede pluripotente stamcelleafledte hjerneendotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter