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Immunology and Infection

髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61400
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

ERRATUM NOTICE

Summary

ここに記述されているプロトコルは伝染のための Neisseriaの髄膜炎 の準備、および他の分子分析のためのサンプル収集を分化させる誘導された多能性幹細胞によって得られる脳そっくりのendothelialセル、準備の主要なステップを強調する。

Abstract

髄膜炎菌性髄膜炎は、髄膜炎菌(髄 膜 炎菌、Nm)が高度に特殊化された脳内皮細胞(BEC)を貫通することにより中枢神経系(CNS)にアクセスできるときに発生する生命を脅かす感染症です。Nmはヒト特異的な病原体であるため、堅牢な in vivo モデルシステムがないため、NmとBEC間の宿主と病原体の相互作用の研究は困難であり、ネイティブBECを模倣するヒトベースのモデルの必要性が確立されています。BECは、複雑なタイトジャンクションと高い経内皮電気抵抗(TEER)を特徴とする末梢内皮細胞と比較して、より厳しいバリア特性を持っています。しかし、一次BECや不死化BECなどの多くの in vitro モデルは、天然の神経微小環境から除去した後、バリア特性を欠くか、急速に失われます。近年のヒト幹細胞技術の進歩により、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から脳様内皮細胞を誘導する方法が開発され、他の in vitro ヒトモデルと比較して表現型コピーBECが優れています。iPS細胞由来BEC(iPS細胞-BEC)を用いてNm-BEC相互作用をモデル化すると、BECバリア特性を持つヒト細胞を利用できるという利点があり、バリア破壊、自然免疫活性化、細菌間相互作用を調べることができます。ここでは、iPS細胞からiPS細胞-BECを誘導する方法と、細菌の調製、感染、解析のためのサンプル採取の方法を紹介します。

Introduction

血液脳関門(BBB)と髄膜血液CSF関門(mBCSFB)は、循環と中枢神経系(CNS)を分離する非常にタイトな細胞関門であり、主に高度に特殊化された脳内皮細胞(BEC)で構成されています1,2。BECは、多くの毒素、薬物、病原体を排除しながら、脳内外の栄養素や老廃物を調節することで、適切な脳の恒常性を維持しています1,2。細菌性髄膜炎は、血液媒介細菌がBECによって形成されたバリアと相互作用して貫通し、炎症を引き起こすことができる場合に発生します。髄膜炎菌(Nm、髄膜炎菌)は、健康な人の10〜40%の鼻咽頭にコロニーを形成するグラム陰性菌ですが、場合によっては重篤な全身性疾患を引き起こす可能性があります3。罹患した個人では、Nmは血流にアクセスして紫斑病の劇症を引き起こしたり、髄膜炎を引き起こす中枢神経系へのアクセスを得るBECに侵入したりする可能性があります3。Nmは世界中の細菌性髄膜炎の主な原因であり、ワクチン接種の努力にもかかわらず、依然として髄膜炎の主な原因です4。抗生物質治療などの現代の医学的介入により、これらの状態は生存可能になりましたが、髄膜炎に罹患した人は、多くの場合、永続的な神経学的損傷が残ります5,6。

これまでの研究では、Nm-BEC相互作用に寄与する細菌因子と宿主シグナル伝達が特定されています7,8,9,10,11。同定されたアドヒシンや、混濁タンパク質Opc、IV型線毛などの侵入因子、およびCD147などの受容体は、in vitroでさまざまなBECモデルで実施されていますが、これらのモデルには多くの決定的なBBB特性がありません7,9,11,12。Nm-BEC相互作用の完全な理解は、in vivoモデルを利用できないこと、ワクチン接種防御が不完全であること、in vitroで頑健なヒトBECモデルがないことなどにより、依然としてとらえどころのないままです。

in vitroでのhBECのモデリングは、BECのユニークな特性のために困難でした。末梢内皮細胞と比較して、BECは、複雑なタイトジャンクション12による高い経内皮電気抵抗(TEER)など、バリア特性を強化する多くの表現型を有する。一旦脳微小環境から取り除かれると、BECは急速にバリア特性を失い、弱いバリアしか形成しない一次モデルや不死化in vitroモデルの有用性が制限される12,13。Nm感染のヒト特異性、頑健なin vivoモデルの欠如、およびin vitroでのヒトBECのモデリングの課題が組み合わさることで、NmとBECの間の複雑な宿主と病原体の相互作用を理解するためのより良いモデルの必要性が生じています。最近では、モデルヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)技術を用いて、in vivoでBECをよりよく模倣したiPS細胞からBEC様細胞が作製されています12,13,14,15。iPS細胞-BECはヒト由来であり、拡張が容易であり、一次または不死化の対応物と比較して予想されるBEC表現型を持っています12,13,14,15。さらに、iPS細胞-BECは、宿主と病原体の相互作用、ハンチントン病、アラン・ハーンドン・ダドリー症候群の原因となるMCT8欠損症など、中枢神経系の様々な疾患のモデル化に有用であることを実証しています16,17,18,19,20,21.ここでは、再生可能なiPS細胞からiPS細胞BECを誘導する方法と、iPS細胞BECにNmを感染させることで自然免疫応答が活性化する様子を紹介します。このモデルは、他のin vitroモデルでは再現できない宿主と病原体の相互作用を調べるのに有用であり、Nmなどのヒト特異的な病原体との相互作用を調べる場合に特に有用であると考えています。

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Protocol

注:すべての培地/試薬の調製、幹細胞の維持、および分化のステップは、Stebbins et al.22 から適合しています。

1. iPS細胞の培養とBECの分化に必要な材料の調製

  1. IMR90-4 iPS細胞培養用組織培養(TC)プラスチックのマトリックスコーティング
    1. 基底膜マトリックスゲル(例:マトリゲル)を2.5 mgのアリコートに分注し、-20°Cで保存します。
      注:マトリックスゲルを取り扱う場合は、氷上でのアリコートは4°Cを超えるとゲルを形成し、固化すると分注できないため、迅速に作業してください。
    2. TCプラスチックをコーティングするには、50 mLのコニカルチューブに30 mLのダルベッコモディファイドイーグル培地(DMEM)/F12培地にマトリックスゲル1アリコートを素早く加えます。凍結マトリックスゲルに培地1 mLを加え、解凍されるまでピペットで上下にピペットし、残りの培地とともにすぐに50 mLのコニカルチューブに移します。
    3. このマトリックスゲルコーティング溶液は、6ウェルプレートのウェルあたり1 mL、T75フラスコあたり12 mLを使用します。
      注:マトリックスゲルコーティングされたTCプラスチックは、使用する2週間前までに準備できます。ただし、マトリックスゲル溶液が乾燥し、ウェルの上にDMEM/F12を時折追加する必要があるため、乾燥を避けることが重要です。
  2. バイオセーフティキャビネットの無菌環境で、450 mLの幹細胞維持基礎培地に50 mLの50倍サプリメントを添加して、幹細胞維持培地を調製します。
    注:他の幹細胞維持培地(mTeSRおよびE8)は、他の研究で使用されています13、14、15、22、23、24、25。
  3. 500 mL の無調培地(UM)を調製するには、392.5 mL の DMEM/F12 と 100 mL のノックアウト血清置換(KOSR)、5 mL の非必須アミノ酸、最終濃度 1 mM の L-グルタミン、および 3.5 μL の β-メルカプトエタノールを混合します。濾過滅菌し、4°Cで最大2週間保管します。
  4. 200 mLの内皮細胞(EC)培地とレチノイン酸(RA)とbFGFを調製するには、198 mLのヒト内皮血清遊離培地(hESFM)、2 mLのフィルター滅菌血小板貧血清(PDS)、および20 ng/mLのbFGFを混合します。ろ過滅菌し、4°Cで最大2週間保管します。 細胞に添加する直前に、10 μMのRAをEC培地に添加します。
    注:PDSは廃止されており、制限されている可能性があるため、このプロトコルはPDS15、23、26の代わりにB27を使用して正常に実施されています。
  5. RAまたはbFGFを含まないEC培地200 mLを調製するには、198 mLのhESFMと2 mLのフィルター滅菌済みPDSを混合し、フィルター滅菌します。4°Cで最大4週間保存してください。

2. IMR90-4細胞培養のメンテナンス

注:ここではIMR90-4細胞株を例に説明しますが、CC3、CD10、CD12、DF19-9-11T、83iCTR、00iCTR、およびCS03iCTRn2などの他の人工多能性幹細胞株がBEC 13,14,15,16,17,23,27,28への分化に成功しています。

  1. iPS細胞を5%CO2 で37°Cで培養し、通常、ウェルあたり2 mLの幹細胞維持培地を使用して、さまざまな密度で6ウェルプレート上で維持します。
  2. iPS細胞の培養を維持するためには、コンフルエントではなく、コロニー間にオープンスペースがある単一の継代用ウェルを選択します。
    1. 培地を吸引し、1 mLの非酵素的細胞解離試薬を加え、37°Cで7分間インキュベートします。インキュベーションの進行中に、新しい6ウェルプレート上のマトリックスゲル溶液を、ウェルあたり2 mLの新鮮な幹細胞維持培地と交換します。
    2. 非酵素的細胞解離試薬は、プレートに付着したままの細胞を吸引しないように注意しながら慎重に吸引します。
    3. 6 mLの幹細胞維持培地を加え、すべての細胞が完全に剥離するまでウェルの底を数回すすぎます。次に、新しい6ウェルプレートにさまざまな密度(通常は1:6または1:12)を播種します。
      注:前述の比率を使用して、セルは週に約2回分割されます。
    4. プレートをインキュベーターに移動し、プレートを前後左右に振って、培地が落ち着くまで交互に振とう運動の合間に一時停止して、播種した細胞をウェル全体に均等に分配します。

3. ヒトiPS細胞からの脳内皮細胞の分化

  1. 分化のためのiPS細胞のプレーティング(分化プロトコルの-3日目 )
    1. 分化のためにプレーティングするために使用したIMR90-4メンテナンス培養ウェルに従い、培地を吸引し、ウェルあたり1 mLの酵素細胞解離試薬を添加し、37°Cで7分間インキュベートします。
    2. 1 mLの解離細胞懸濁液を、細胞1 mLあたり少なくとも2 mLの新鮮な幹細胞維持培地を含む15 mLのコニカルチューブに移して、酵素細胞解離試薬を不活性化します。細胞懸濁液を1,500 x g で5分間スピンダウンします。
    3. 使用したIMR90-4細胞のウェルあたり1 mLの幹細胞維持培地に細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
      注:0.4%トリパンブルーで1:1に希釈すると、カウント時に生細胞と死細胞を区別するのに役立ちます。iPS細胞の密度にもよりますが、6ウェルプレートの1ウェルで通常1-10 x6 個の細胞が得られます。
    4. T75フラスコで分化させるには、7.5 x 105 細胞を12 mLの幹細胞維持培地とROCK阻害剤(Y27632二二塩酸塩)を最終濃度10 μMで添加します。 T75フラスコからマトリックスゲルコーティング溶液を吸引し、細胞懸濁液をフラスコに移します。フラスコを前後左右に振って細胞を均等に分配し(ステップ2.2.4を参照)、37°C、5%CO2でインキュベートします。
      注:解離した単一幹細胞の生存率を高めるために、このステップでROCK阻害剤を追加することが重要です25,29。細胞は、フラスコ全体およびROCK阻害剤処理22による広がりの間葉系様形態を示すシングレットに均等に分布している必要があります。
  2. -2日目と-1日目に、培地を新鮮な幹細胞維持培地に交換します。T75あたり12 mL。
  3. 0 日目に、メディアを UM に変更して区別を開始します。T75あたり12 mL。
  4. UM を毎日変更します (1 日目から 5 日目)。
    注:細胞は通常、UMで2〜3日後に合流点に達し、肉眼または倒立明視野顕微鏡で観察できます。分化が進むにつれて、前述のように、nestin+の「神経管」がPECAM-1+細胞を挟んで見えるようになります13,14。
  5. 20 ng/mL bFGF および 10 μM レチノイン酸(RA)を含む EC 培地に切り替え(6 日目)、2 日間インキュベートすることにより、内皮細胞集団を選択的に増殖させます。bFGFを含むEC培地は、2週間前まで調製できます。RAは、使用日に凍結ストックから添加される(例えば、EC + bFGF1 mLあたり10 mM RAストック1 μL)。
    注:6日目と8日目にRAを補充しなくても、分化を成功させることができます。ただし、RAを省略すると、TEER 12、13、14が低下したBECが得られます。
  6. 細胞培養プレートおよびメンブレンインサート(Transwellなど)をコラーゲンIVおよびフィブロネクチンでコーティングし(7日目)、BECの精製およびその後の実験を行います。
    1. メンブレンインサートのコーティングには、IVコラーゲン4部(0.5 mg/mL酢酸1 mg/mL)、フィブロネクチン1部(1 mg/mL)、5部の滅菌組織グレードの水を混ぜ合わせます。ECM溶液は、細胞培養プレートをコーティングするために1:5に希釈できます(すなわち、IVコラーゲン4部、フィブロネクチン1部、水45部)。コーティング液と37°Cで一晩インキュベートします。
      注:プレートとメンブレンインサートは、精製ステップの同じ日に継代培養する前に少なくとも4時間コーティングすることもできます。
  7. 分化した細胞をコラーゲンIVおよびフィブロネクチンでコーティングされたプレートまたはメンブレンインサートで継代培養することにより、BECを精製します(8日目)。
    1. EC培地を吸引し、酵素細胞解離試薬(T75あたり12 mL)を添加します。細胞の90%がフラスコから剥離するまで37°Cでインキュベートします。
      注:細胞の解離には最大1時間かかる場合があります。
    2. インキュベーション時間中に、コラーゲンIV/フィブロネクチンコーティング溶液を事前に調製したプレート/インサートから取り出し、滅菌フードで乾燥させます。インサートが乾くのに約20分かかります。
    3. 細胞が剥離したら、10 mLピペットを使用してフラスコから洗い流します。ピペットを上下に動かして、単一細胞懸濁液を実現します。
      注:単一細胞懸濁液は、信頼性の高い細胞カウントと固体単層の達成に重要です。
    4. 50 mLのコニカルチューブで少なくとも等量の新鮮なhESFMで希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
    5. 細胞を1,500 x gで10分間ペレットします。
    6. 新規調製したEC + bFGF + RAを適切な量の細胞に再懸濁し、メンブレンインサートに播種するために2 x 106細胞/mLの懸濁液を得ます。12ウェルインサートの上に500 μL(1 x 106細胞)を、底面に1.5 mLのEC + bFGF + RA培地を加えます。24ウェルプレートおよび48ウェルプレートに播種する場合は、細胞懸濁液を1:2に希釈し、ウェルあたりそれぞれ500 μL(5 x 10 5細胞)および250 μL(2.5 x 105細胞)を加えます。ウェル/インサート全体に細胞を均等に分配し(ステップ2.2.4を参照)、5%CO2下で37°Cでインキュベートします。
  8. プレート/トランズウェル上の培地を、bFGFまたは RAを含まない ECに交換します(9日目)。
  9. 次のセクション(10日目)で説明するように、感染実験、TEER測定、および免疫蛍光染色を実施します。
    注:分化および精製に成功したBECは、通常、10日目にピークTEERに達し、PECAM-1(CD31)やVE-カドヘリンなどの脳内皮細胞、グルコーストランスポーターGLUT-1、p-糖タンパク質などの排出トランスポーター、およびタイトジャンクションコンポーネントZO-1、オクルージン、およびクローディン-5の特徴的なマーカーを発現します13、14、16、17、19、22.分化過程における細胞型、形態、および細胞型特異的マーカーの発現の詳細および画像については、Lippmann et al.、Stebbins et al.などを参照されたい13,14,15,16,17,19,22。BEC分化過程のさまざまな段階におけるIMR90-4細胞の代表的な画像を補足図1に示します。

4.バリア気密性の尺度としての経内皮電気抵抗(TEER)

注:TEERは通常、分化の9日目と10日目にメンブレンインサートで読み取られ、バリア形成iPS細胞-BECの作製が成功したことを確認します(図1A)。

  1. 上皮型ボルトオーム計(EVOM)をバイオセーフティフードの無菌環境に置き、電極をEVOMに接続します。
  2. 電極を70%EtOHに少なくとも5分間浸して消毒し、完全に乾燥させます。
    注:必要に応じて、70% EtOH中での長時間のインキュベート、または5%次亜塩素酸塩溶液を使用した電極の除染が可能です。
  3. インキュベーターからメンブレンインサート上のiPS細胞-BECを回収し、TEERを測定します。
    注意: 温度変化がTEER測定に影響を与える可能性があるため、インキュベーターから取り出した後、TEERをすばやく読み取ることが重要です。
  4. 短い電極がインサートの上に置かれ、長い電極がインサートを囲む媒体に届くように、電極を媒体に浸してTEERを読み取ります。
    注意: 「箸」の先端にある電極が液体で完全に覆われていることを確認してください。必要に応じて、ウェルを傾けてこれを達成してから、プレートを再度置いて測定します。

5. BEC表現型を検証するための免疫蛍光(IF)染色

注:完全に分化および精製された細胞の品質を検証するために、前述のように、分化プロセスの10日目にiPSC-BEC単分子膜を染色して、分化プロセスの10日目に脳内皮細胞の特徴的なマーカーについて染色します(図1B\u2012G)13、14、15、16、17、19、22。

  1. 培地を吸引し、PBSで1回洗浄します。
  2. 室温(RT)で氷冷メタノールで15分間細胞を固定します。
  3. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、10%ウシ胎児血清(FBS)をPBSに溶かして室温で1時間ブロックします。
  4. ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を吸引し、添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
    注:抗体の供給源および希釈液に関する情報については、 材料表 およびStebbins et al.を参照してください22。
  5. ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を添加する前に、PBSで3回洗浄します。室温で1時間インキュベートします。この時点からサンプルを光から保護します。
  6. PBSで2回洗浄します。次に、DAPIをPBSに1:5,000希釈で添加し、室温で15分間染色します。
  7. PBSをつけたまま1回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像を撮影します。

6. 細菌の調製とiPS細胞-BECの感染

  1. 感染実験の前日(分化9日目 )に、冷凍ストックから細菌の一晩培養を開始します。Nmに感染するには、5%のヒツジの血液(血液寒天培地)でコロンビア寒天培地に細菌をストリークします。細菌培養物を37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。
  2. 翌日(10日目)に、プロテアーゼペプトン培地(PPM)に50 μLの2 M MgCl 2、50 μLの2 M NaHCO3、および10 mLあたり100 μLのケロッグサプリメントを添加して、新鮮なPPM+を調製します。滅菌綿棒を使用して、50 mLのコニカルチューブに10 mLのPPM+培地に一晩培養プレートからNmを接種します。200rpm、37°C、1.5時間(すなわち、細菌が対数増殖期になるまで)振とうインキュベートします。
  3. 細菌のインキュベーション中に、24ウェルプレートまたはメンブレンインサート上で、古い培地を400 μLの新鮮なEC培地(bFGFまたはRAを含まない)と交換することにより、感染用にiPSC-BECを調製します。
  4. 細菌培養液を4000 x g で10分間遠心分離し、培地を吸引します。バクテリアペレットを250μLのPBSに再懸濁します。
  5. 4 mL の新鮮 PBS に、細菌細胞懸濁液の一部を使用し、OD600 が 0.4 になるように調整します(約 1 x 108 CFU/mL)。
  6. 次に、細胞培養培地(EC培地)中の細菌を、所望の感染数(MOI)に応じて希釈します。
    注:例えば、MOIが10の場合、iPS細胞-BECを24ウェルプレートまたはメンブレンインサートに感染させる場合は、それぞれ1:10または1:5に希釈します(24ウェルプレートの単層あたり1 x 105細胞)。ヒト血清の添加は、TEERで測定されたiPSC-BECバリア表現型に有害な影響を与えることが観察されたため、他の論文に記載されているように、感染のためのNmの調製には含まれていません(データは示されていません)30,31。しかし、NmとiPS細胞-BECの相互作用は、ヒト血清の有無にかかわらず影響を受けません(データは示していません)。
  7. 各ウェルのiPSC-BECに調製した細菌懸濁液100μLを感染させ、希望の感染時間インキュベートします。
    注:iPS細胞-BECでは、Nmに感染した場合、多くの炎症性サイトカインとケモカインの発現が上昇し、Martins-Gomesら(図2)19によって以前に報告されたように、感染から8時間後に最も顕著に上昇します。

7. 定量PCRによる自然免疫活性化

注:優先 RNA 単離、cDNA 合成、および qPCR プロトコルを使用して、サンプルを収集し、選択したサイトカインで qPCR を実行します。

  1. 7.1. 市販のRNA単離キット(材料表を参照)の試薬を使用して、分化プロトコルの10日目に感染後のBECサンプルからRNAを採取します。
    注:サンプルのヌクレアーゼ汚染は、洗浄・滅菌された環境で慎重に作業してください。
    1. 溶解緩衝液を調製し、iPS細胞-BECの各ウェル/単層に350 μLを添加します。
    2. ピペッティングを何度も(例:20回)ピペッティングし、懸濁液を滅菌微量遠心チューブに移してサンプルを回収します。
      注:サンプルは、RNA単離の準備が整うまで-80°Cで保存できます。
    3. 培養細胞および組織からのRNA精製のためのRNA単離キットに付属のプロトコルに従ってください。
    4. ヌクレアーゼフリー水に溶出した後は、RNAase活性を最小限に抑えるために、RNAサンプルを氷上に保管してください。
    5. 分光光度計(Nanodropなど)でRNA濃度を推定します。
  2. cDNA合成キットを使用して、収集したRNAからcDNAライブラリを生成します( 材料表を参照)。
    1. cDNA合成マスターミックス、少なくとも200 ng(理想的には500 ng)のサンプルRNA、およびヌクレアーゼフリーの水からなる反応を、cDNA合成キットのプロトコルに記載されているように、定義された総反応量でセットアップします。
    2. 標準的なサーモサイクラーで、使用するcDNA合成キットの試薬に適したプログラムを実行します。例:25°Cで2分、55°Cで10分、95°Cで1分。
    3. 合成後、cDNAをヌクレアーゼフリーの水で最大1:10に希釈し、サンプルを4°C(短期保存)または-20°C(長期保存)に移します。
      注:RNA濃度が低い場合(例:50 ng未満)は、希釈率を下げる必要があります。希釈したcDNAは、-20°Cで最長1年間保存できます。
  3. サイトカインやケモカインなどの自然免疫応答遺伝子の転写産物を標的とするcDNAサンプルに対して、慎重に設計および検証されたプライマーを用いてqPCRを実施します。
    注:プライマーの設計はqPCR結果の品質にとって非常に重要であるため、プライマーの効率は希釈シリーズを実施してテストし、複数の生成物がないことをDNAゲルで確認する必要があります。
    1. 反応液25 μLあたり、0.5 μLのフォワードプライマーと0.5 μLのリバースプライマー(ヌクレアーゼフリー水溶液10 mM)、cDNA、ヌクレアーゼフリーのH2Oを10.5 μL、qPCRマスターミックス12.5 μLを使用します。
    2. 以下のサイクラープロトコルを使用して、qPCRマシンで反応を行います:(a)4°Cで2分間。(b)95°Cで15分間。(c)95°Cで15秒。(d)60°Cで1分間。(c)と(d)を45回繰り返します。(e)オプションの融解曲線:30-1°C刻みで30-c。25°Cで5分間
    3. データ解析では、ΔΔCT計算を使用して、サイトカインおよびケモカインの発現レベルを、18SやGAPDHなどの参照ハウスキーピング遺伝子と比較します。

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Representative Results

ここで説明するプロトコルは、Stebbinsらから採用され、iPS細胞をBBB特性を持つ脳様内皮細胞に分化させるプロセスと、このモデルをNm19,22のiPSC-BECを用いた感染症研究に利用する方法に焦点を当てています。iPS細胞-BECは、適切に分化すれば、TEERで測定した2000 Ωcm2を超えるタイトなバリア特性を示し、VEカドヘリンやCD31(PECAM)などの内皮マーカーを発現します(図1A\u2012C)。さらに、タイトジャンクションマーカーであるクローディン-5、オクルジン、ZO-1(図1 D-2012F)、およびGlut-1(図1G)などのトランスポーターを発現および局在化します。Nmに感染すると、iPS細胞-BECは、IL-8(CXCL8)、CXCL1、CXCL2、CCL20、IL6などの好中球性炎症性サイトカインのアップレギュレーションを介して感染に応答します(図2A\u2012E)。これらの代表的な結果は、iPS細胞-BECを確実に分化させる方法と、Nm感染に対するiPS細胞-BECの応答を調べる方法を示しています。

Figure 1
図1:iPS細胞-BECの特性評価。 (A)9 〜12日目に読まれる、2つの別々の個体差のTEER。データは三重の平均として表されます。エラーバーは±SDを表します。 (B\u2012G) 内皮細胞マーカーVE-cadherin(B)およびPECAM-1(CD31; C)、タイトジャンクション成分のクローディン-5(D)、オクルージン(E)、およびZO-1(F)、およびグルコーストランスポーターGLUT-1(G)。スケールバーは50μmを表します。この図のパネルB\u2012Gは、Kimらの許可を得て使用されており、BMCジャーナル17のFluids and Barriers of the CNSに掲載されたものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:髄膜炎菌感染時のiPS細胞BECによるサイトカインのアップレギュレーション。感染8時間後のCXCL8(A)、CXCL1(B)、CXCL2(C)、CCL20(D)、IL6(E)転写産物の相対発現を示す代表的なqPCRデータで、感染したiPS細胞と感染していないiPS細胞-BEC単分子膜を比較しました。 データは、3回に分けて実施した3つの独立した実験の平均値として提示されています。エラーバーは±有意性を判断するために使用される S.D. スチューデントの t 検定を表します。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001 です。この図は、Frontiers in Microbiology19に掲載されたMartins Gomesらの許可を得て修正し、使用しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図1:BEC分化過程のさまざまな段階にあるIMR90-4細胞。(A)およびBEC分化過程のさまざまな段階にある維持IMR90-4培養物の代表的な画像:(B)ROCK阻害剤による播種後(-2日目)、(C)分化開始時(0日目)、(D)合流初日(3日目)、(E)UM期の終わり(6日目)、(F)BEC精製前(8日目)、 BEC精製後(9日目および10日目)の(GおよびH)。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Discussion

BECとBBBのモデリングには課題があり、一次および不死化ヒトBECは、in vitroでは頑健なバリア表現型を欠く傾向があります。ヒト幹細胞技術の出現により、内皮マーカー、タイトジャンクション発現、バリア特性、他のCNS細胞タイプへの応答、機能的排出トランスポーターなどの期待される特徴的なBBB表現型を保持するiPS細胞由来のBEC様細胞の作製が可能になりました12,13,14,15, 22, 24, 25。これにより、研究者はin vivo BECを厳密に模倣したin vitroでBECを利用し、BBB機能障害が報告されているさまざまな疾患をモデル化できるようになりました16、17、19、20、21、32。Nmは細菌性髄膜炎の主な原因であり、in vivoモデル19の頑健性を欠いているヒト特異的な病原体です。この制限により、NmとBBBの間の新しい宿主と病原体間の相互作用の発見を促進するために、より優れた工学モデルの使用が必要でした。最近、我々は、iPS細胞-BECがNm-BEC相互作用を調べるための実行可能なモデルであることを実証した19。

ここでは、iPS細胞-BECを誘導し、Nmを感染させ、細菌感染によって典型的に誘導される炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらす一般的な方法を説明する19。iPS細胞-BECの導出については、StebbinsらがiPS細胞-BECを作製するためのプロトコルに概ね従うが、若干の修正が加えられている22。特にここでは、mTesR1の代わりにStemFlex培地を使用していますが、幹細胞培養の維持にはどちらの培地でも使用できます17。このプロトコルは多くのiPS細胞株で良好に機能することが確立されていますが、個々のiPS細胞株ごとに最適な播種密度を決定することが重要です15、24。この原稿では、IMR90-4細胞株を使用し、1 x 105 cells/cm2が最適な初期播種密度24であることが以前に確立されました。最後に、産生されたBECの同一性を示すものとして、iPS細胞-BECは、高いTEERを示しながら、期待される内皮細胞マーカーとタイトジャンクションを発現します(図1)13,14,15,24。これらの表現型は、ヒト由来であることから、iPS細胞-BECをNm-BEC相互作用を調べるための強力なツールとなっています。

感染のためのNmの調製は、以前に発表された方法19,33から適応された。細菌増殖培地が細胞培養実験に持ち込まれないようにするために、洗浄ステップおよびPBSでの再懸濁を、方法に記載のとおりに実施した。最後に、MOIが10であれば、炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを介してiPS細胞-BECが活性化されることが以前に観察されていた19。様々な細菌に応答するBECの活性化は、好中球性ケモカインとサイトカインのアップレギュレーションを介して観察されています6。iPS細胞-BECは、B群連鎖球菌に感染した後、強力な好中球走化物質IL-8、CXCL1、CXCL2、およびNm16,19に感染すると、強力な好中球走化物質がアップレギュレーションされることがこれまでに観察されています。iPS細胞-BECのこの観察された応答は、これらの細胞が細菌を検出し、自然免疫プログラムを活性化してサイトカインのアップレギュレーションを行うことができることを示しています。qPCRによってこれらのサイトカインのアップレギュレーションを検出する方法は十分に確立されており、上記で簡単に説明します。しかし、興味深いことに、これらの炎症誘発性サイトカインはqPCRによって検出されますが、配位タンパク質産物は検出されないか、非常に低いです16,19。現在のところ、これがiPSC-BECモデルのアーティファクトなのか、それとも観察されたサイトカインの存在量の低さが生物学的に関連しているのかは不明です。発現と分泌の乖離のメカニズムを解明するには、今後の研究が必要です。

iPS細胞-BECモデルの大きな強みは、TEER 12,13,14,15,22のようにバリア機能に寄与するタイトジャンクションの発現と局在化です。Streptococcus agalactiae(グループB連鎖球菌、GBS)を用いた以前の研究では、カタツムリ1のアップレギュレーションがin vitroおよびin vivoでのBBBタイトジャンクションの破壊に寄与していることが実証されています34。最近では、この発見はiPS細胞-BECモデルの両方で確認され、GBSとNmは、細菌が感染中にBBBの完全性を破壊するメカニズムを示唆しています16,19。さらに、Nmが内皮細胞上のCD147と相互作用し、細菌の接着を促進し、最終的にはタイトジャンクションの再編成を促進してバリア機能不全を引き起こすことが実証されました9。我々は、NmがiPS細胞-BECにおいてCD147と共局在することを示しており、このモデルはBBB機能障害に関連するNm-CD147相互作用の将来の解明に理想的である可能性がある19。

今回紹介する手法は、多能性幹細胞由来からのiPS細胞-BECの分化と、Nm感染への応用を実証するものです。iPS細胞-BECはヒト由来であり、内皮マーカーを発現し、BBB特異的な表現型を有するため、Nmなどのヒト特異的病原体の検査に理想的なモデルとなります。最後に、iPS細胞-BECモデルが好中球性サイトカイン応答のアップレギュレーションを介して細菌感染に応答することを実証することができました。まとめると、iPSC-BECモデルは、BBBにおける宿主と病原体の相互作用を調べるために、一次モデルシステムや不死化モデルシステムよりも一定の利点があります。さらなる研究は、細菌性髄膜炎中のBBB破壊のメカニズムの解明を目指すべきである。

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Disclosures

著者は何も開示していません。

Acknowledgments

L.M.E.は、A.S-U.に授与された「ヒト病原体による微生物感染を研究するための3D組織モデル」と題されたDFG研究トレーニングプログラムGRK2157によってサポートされています。B.J.K.は、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団のポスドク研究員の支援を受けています。さらに、培養におけるiPS細胞-BECの作製における技術支援を行ったLena Wolter氏に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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References

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Tags

髄膜炎菌、髄膜炎菌性髄膜炎、脳内皮細胞、宿主-病原体相互作用、生体内モデルシステム、ヒトベースモデル、タイトジャンクション、経内皮電気抵抗(TEER)、In Vitroモデル、一次BEC、不死化BEC、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、IPSC由来BEC(iPSC-BEC)、バリア破壊、自然免疫活性化、細菌間相互作用

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

<em>髄膜炎菌</em> 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染
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Endres, L. M., Hathcock, S. F.,… More

Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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