Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

Il sistema nervoso centrale (SNC) è costruito da una complessa rete di neuroni e cellule gliali¹. Tra le cellule gliali, la microglia funziona come le cellule immunitarie innate del CNS^2,3. Microglia sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi nel sano CNS⁴. Microglia svolgono anche un ruolo importante nel neurosviluppo, potando le sinapsi². Le microglia sono centrali nella fisiofisiologia di diverse malattie neurologiche, tra cui, ma non limitate; Morbo di Alzheimer⁵, Morbo di Parkinson⁶,^{ictus 7}, sclerosi multipla⁸, lesione cerebrale traumatica⁹, dolore neuropatico¹⁰, lesione del midollo spinale¹¹ e tumori cerebrali come gliomas¹².

Gli studi relativi all'omeostasi e alle malattie del SNC utilizzano la microglia dei roditori a causa di una carenza di protocolli di isolamento primario di microglia umano^{13 efficienti}in termini di costi ed efficienti in termini di tempo. I microglia roditori assomigliano alla microglia umana primaria nell'espressione di geni come Iba-1, PU.1, DAP12 e M-CSF recettori e sono stati efficaci nella comprensione del cervello normale e^{malore 13}. È interessante notare che l'espressione di diversi geni immuni correlati come TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia tra microglia umana e roditore¹³. L'espressione di diversi geni varia anche nell'espressione temporale e nelle malattie neurodegenerative in entrambe le^{specie 14,15}. Queste differenze significative rendono la microglia umana un modello essenziale per studiare la funzione della microglia nell'omeostasi e nella malattia. La microglia umana primaria può anche essere uno strumento efficace per lo screening preclinico dei potenziali candidati ai farmaci¹⁶. Le ragioni di cui sopra sottolineano la crescente necessità di protocolli convenienti per l'isolamento della microglia umana primaria.

Abbiamo sviluppato un protocollo per l'isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale umano adulto raccolto a seguito di una finestra chirurgica creata per le resezioni tumorali o altre resezioni chirurgiche. Il metodo in questo caso è notevolmente diverso dai metodi esistenti. Siamo stati in grado di isolare e coltura microglia dopo un tempo di transito di circa 75 minuti dal sito di raccolta dei tessuti per avviare il protocollo di isolamento in laboratorio. Abbiamo usato il supernatant di cellule fibroblasti L929 per promuovere la crescita di microglia isolata. Questo metodo si concentra specificamente sulla cultura e lo sviluppo di solo microglia primaria. La coltura risultante è di circa l'80% di microglia. Mentre altri protocolli forniscono una coltura arricchita di microglia per centrifugazione gradiente di densità, citometria di flusso e perline magnetiche, il protocollo è un modo rapido, semplice, robusto ed economico per coltura primaria microglia^{umana 17,18,19,20}. La capacità di utilizzare il tessuto cerebrale adulto vivo rimosso chirurgicamente invece di tessuti cerebrali fissi dai cadaveri dimostra un ulteriore vantaggio di questo metodo in contrasto con le procedure^{esistenti 18,21}.

Tutti i tessuti sono stati acquisiti dopo l'autorizzazione etica dai comitati etici dell'Indian Institute of Technology Jodhpur e dell'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.

1.Acquisizione ed elaborazione dei tessuti (giorno 0)

1. Raccogliere il tessuto in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio (aCSF) (2 mM CaCl₂∙2H₂O, 10 mM glucosio, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 202 mM saccarosio)²⁰. Assicurarsi che il tubo sia conservato sul ghiaccio se il tessuto deve essere trasferito in una posizione diversa.
   NOTA: Preparare l'ACSF in acqua distillata autoclave. Filtrare con il filtro della siringa da 0,22 m nella cappa laminare. Questo può essere conservato per 1 mese a 4 gradi centigradi.
2. Pulire attentamente il tubo di raccolta con il 70% di alcol e trasferirlo in una camera a flusso d'aria laminare attico.
3. Scartare aCSF con attenzione e pesare il tessuto in una condizione asetica. Il peso del tessuto è essenziale per calcolare il volume di trypsin-EDTA necessario per i passaggi successivi.
4. Mantenere il tessuto in aCSF fresco caldo a 37 gradi centigradi per 5 minuti. Questo passaggio è fondamentale per evitare la morte delle cellule.
5. Scartare l'aCSF e lavare il tessuto una volta con 1x PBS (salina tamponata di fosfato) a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che tutto il sangue sia lavato via con ripetuti lavaggi PBS (se necessario).
6. Incubare il tessuto in PBS caldo, a 37 gradi centigradi, per 5 min.
7. Scartare pbS con attenzione e trasferire il tessuto in un piatto Petri sterilizzato. PBS può essere rimosso con una pipetta. Questo impedirà qualsiasi perdita di tessuto.
8. Tagliare a dadini il tessuto in piccoli (almeno 1 mm³) pezzi utilizzando un bisturi sterile. Il tessuto tagliato finemente fornisce una superficie tissunte più elevata per la dissociazione dei tessuti mediante la trypsina-EDTA garantendo una resa più elevata.
9. Trasferire il tessuto tagliato a dadini in un tubo da 50 mL contenente un tessuto a 10 mL/g di 0,25% di trypsin-EDTA e mescolare mediante pipetta da 10 mL. Aggiungere 2 mL di trypsin/EDTA a un piatto Petri e lavare accuratamente il piatto con l'aiuto di pipetta. Aggiungere questa trypsin di nuovo al tubo di falco. Questo riduce al minimo la perdita di tessuto e cellule durante la morte.
10. Incubare il tubo su uno shaker per 30 minuti a 37 gradi centigradi a 250 giri/min. Questo passaggio aumenta la dissociazione delle cellule dal tessuto.
11. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 10 mL di mezzo neutralizzante (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS) per neutralizzare la metapsina. Mescolare con una pipetta sierologica da 10 mL. La quantità di supporti di neutralizzazione aggiunti deve essere uguale alla quantità di trypsin utilizzata.
12. Centrifugare il tubo a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 minuti.
13. Scartare il supernatante e ri-sospendere il pellet in 1 mL di media coltura (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 20% L929 supernante, 10% FBS).
    NOTA: le cellule L929 sono coltura in DMEM (DMEM con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS). Il metodo di coltura consigliato da ATCC deve essere seguito per le impostazioni cultura delle celle. Supernatant deve essere raccolto dal fiaschetta di coltura che è almeno 75% confluente. Può essere raccolto alla rinfusa e conservato a -80 gradi centigradi per prevenire il degrado dei fattori di crescita. Si consiglia di aggiungere L929 supernatant separatamente in flaconi invece di aggiungere al supporto di coltura stock.
14. Placcare le cellule in un pallone T-25, adatto per le cellule aderenti, e aggiungere 4 mL di mezzo di coltura aggiuntivo. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO₂. Agitare con cura il flacone per disperdere omogeneamente il tessuto. Evitare di portare il supporto al collo del flacone, mentre agitare, in quanto questo può aumentare le probabilità di contaminazione.

2.Coltura cellulare (Giorno 2)

1. Raccogliere i supporti dal flacone di coltura T-25 preparato il giorno 0 in tre tubi centrifuga da 1,5 mL raccogliendo lo stesso volume di supporti in ogni tubo. Lavare il pallone una volta con 1 x PBS. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere eventuali frammenti di tessuto residuo rimasti. Evitare di agitare duramente il pallone in quanto eventuali frammenti residui non influenzeranno negativamente la coltura. Aggiungere supporti di 5 mL di coltura fresca al pallone.
2. Centrifugare i supporti raccolti a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 gradi centigradi per 4 minuti.
3. Scartare il supernatant da ogni tubo e aggiungere 1 mL di mezzo di coltura a uno dei tubi. Mescolare accuratamente con pipetta. Aggiungere in serie il supporto misto con le cellule ad altri tubi. Mescolare accuratamente con pipetta e mettere in comune le celle in un tubo.
4. Piastrare le cellule in un pallone T-25 separato, adatto per le cellule aderenti. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura e incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO₂.

3.Coltura cellulare (Giorno 4)

1. Scartare il supporto da entrambi i flaconi e aggiungere nuovi 5 mL di supporti di coltura al flacone.
2. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ per 2 giorni.

4. Cultura cellulare (Giorno 6)

1. Le cellule saranno pronte per ulteriori esperimenti.

Utilizzando il protocollo di cui sopra (Figura 1), siamo stati in grado di isolare microglia umana primaria da tessuti cerebrali in tempo reale chirurgicamente resected. Le cellule colturate sono state macchiate con Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina per microglia (verde) e con proteina acida fibrillante gliale (GFAP) per gli astrociti(rosso) (Figura 2) come descritto inprecedenza 22,23,24,25,26. 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) è stato utilizzato per macchiare i nuclei (blu). Il sesto giorno dall'inizio dell'esperimento le cellule erano pronte per ulteriori esperimenti. Le cellule macchiate sono state conteggiate cieche per microglia e astrociti presenti nella coltura. Circa l'80% della coltura primaria era microglia (Figura 2).

Figura 1: Schema dell'isolamento primario della microglia dal cervello adulto. Il tessuto rimosso chirurgicamente è stato raccolto in ghiaccio freddo 10 mL di aCSF in un tubo da 50 mL e trasferito in laboratorio. Il tessuto è stato lavato rispettivamente con aCSF e PBS e tagliato a dadini finemente, dissociato con l'aiuto di trypsin-EDTA e placcato in una fiaschetta T-25. Il secondo giorno i media sono stati raccolti e centrifugati. Pellet è stato mescolato in supporti freschi e placcato in un pallone T-25. Il supporto fresco è stato aggiunto al primo flacone. I supporti sono stati cambiati in entrambi i flaconi in giorni alternati. Le cellule erano pronte per ulteriori esperimenti il giorno 6. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immunocitochimica della microglia umana primaria isolata. (A) Le cellule isolate sono state placcate in uno scivolo a due camere ben macchiate e sono state macchiate con GFAP per astrociti (pannello verde-primo) o RCA per microglia (pannello verde-secondo). Nuclei erano macchiati di blu con DAPI. Il controllo per la RCA e il controllo degli anticorpi secondari per GFAP è mostrato in inset. (B) Le cellule isolate sono state placcate in uno scivolo a due camere ben e sono state macchiate con RCA per microglia (verde) e GFAP per astrociti (rosso). La seconda riga mostra il controllo per la RCA e il controllo degli anticorpi secondari per GFAP. Nuclei erano macchiati di blu con DAPI. (C) Le celle sono state conteggiate dal controllo cieco. La quantificazione è rappresentativa del conteggio da parte di un controllo cieco. Circa l'80% delle cellule erano microglia. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.