Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.
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Articolo metodologico
Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microglia sono cellule immunitarie innate residenti del sistema nervoso centrale (SNC). Microglia svolgono un ruolo fondamentale durante lo sviluppo, nel mantenimento dell'omeostasi e durante l'infezione o lesioni. Diversi gruppi di ricerca indipendenti hanno evidenziato il ruolo centrale che la microglia svolgono nelle malattie autoimmuni, nelle sindromi autoinfiammatori e nei tumori. L'attivazione della microglia in alcune malattie neurologiche può partecipare direttamente a processi patogeni. La microglia primaria è un potente strumento per comprendere le risposte immunitarie nel cervello, le interazioni tra cellule cellulari e i fenotipi di microglia disregolati nella malattia. Le microglia primarie imitano le proprietà microgliali in vivo meglio delle linee cellulari microgliali immortalate. La microglia adulta umana presenta proprietà distinte rispetto alla microglia fetale e roditore umana. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per l'isolamento della microglia primaria dal cervello umano adulto. Lo studio di questi microglia può fornire informazioni critiche sulle interazioni tra microglia e altre popolazioni cellulari residenti nel SNC, tra cui oligodendrociti, neuroni e astrociti. Inoltre, microglia da diversi cervelli umani possono essere colturati per caratterizzazione di risposte immunitarie uniche per la medicina personalizzata e una miriade di applicazioni terapeutiche.
Introduzione
Il sistema nervoso centrale (SNC) è costruito da una complessa rete di neuroni e cellule gliali1. Tra le cellule gliali, la microglia funziona come le cellule immunitarie innate del CNS2,3. Microglia sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi nel sano CNS4. Microglia svolgono anche un ruolo importante nel neurosviluppo, potando le sinapsi2. Le microglia sono centrali nella fisiofisiologia di diverse malattie neurologiche, tra cui, ma non limitate; Morbo di Alzheimer5, Morbo di Parkinson6
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Protocollo
Tutti i tessuti sono stati acquisiti dopo l'autorizzazione etica dai comitati etici dell'Indian Institute of Technology Jodhpur e dell'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisizione ed elaborazione dei tessuti (giorno 0)
- Raccogliere il tessuto in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glucosio, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM saccarosio)20. Assicurarsi che il tubo sia conservato sul ghiaccio se....
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Risultati
Utilizzando il protocollo di cui sopra (Figura 1), siamo stati in grado di isolare microglia umana primaria da tessuti cerebrali in tempo reale chirurgicamente resected. Le cellule colturate sono state macchiate con Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina per microglia (verde) e con proteina acida fibrillante gliale (GFAP) per gli astrociti(rosso) (Figura 2) come descritto inprecedenza 22
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Discussione
Microglia garantire l'omeostasi nel cervello normale e svolgere ruoli centrali nella fisiopatologia di varie malattie neurologiche4. I microglia sono centrali per il neurosviluppo e la formazione di sinapsi2. Gli studi microgliali si sono dimostrati fondamentali nella comprensione dello sviluppo e della progressione di diverse malattieneurologiche 4. La microglia roditore è il modello prevalente di scelta per gli studi primari sui microgliali, anche .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il laboratorio di SJ è stato istituito con sovvenzioni istituzionali dell'IITJ ed è finanziato da sovvenzioni del Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e del Ministero dell'Elettronica e della Tecnologia dell'Informazione dell'India (n. 4(16)/2019-ITEA). Le sezioni del tessuto cerebrale umano sono state ottenute dall'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur dopo l'autorizzazione del comitato etico istituzionale. Ringraziamo Mayank Rathor, membro B.Tech Student della Design and Arts Society IIT Jodhpur, per il supporto alla videografia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione antibiotico-antimicotica | Himedia | A002 | |
| Cloruro di calcio | Sigma | 223506 | |
| Centrifuga (4 gradi C) | Sigma | 146532 | |
| Provette da centrifuga | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubatore | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium con glutammina | Himedia | AL007S | |
| Siero fetale bovino | Himedia | RM9955 | |
| Tubo per flaconi (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluoresceina Ricinus communis agglutinina-1 | Vettore | FL-1081 | |
| Microscopio fluorescente | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield con DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP anticorpo | GA5 | 3670S | |
| Agitatore per incubatore | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 linea cellulare | ATCC | NCTC clone 929 [cellula L, L-929, derivato del ceppo L] (ATCC CCL-1) | |
| Flusso d'aria laminare | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Cloruro di magnesio | Himedia | MB040 | |
| Fosfato monosodico | Merck | 567545 | |
| Miscela di nutrienti F-12 Prosciutto Medio | Himedia | Al106S | |
| Piastra di Petri | Duran Gruppo | 237554805 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Himedia | ML023 | |
| Cloruro | di potassioHimedia | MB043 | |
| Pipetta sierologica | Labware | LW-SP1010 | |
| Bicarbonato di sodio | Himedia | MB045 | |
| Saccarosio | Himedia | MB025 | |
| Filtro per siringa (0,2μ, diametro 25 mm) | |||
| T-25 adatte per colture cellulari aderenti. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | Codice 25200-056 |
Riferimenti
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9
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Ristampe e permessi
