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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Detecção de variantes genéticas no gene CALR usando análise de fusão de alta resolução

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

A análise de fusão de alta resolução (HRM) é uma solução sensível e rápida para detecção de variantes genéticas. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes mudando a forma da curva de fusão. Ao pentear o HRM e a agarose gel eletroforesis, diferentes tipos de variantes genéticas, como indels, podem ser identificados.

Abstract

A análise de derretimento de alta resolução (HRM) é um método poderoso para genotipagem e varredura de variações genéticas. A maioria das aplicações de HRM dependem de corantes de DNA saturados que detectam diferenças de sequência, e heterodúplexos que mudam a forma da curva de fusão. Excelente resolução de instrumentos e software especial de análise de dados são necessários para identificar as pequenas diferenças de curva de fusão que identificam uma variante ou genótipo. Diferentes tipos de variantes genéticas com diversas frequências podem ser observadas no gene específico para pacientes com uma doença específica, especialmente câncer e no gene CALR em pacientes com neoplasias mieloproliferativas nômodas negativas da Filadélfia. Alterações de nucleotídeos únicos, inserções e/ou exclusões (indels) no gene de interesse podem ser detectadas pela análise do HRM. A identificação de diferentes tipos de variantes genéticas baseia-se principalmente nos controles utilizados no ensaio qPCR HRM. No entanto, à medida que o comprimento do produto aumenta, a diferença entre curvas de tipo selvagem e heterozigoto torna-se menor, e o tipo de variante genética é mais difícil de determinar. Portanto, quando os indels são a variante genética predominante esperada no gene de interesse, um método adicional como a eletroforese de gel de agarose pode ser usado para o esclarecimento do resultado do HRM. Em alguns casos, um resultado inconclusivo deve ser re-verificado/re-diagnosticado pelo sequenciamento Sanger padrão. Neste estudo retrospectivo, aplicamos o método a pacientes JAK2 V617F negativos com MPN.

Introduction

As variantes genéticas somáticas do gene da calreticulina (CALR)foram reconhecidas em 2013 em pacientes com neoplasias mieloproliferativas (MPN), como trombocythemia essencial e mielófibrose primária1,2. Desde então, mais de 50 variantes genéticas no gene CALR foram descobertas, induzindo um quadro de 3 +1 (−1+2). As duas variantes genéticas CALR mais frequentes são uma exclusão de 52 bps (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), também chamada de mutação tipo 1, e uma inserção de 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), também chamada de mutação tipo 2. Essas duas variantes genéticas representam 80% de todas as variantes genéticas CALR. Os outros foram classificados como tipo 1- like ou tipo 2 – como usando algoritmos baseados na preservação de uma hélice α perto do tipo selvagem CALR4. Aqui, apresentamos um dos métodos altamente sensíveis e rápidos para detecção de variantes genéticas CALR, o método de análise de fusão de alta resolução (HRM). Este método permite a detecção rápida de variantes genéticas tipo 1 e tipo 2, que representam a maioria das mutações CALR 5. O HRM foi introduzido em combinação com a reação em cadeia de polimerase em tempo real« (qPCR) em 1997 como uma ferramenta para detectar a mutação no fator V Leiden6. Em comparação com o sequenciamento Sanger que representa a técnica padrão dourada, o HRM é um método mais sensível e menos específico5. O método HRM é um bom método de triagem que permite uma análise rápida de um grande número de amostras com um ótimo custo-benefício5. É um método PCR simples realizado na presença de um corante fluorescente e não requer habilidades específicas. Outro benefício é que o procedimento em si não danifica ou destrói a amostra analisada que nos permite reutilizar a amostra para eletroforese ou sequenciamento de Sanger após o procedimento de HRM7. A única desvantagem é que às vezes é difícil interpretar os resultados. Além disso, o HRM não detecta a mutação exata em pacientes com mutações não tipo 1 ou tipo 28. Nesses pacientes, deve-se realizar o sequenciamento Sanger(Figura 1).

O HRM baseia-se na amplificação da região específica do DNA na presença de corante fluorescente de DNA saturado, que é incorporado em DNA de dupla cadeia (dsDNA). O corante fluorescente emite luz quando incorporado no dsDNA. Após um aumento progressivo da temperatura, o DSNA se divide em um único DNA encalhado, que pode ser detectado na curva de fusão como uma diminuição repentina da intensidade da fluorescência. A forma da curva de fusão depende da sequência de DNA que é usada para detectar a mutação. Curvas de fusão de amostras são comparadas com curvas de fusão de mutações conhecidas ou tipo selvagem CALR. Curvas de fusão distintas representam uma mutação diferente que não é tipo 1 ou tipo29.

O algoritmo para a detecção de variantes genéticas somáticas no gene CALR por HRM, o método de eletroforese e sequenciamento do gel agarose(Figura 1)foi utilizado e validado no estudo retrospectivo publicado antes do10.

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Protocol

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da República da Eslovênia. Todos os procedimentos estavam de acordo com a declaração de Helsinque.

1. Análise quantitativa de PCR (qPCR) e pós-qPCR baseada em fluorescência e análise pós-qPCR pelo HRM

  1. Primers resuspend listados na Tabela de Materiais a 100 μM com estéril, RNase e DNase livre H2O (ver Tabela de Materiais). Faça um primer de concentração de trabalho de 10 μM. Os primers utilizados no protocolo foram publicados antesdo 2.
  2. Quantitate granulocitos DNA pelo método de coloração de fluorescência seguindo a instrução do fabricante11 (ver Tabela de Materiais). Prepare uma solução de DNA de 20 ng/μL utilizando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9.0 (ver Tabela de Materiais).
    1. Além das amostras de DNA, prepare pelo menos três controles de DNA: dois controles positivos com o NM_004343.3(CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs* 46) (exclusão de 52 bp ou mutação tipo 1) e NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs *47) (inserção de 5 bp ou mutação tipo 2), bem como DNA selvagem e controle negativo como controle não-modelo (NTC).
      NOTA: Antes de realizar a configuração do HRM, confirme se o instrumento qPCR está calibrado para experimentos de HRM.
  3. Prepare o qPCR HRM Master Mix de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) da seguinte forma: 10 μL de 2x qPCR Master Mix com Corante, 0,2 μL de Primer forward de 10 μM, 0,2 μL de Primer reverso de 10 μM, 8,6 μL de estéril, RNase e DNase livre H2O. Use os primers da Tabela de Materiais. Execute três réplicas para cada amostra de DNA e controle.
    1. Prepare o qPCR HRM Master Mix de acordo com o número de amostras que estão sendo processadas. Inclua volume excedente de pelo menos 10% nos cálculos para fornecer volume excessivo para a perda que ocorre durante as transferências de reagentes.
  4. Misture o conteúdo da reação tocando suavemente e invertendo o tubo e o vórtice para 2-3 s. Colete todas as gotículas espalhadas da parede do tubo até o fundo por um breve giro.
  5. Prepare uma placa de reação adequada para o instrumento e o experimento HRM (ver Tabela de Materiais). Transfira 19 μL do qPCR HRM Master Mix para os poços apropriados da placa de reação óptica de 96 poços.
  6. Pipet 1 μL dos controles negativos, controles positivos e amostras nos poços apropriados da placa de reação óptica. Para o NTC, transfira 1 μL de estéril, RNase e DNase livre H2O usado para preparar o qPCR HRM Master Mix em vez de DNA.
  7. Sele a placa de reação com o filme adesivo óptico. Faça-o firmemente para evitar a evaporação durante a corrida. Verifique se a película adesiva óptica está em todos os poços da placa de reação para garantir a detecção correta da fluorescência.
  8. Gire a placa de reação a 780 x g em temperatura ambiente (RT) por 1 minuto. Verifique se o líquido está na parte inferior dos poços na placa de reação. Prossiga para executar o ensaio.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene a placa a 4 °C por não mais de 24h. Deixe a placa armazenada a 4 °C para aquecer ao RT e, em seguida, gire a placa brevemente antes de executá-la.
  9. De acordo com a instrução do fabricante, prepare e inicie a corrida para amplificar e derreter o DNA e gerar dados de fluorescência de HRM no instrumento qPCR. No software do sistema de instrumentos, atribua os controles e amostras aos poços apropriados.
  10. Para a detecção da variante genética CALR, altere o protocolo padrão de amplificação do instrumento e amplie o DNA usando o seguinte protocolo de ciclismo térmico: 95 °C por 10 minutos, seguido por 50 ciclos de 95 °C para 10 s e 62,5 °C para 60 s.
  11. Realize o estágio de curva/dissociação de derretimento (HRM) imediatamente após o qPCR de acordo com as instruções do fabricante12 da seguinte forma: 95 °C para 10 s, 60 °C por 1 min e, em seguida, uma taxa de rampa de 0,025 °C/s até 95 °C. Mantenha a temperatura a 95 °C para 15 s e a 60 °C para 15 s.
  12. A corrida termina automaticamente. Primeiro, revise e verifique o enredo de amplificação(Figura 2).
  13. No menu de experimentos do software do sistema de instrumentos, selecione a opção de plot de amplificação. Se nenhum dado for exibido, clique no botão verde Analisar.
    1. Na guia de plot de amplificação, a partir do menu suspenso do tipo de enredo, selecione o plot que exibe os dados de amplificação como as leituras de fluorescência bruta normalizadas para a fluorescência da referência passiva (ΔRn) em função do número de ciclo (ΔRn vs Cycle). No menu suspenso da cor do enredo, selecione Amostrar.
  14. No menu suspenso do tipo gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação linear. Mostre o ciclo de início e fim da linha de base no gráfico de amplificação linear selecionando a opção de início da linha de base. Verifique se a linha de base está definida corretamente. O ciclo final deve ser definido alguns ciclos antes do número de ciclo onde um sinal fluorescente significativo é detectado. A linha de base é geralmente definida de 3 a 15 ciclos(Figura 2).
  15. No menu suspenso do tipo gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação log10. Mostre a linha de limiar no gráfico selecionando a opção limiar. Ajuste o limiar de acordo se não estiver definido corretamente. O limiar definido corretamente significa que a linha limiar cruza a fase exponencial das curvas qPCR(Figura 2).
  16. Verifique se as curvas normais de amplificação estão em todas as amostras e poços de controle positivos. Verifique se não há amplificação nos poços NTC antes do ciclo 40. Uma parcela de amplificação normal mostra um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35(Figura 2). Exclua os poços amostrais da análise se não houver amplificação na posição do poço.
    NOTA: Se a parcela de amplificação parecer anormal ou o poço NTC indicar a amplificação, identifique e resolva o problema de acordo com o guia de solução de problemas do fabricante.
  17. Exclua o outlier com o valor do ciclo de quantificação (Cq) que difere das réplicas por mais de 2 no software do sistema de instrumentos12. Os outliers podem produzir resultados de HRM errôneos.
  18. Nas curvas de derretimento derivado, reveja as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento. As regiões pré e pós-derretimento devem estar dentro de uma área plana onde não há grandes picos ou encostas nos níveis fluorescentes(Figura 3). Se necessário, ajuste-o de acordo. Configure a partida e a parada das linhas de temperatura pré e pós-fusão aproximadamente 0,5 °C uma à parte da outra(Figura 3). Reinicie a análise se os parâmetros forem ajustados clicando no botão Analisar.
  19. Na guia de plot de diferença, na guia configurações do plot, escolha um dos controles do tipo selvagem (homozigoto) replica-se como o DNA de referência e reinicie a análise clicando no botão Analisar.
  20. Na aba curvas de derretimento alinhada, confirme que todos os controles positivos têm o genótipo correto e o NTC não conseguiu amplificar(Figura 4). Na tabela do poço, selecione os poços contendo um controle positivo para destacar a curva de derretimento correspondente nas parcelas de análise. Confirme se a cor da linha corresponde ao genótipo correto. Repita passos para os poços que contenham os outros controles positivos e NTC.
  21. Na aba curvas de derretimento alinhada, revise cuidadosamente as telas do plot para as amostras desconhecidas e compare-as com as telas de plot para controles(Figura 4). Na tabela do poço, selecione os poços contendo as réplicas de amostra desconhecida, verifique a cor da curva de derretimento e alinhe-os com os controles em uma sequência ordenada selecionando os poços contendo controles positivos um a um. Repita o processo para todas as amostras desconhecidas.
    NOTA: A amostra desconhecida contém a variante de um dos controles se sua curva de fusão estiver firmemente alinhada a ela. Diferentes grupos de variantes (cores diferentes) poderiam ser exibidos indicando que a amostra desconhecida consiste em uma variante desconhecida, não correspondendo aos controles(Figura 8). Um baixo nível da variante genética somática pode estar presente na amostra do paciente. Isso poderia influenciar a interpretação do resultado do HRM, particularmente no limite de detecção do ensaio(Figura 9). Nestes casos, a cor ou mesmo a forma da linha poderia se assemelhar muito à do genótipo do tipo selvagem.
    1. Quando o resultado for inconclusivo, combine os resultados do HRM com os resultados dos métodos de eletroforese e sequenciamento do gel agarose. Teste novamente a amostra ou solicite e teste novamente uma nova amostra, se necessário.
    2. Revise cuidadosamente o conjunto de dados para replicar curvas e verifique se o alinhamento de cada réplica dentro do grupo está apertado. Exclua a réplica se ela não estiver alinhada firmemente com as outras amostras do grupo (outlier). Teste novamente a amostra se houver mais outliers e os resultados são inconclusivos. Esteja ciente de que a quantidade e a qualidade da amostra de DNA influenciam os resultados do HRM.
  22. Analise o resultado da amostra desconhecida na guia Plot 'Diferença'. Repita o procedimento descrito na etapa 1.21 e verifique se os resultados obtidos para a amostra desconhecida são os mesmos.
  23. Em seguida, execute os produtos qPCR HRM no gel de agarose.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene a placa a 4 °C por no máximo 24 horas ou a -20 °C por um período maior, mas não mais do que 7 dias. Deixe a placa armazenada a 4 °C para aquecer ao RT e, em seguida, gire a placa brevemente antes de executá-la. Deixe a placa armazenada a - 20 °C para descongelar e aquecer ao RT, e depois gire a placa brevemente antes de executá-la.

2. Eletroforese de gel agarose

  1. Execute os produtos qPCR HRM em um gel pré-fundido de 4% agarose contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente usando o sistema de eletroforese de gel apropriado (ver Tabela de Materiais, Figura 5). Execute apenas uma réplica positiva, negativa, NTC e qPCR HRM.
    NOTA: As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis. Qualquer outro sistema de eletroforese de gel pode cumprir esse propósito se a porcentagem equivalente de agarose, a mancha de ácido nucleico fluorescente e o formato do poço forem escolhidos.
  2. Execute o sistema de eletroforese de gel de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais). Retire o gel pré-fundido no da embalagem, remova o pente e insira-o no aparelho de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Carregue o gel dentro de 15 minutos após a abertura do pacote.
  3. Diluir uma amostra de 10 μL a 20 μL com h2O livre de Estéril, RNase e DNase. Carregue cada poço com 20 μL de amostra diluída.
  4. Diluir 3 μL de solução padrão de tamanho de DNA a 20 μL com Estéril, RNase e DNase livre H2O (ver Tabela de Materiais). Carregue o poço M com 20 μL de solução padrão de tamanho de DNA diluída(Figura 6).
  5. Encha todos os poços vazios com 20 μL de estéril, RNase e DNase livre H2O.
  6. Selecione imediatamente o programa de acordo com a porcentagem do gel que está sendo executado e defina o tempo de execução no aparelho para 10 minutos.
  7. Inicie a eletroforese dentro de 1 min da amostra de carregamento pressionando o botão GO. O tempo de eletroforese pode ser prorrogado se a resolução insuficiente for obtida.
    NOTA: Não exceda o tempo máximo recomendado de execução da eletroforese agarose de acordo com as instruções do fabricante.
  8. Quando a eletroforese estiver concluída, visualize o DNA no gel usando uma transilluminação de luz azul ou UV. Visualizar, analisar e armazenar as imagens de eletroforese são feitos principalmente por um imager de gel com sistema de documentação fotográfica(Figura 5).
  9. Analisar e interpretar o padrão de gel de produtos qPCR HRM visualizado comparando os resultados da amostra desconhecida com controles positivos(Figura 7 e Figura 8).
  10. Se os resultados da amostra desconhecida HRM e da eletroforese do gel indicarem que uma variante genética desconhecida está presente, sequencie o produto qPCR HRM utilizando primers descritos na Tabela de Materiais de acordo com o protocolo descrito13.
    ATENÇÃO: Os géis de agarose contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente devem ser adequadamente eliminados pelas normas da instituição.

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Representative Results

A região de interesse do DNA amplificado com sucesso com um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35 e valores muito estreitos do ciclo de quantificação (Cq) em todas as amostras e controles replicados (Figura 2) é um pré-requisito para a identificação confiável de variantes genéticas pela análise do HRM. Isso é conseguido usando uma determinação precisa do DNA com coloração de fluorescência e uma quantidade igual de DNA no experimento qPCR HRM (ver passo 1.2). A Figura 2 mostra a amplificação bem sucedida da região de interesse do DNA onde os valores do CQ de todas as amostras e controles estão em um intervalo muito estreito. Não há amplificação nos poços NTC.

A etapa hrm é realizada imediatamente após qPCR utilizando o protocolo descrito na etapa 1.11. As regiões de derretimento ativas (Figura 3, rótulo (c)) das amostras, os controles e o NTC são usados para criar suas parcelas de curva de fusão alinhadas(Figura 4). Portanto, as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento corretamente definidas(Figura 3A)são importantes para visualizar e identificar adequadamente variantes genéticas nas amostras. A Figura 4A e a Figura 4B mostram as curvas de derretimento alinhadas e as parcelas de diferença, respectivamente, onde a identificação de variantes genéticas é possível. As amostras desconhecidas estão fortemente alinhadas com um dos controles positivos. A Figura 3B mostra as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento incorretamente definidas. Isso resulta em uma curva de derretimento alinhada e gráficos de diferença onde a identificação correta das variantes genéticas é mais difícil(Figura 4C e Figura 4D).

Para confirmar os resultados do HRM e detectar se o método de sequenciamento padrão ou de próxima geração é necessário para identificar a variante genética presente na amostra, é utilizada a eletroforese do gel agarose. A Figura 7 mostra a eletroforese de gel agarose das mesmas amostras e controles que são exibidos na Figura 4. A variante genética na amostra pode ser identificada comparando o padrão de banda da amostra aos controles e combinando a eletroforese do hgm e do gel agarose. No entanto, a identificação correta da variante genética só pode ser feita para as amostras que contêm a mesma variante genética de um dos controles utilizados no ensaio hrm(Figura 7). Amostras contendo variantes genéticas CALR raras diferem no resultado do HRM e no padrão da banda de eletroforese(Figura 8). Neste caso, o sequenciamento Sanger ou mesmo o método de sequenciamento de próxima geração são usados para identificar a variante genética exata.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do algoritmo para a detecção de variantes genéticas somáticas no gene CALR por HRM, eletroforese de gel agarose e métodos de sequenciamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gráfico de amplificação do ensaio qPCR HRM para a detecção das variantes genéticas no gene CALR. O enredo de amplificação é exibido como a fluorescência bruta normalizada para a fluorescência a partir da referência passiva (ΔRn) e em função de um número de ciclo. A linha de base é definida de 3 a 15 ciclos quando a região de interesse do DNA foi eficientemente amplificada usando 20 ng de DNA de alta qualidade na reação qPCR. As parcelas normais de amplificação da região de DNA de interesse de todas as amostras são mostradas como linhas verdes. As parcelas mostram um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35 no experimento usando 20 ng de DNA de alta qualidade na reação qPCR. O gráfico não mostra amplificação nos poços de amostra não-modelo (NTC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas de derretimento derivativo no ensaio qPCR HRM para a detecção das variantes genéticas no gene CALR.  A) Um exemplo de regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento corretamente definidas. A linha de temperatura de parada pré-derretimento deve ser adjacente ao início da região de transição de derretimento. A linha de temperatura inicial pós-derretimento deve ser adjacente ao final da região de transição de derretimento. O rótulo (a) indica o par de linhas à esquerda dos picos onde o pré-derretimento começa e as temperaturas de parada são definidas. Cada amplicon é duplamente encalhado. O rótulo (b) indica os picos de dados da região de derretimento ativo usado para criar o gráfico de curvas de derretimento alinhado. O rótulo (c) indica o par de linhas à direita dos picos onde as temperaturas pós-derretimento começam e param. Cada amplicon é monofaçado. B) Um exemplo de regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento incorretamente definidas. As linhas de início e parada das linhas de temperatura pré e pós-derretimento não são adjacentes às regiões de transição de derretimento e estão mais de 0,5 °C distantes umas das outras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: As curvas de derretimento alinhadas e as parcelas de diferença no ensaio qPCR HRM para a detecção das variantes genéticas no gene CALR.  A) e B) mostram as curvas de derretimento alinhadas e os gráficos de diferença após as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento serem corretamente definidos. A) As curvas de derretimento alinhadas dos controles positivos com exclusão de 52 bp (mutação tipo 1), inserção de 5 bp (mutação tipo 2) e tipo selvagem são mostradas como cor laranja, roxa e vermelha, respectivamente. B) O gráfico diferença das mesmas amostras descritas no painel A. C) e D) mostram as curvas de derretimento alinhadas e os gráficos de diferença após as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento incorretamente definidas para o mesmo conjunto de amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: O sistema de eletroforese de gel. A) As unidades básicas do sistema de eletroforese de gel (ver Tabela de Materiais). B) É mostrado um imager de gel com sistema de documentação fotográfica composto por uma câmera CCD, uma câmara com luzes trans/iluminadora adequadas e um filtro fotográfico (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Carregar o gel com amostras diluídas e solução padrão de tamanho de DNA ou RNase e DNase livre H2O para poços vazios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Análises dos produtos qPCR HRM sobre eletroforese de gel. O gel foi exposto ao transilluminator UV. A imagem foi tirada pelo sistema de documentação com foto(Figura 5B). Poços de 1 a 3 mostram controles: exclusão de 52 bp (mutação tipo 1), inserção de 5 bp (mutação tipo 2) e variante tipo selvagem, respectivamente. O padrão de banda das amostras desconhecidas nos poços 4-10 indica-as como a variante genética do tipo selvagem. O poço M representa a solução padrão de tamanho de DNA diluída (100 a 2.000 bp). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Análises de eletroforese de HM e gel das variantes genéticas do gene CALR.  A) Análises do HRM. As curvas de derretimento alinhadas dos controles positivos com exclusão de 52 bp (mutação tipo 1), inserção de 5 bp (mutação tipo 2) e tipo selvagem são mostradas como cor laranja, roxa e vermelha, respectivamente. A amostra desconhecida com a diferente variante genética é indicada como cor azul escuro. B) Análises de eletroforese de gel. Poços de 1 a 3 mostram controles: exclusão de 52 bp (mutação tipo 1), inserção de 5 bp (mutação tipo 2) e variante tipo selvagem, respectivamente. O padrão de banda da amostra desconhecida na faixa 9 indica a diferente variante genética como controles. Outras amostras desconhecidas são a variante do tipo selvagem. O poço M representa a solução padrão de tamanho de DNA diluída (100 a 2.000 bp). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: O limite de detecção do ensaio HRM. Uma diluição serial de uma amostra de uma exclusão de 52 bp (mutação tipo 1) e inserção de 5 bp (mutação tipo 2) é apresentada exibindo uma carga de alelo variante genética de aproximadamente 50% de acordo com a análise de sequenciamento de Sanger e o ensaio qPCR HRM de acordo com o protocolo descrito neste artigo. A) e B) mostram as curvas de derretimento alinhadas e as parcelas de diferença para diluições de tipo selvagem e serial de uma exclusão de 52 bp (mutação tipo 1). C) e D) mostram as curvas de fusão alinhadas e as parcelas de diferença para diluições de tipo selvagem e serial de uma inserção de 5 bp (mutação tipo 2). Em ambos os casos, a variante genética CALR pode ser detectada em até 1,56% de diluição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O derretimento de alta resolução do DNA é uma solução simples para genotipagem e escaneamento de variantesgenéticas 14. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes que mudam a forma da curva de fusão. Diferentes tipos de variantes genéticas com frequências diversas podem ser observadas no gene específico para um determinado grupo de pacientes com câncer1,2,15,16,10. Exclusões ou inserções no gene de interesse podem ser detectadas pela análise do HRM, como mostramos na Figura 4A. Na implementação do ensaio qPCR HRM no teste de rotina, realizamos um estudo de avaliação inicial, incluindo 21 pacientes ET JAK2 V617F negativo com idade mediana de 63 anos (variam de 24 a 90 anos). Uma variante genética no gene CALR foi detectada em 12 dos 21 pacientes ET JAK2 V617F negativo (proporção 0,57). Foi detectada uma exclusão de 52 bp (mutação tipo 1) em 9 de 21 (proporção 0,43), foi detectada uma inserção de 5 bp (mutação tipo 2) em 3 de 21 (proporção 0,143) pacientes COM ET JAK2 V617F negativo. Os resultados são consistentes com os dados da literatura1,2,17.

A identificação confiável das variantes genéticas pela análise do HRM pode ser alcançada através do desenvolvimento adequado de ensaios que garante que o experimento seja otimizado para o HRM. Fatores que não sejam sequenciais podem ser uma fonte de pequenas diferenças nas curvas do HRM, como design de primer, comprimento de amplicon, seleção de corante, escolha do reagente qPCR HRM e perfis de temperatura e tempo das etapas qPCR HRM. Esta é a parte do desenvolvimento e otimização muito precoce do ensaio qPCR HRM e já foi discutida em outros lugares12,14,18. No entanto, a identificação confiável de variantes genéticas no gene CALR com sensibilidade comparável dos ensaios poderia ser alcançada em diferentes plataformas hrm usando as mesmas sequências de primer19. O ponto mais crítico no processo de otimização do ensaio qPCR HRM foi a otimização da temperatura de fusão e alongamento na etapa qPCR do ensaio qPCR HRM. Não foi necessária modificação para a etapa12do HRM . Nos testes de rotina, outros fatores que influenciam os resultados do HRM se tornam mais importantes a seguir.

DNA de alta qualidade resuspengido em um tampão de baixo sal como TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA ou menor concentração) e a mesma quantidade de DNA no ensaio qPCR HRM são fatores importantes para a região de DNA amplificada com sucesso de interesses com um alto planador de sinal na fase de amplificação qPCR(Figura 2). Isso leva à identificação confiável das variantes genéticas pela análise de HRM (Figura 4A,4B)12,14. Um tampão de alto sal usado para a eluição do DNA no protocolo de extração pode alterar sutilmente a termodinâmica da transição de derretimento do DNA. Precipitação e ressuspensão em te tampão de baixo sal ou diluição da amostra podem resolver o problema das impurezas na amostra de DNA. O DNA de baixa qualidade pode produzir produtos PCR não específicos ou amplificação falha. Tudo isso pode resultar em uma menor reprodutibilidade e maior taxa de erro na detecção de variantes hrm. Uma otimização adicional para as amostras desafiadoras, como o DNA extraído de amostras incorporadas à parafina, poderia ser necessária para obter um resultado ótimo do HRM15.

Grandes diferenças na quantidade de DNA utilizada no ensaio qPCR HRM podem impactar a temperatura de fusão resultante (Tm) e, consequentemente, levar a resultados inconclusivos. Portanto, a determinação precisa da concentração de DNA e diluição de todas as amostras de DNA são obrigatórias20. Métodos de absorção de ultravioleta (UV) e coloração de fluorescência determinam com precisão as concentrações de soluções de DNA de alta pureza21. O método de absorção UV poderia ser utilizado para avaliar a pureza das soluções de DNA realizando medições de absorvância de razão em A260/A280 e A260/230. No entanto, o método de coloração fluorescente é mais sensível à degradação do DNA do que o método de absorção UV e pode determinar com mais precisão a concentração de DNA21. Portanto, é mais adequado para a padronização da quantificação e diluição de todas as amostras de DNA na análise de MM20,21.

Os indels são as principais variantes genéticas do gene CALR observado em pacientes com MPN1. À medida que o comprimento do produto muda e aumenta, a diferença entre curvas de tipo selvagem e heterozigoto torna-se menor, e a detecção da variante torna-se mais difícil7. Portanto, deve ser utilizado um método adicional para o esclarecimento de tal variante genética.

Um bom exemplo é a eletroforese de gel agarose. Trata-se de um método simples e eficaz para separar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos22,23. As moléculas de DNA são separadas pelo tamanho dentro do gel de agarose para que a distância percorrida seja inversamente proporcional ao logaritmo de seu peso molecular24. Figura 4A, Figura 4B e Figura 7 mostram exemplos onde os dois tipos mais comuns de variante genética CALR, exclusão de 52 bp e inserção de 5 bp, são identificados pela combinação de resultados de eletroforese de qPCR HRM e agarose gelrose. No entanto, quando o resultado do HRM e o padrão da banda de eletroforese de gel agarose indicam uma variante genética diferente (incluindo uma única alteração de nucleotídeo) como nos controles(Figura 8), o sequenciamento de Sanger ainda é necessário para identificar a variante genética exata10.

Um baixo nível de variante genética somática no gene CALR pode estar presente na amostra do paciente fazendo uma interpretação do qPCR HRM, eletroforese de gel agarose e sequenciamento Sanger resultados mais exigentes, particularmente no limite de detecção do ensaio(Figura 9). Qualquer linha de forma de curva de fusão diferente do tipo selvagem um indica a variante genética a estar presente na amostra. A sensibilidade do ensaio qPCR HRM é inferior a 5% (Figura 9 e referência19) e é mais sensível do que o método de sequenciamento Sanger, cuja sensibilidade foi relatada como sendo de 15-20%19. Nesses casos, o método de sequenciamento profundo de próxima geração que detecta indels maiores poderia ser aplicado e confirmar o resultado do HRM. Em conclusão, a análise do HRM é um método poderoso para genotipagem e variação genética de variantes genéticas somáticas no gene CALR. A identificação de diferentes tipos de variante genética baseia-se principalmente nos controles utilizados no ensaio qPCR HRM. Resultados mais confiáveis são obtidos combinando os resultados do HRM com resultados da eletroforese do gel agarose. Em caso de resultados inconclusivos, o sequenciamento padrão de Sanger ou até mesmo o método de sequenciamento de próxima geração pode ser usado para identificar adequadamente a variante genética.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a todos os especialistas acadêmicos e colaboradores do Laboratório Especializado de Hematologia, Departamento de Hematologia, Divisão de Medicina Interna do Centro Médico Universitário Ljubljana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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References

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Genética Edição 162 Análise de fusão de alta resolução reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real baseada em fluorescência variante genética eletroforese de gel de agarose pré-casta mutação somática inde varredura heteroduplexa CALR
Detecção de variantes genéticas no gene <em>CALR</em> usando análise de fusão de alta resolução
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