Summary
淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。我们描述了淋巴水肿的慢性粘液尾部模型，以及组织纳米透射技术 （TNT） 对尾部进行遗传货物输送的新用途。
Abstract
淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。受影响的肢体由于积液、脂肪和纤维化而扩大。这种疾病没有治愈的方法。老鼠尾巴模型，使用焦点全厚皮肤切除附近的尾巴底部，导致尾部肿胀，已被用于研究淋巴水肿。然而，该模型可能导致血管组成和随后的尾部坏死和早期尾部肿胀的分辨率，限制其临床可翻译性。慢性阴唇尾淋巴水肿模型诱导持续淋巴水肿超过15周和可靠的灌注到尾巴。传统木质尾淋巴水肿模型的增强包括1）使用手术显微镜精确全厚切除和淋巴剪裁，2）使用高分辨率激光斑点确认术后动脉和静脉灌注，3）使用非多氰氨酸绿色近红外激光淋巴扫描进行功能评估。我们还使用组织纳米传递技术 （TNT） 为新的非病毒性、跨皮性、焦点性遗传货物输送到小鼠尾血管。
Introduction
淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。受影响的肢体由于积液、脂肪和纤维化1而扩大。淋巴水肿影响全球2.5亿人2，3，4。据估计，20-40%接受固体恶性肿瘤治疗的患者，如乳腺癌、黑色素瘤、妇科/泌尿肿瘤或肉瘤，会发展成淋巴水肿2、4、5。淋巴水肿的发病率包括复发性感染、疼痛和畸形6。这种渐进的终身疾病是无法治愈的。目前的疗法是变种有效7，包括压缩，完全排泄治疗由物理治疗师，切除程序，和显微手术，包括血管淋巴结转移和淋巴旁路7，8，9，10，11，12，13，14。淋巴水肿的理想治疗方法尚未被发现。
研究淋巴水肿的机理和治疗是有限的。淋巴损伤后平均延迟一年，15、16和大多数经历辐射和手术的诱导侮辱的人不会发展淋巴水肿4，6，17。虽然大型动物模型，包括犬，羊，和猪已经描述了18，19，20，老鼠尾巴模型已被最广泛的应用，因为方便，成本，和繁殖能力。用于研究淋巴水肿的鼠标模型包括尾部模型、白喉毒素介导淋巴消融，以及轴状或弹出性淋巴结解剖 21、22、23、24、25、26。大多数尾部模型使用焦点，全厚皮肤切除与淋巴通道剪裁，这是在尾部底部附近执行22，导致尾部肿胀和组织特征类似于人类淋巴水肿24，27，28，29。然而，标准的木乃伊尾巴模型通常自发解决在短短20天，并伴有周期性尾坏死30。淋巴水肿鼠尾模型将持续淋巴水肿延长超过15周，演示确认的动脉和静脉轻度，并允许功能淋巴功能障碍评估。
淋巴水肿的阴唇尾部模型允许评估治疗淋巴水肿的新型治疗方法。基因策略已被用于由病毒载体31，32调解的老鼠模型。我们还使用一种新的组织纳米传递技术（TNT）将遗传货物运送到淋巴小鼠尾部。TNT利用纳米通道芯片在快速聚焦电场33、34、35、36中促进直接的、皮下基因的传递。该模型包括使用TNT2.0，使潜在的基因治疗焦点基因传递到小鼠尾部的淋巴损伤部位35。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议遵循该机构动物研究伦理委员会的指导方针。所有动物实验都得到了印第安纳大学医学院动物护理和使用委员会的批准。动物被安置在12小时的光暗循环下，食物和水的脂肪。
1. 小鼠尾淋巴的手术中断
- 使用八周大的C57BL/6小鼠，性别分布均等。
- 将鼠标置于全身麻醉下，在诱导室中，3-4%的异黄素在100%的氧气中，然后在手术过程中以1-3%的维持饱和度进行。
- 持续释放 （SR） 丁丙诺啡皮下管理 0.5 毫克/千克，以控制疼痛。
注：手术后施用的其他镇痛药物：卡洛芬每24小时一次，至少48小时，Bupivacaine一次，无论是切口后还是关闭切口之前，通过滴到皮肤边缘（持续长达4至6小时）。 - 将鼠标定位在多处，并准备使用 70% 异丙醇的尾巴。
- 使用卡钳从尾部底部开始，以 5 mm 增量测量手术前的尾径 5 mm 增量。这些测量将用于使用截断的锥体方程37计算体积。
- 在距底座 20 mm 的尾部标记 3 mm 的环切除术。
- 用无菌手术刀片（大小 15）进行细致的 3 mm 全厚皮肤切除术，使所有底层血管在手术显微放大下完好无损。将优越的割礼标记（从尾部基座 20 毫米）首先穿过真皮，然后将环切的全厚切口 3 mm 分形切口切成第一个切口。
- 制作垂直全厚垂直切口，将两个切口连接起来。使用齿形精细皮卡抓住领先优势，并使用显微镜仔细剖析血管平面深处的真皮和表面的静脉冒险。
- 将 0.1 mL 的异硫素蓝色 （1%） 皮下近端注射到尾部。
- 在手术显微镜下识别与横向尾静脉相邻的两个淋巴通道。淋巴片会因为异硫素注射而呈蓝色。使用直微手术剪刀转录淋巴。使用剪刀仔细解剖横静脉和淋巴之间的平面。然后通过淋巴血管和横静脉之间的一把剪刀刀片的尖端，并关闭刀片以穿过淋巴血管。
- 用无菌的粘附清敷料给尾部伤口穿衣。每天检查手术后切口，以确保它们没有感染或出血，并提供伤口护理2周。
- 单独安置动物，以防止任何进一步的伤害尾巴，并防止动物咬对方，这将导致手术并发症。
2. 带激光斑点对比成像的尾血管评估
- 麻醉鼠标，如第1.2步。
- 要使用激光斑点对比成像可视化尾部血管，将宽度设置为 0.8 厘米，高度设置为 1.8 厘米，点密度为高，帧速率为 44 图像/秒，时间为 30 秒，彩色照片设置为每 10 秒 1 张。
- 评估静脉和动脉灌注的足口。从质量上讲，流的连续性应该形象化。
3. 近红外激光血管造影功能淋巴评估
- 麻醉动物作为第1.2步
- 重组丁二苯丙胺绿色 （ICG） （25 毫克/10 mL）， 并在尖端附近的远小鼠尾皮下管理 0.1 mL。
- 调暗房间的灯光。将近红外激光血管造影仪置于缓冲环境中，然后进行实时捕获。
4. 使用 TNT 将核酸货物重点运送到鼠标尾部
- 麻醉动物作为第1.2步。
- 使用局部皮肤去角质霜去角质小鼠尾巴。
- 将鼠标尾部浸入拼贴剂溶液（10 毫克/毫升）中，在 37 °C 下浸入 5 分钟。
- 将DNA加载到TNT2.0 芯片储层35中。
- 将 TNT2.0 硅胶芯片设备放在所需的交货焦点部位的尾部，与尾部接触的纳米胶。
- 在储层中放置一个正电探头。将负探针连接到 30 G 针上，皮下插入针头到交货地点。
- 应用方波脉冲电刺激（10 x 10 ms 脉冲，250 V，10 mA）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
持续淋巴水肿的鼠标尾部模型技术见 图1。该图展示了鼠标尾部模型的相关解剖。 图2 显示了淋巴水肿诱导后小鼠尾部的渐进肿胀和持续持续淋巴水肿。按截断锥方程计算，鼠标尾部体积在第 4 周达到峰值，在第 6 周达到稳定点，随后逐渐改善，持续到第 15 周。尾部体积可用作结果变量，以评估治疗干预对模型淋巴水肿的影响。图 3中，可以观察到用于评估尾部血管光谱的高分辨率激光斑点。这增加了严格的模型，以确保井是次要的淋巴功能障碍，而不是静脉损伤。然后，干预的效果可以更自信地转化为淋巴水肿治疗。 图4 显示了通过近红外激光淋巴成像进行的功能淋巴评估。此额外的结果变量允许干预的功能淋巴效应。 图5 利用组织纳米透射技术（TNT2.0）在手术部位进行基因货物的聚焦输送。TNT2.0 为本淋巴水肿模型中潜在候选基因治疗提供点提供便利。
图1：持续淋巴水肿的鼠标尾部模型。 （A） 在手术微缩镜下距底座20毫米处进行3毫米宽的全厚皮肤切除手术。小心保存血管。（B） 鼠标尾部横截面的示意图。DV=多静脉，LV+横静脉，静脉，静脉骨动脉，CV=肠骨，T+肌腱和肌肉，黄色箭头显示淋巴。（C） 在将异硫素蓝色插入尾尖以定位淋巴病后，淋巴（黄色箭头）呈现蓝色。淋巴功能被破坏，同时保留相邻的横静脉（白色箭头）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：小鼠尾淋巴水肿模型的渐进肿胀。（A ）在全厚皮肤切除和淋巴转导后，小鼠尾部出现持续15周以上的渐进性肿胀。支架表示从尾部底部到手术开始全厚皮肤切除的 20 mm。（B-C）尾部体积变化的量化在 15 周内表示为（B）条图，每个点表示动物，n=15 或（C）线图。数据表示为± SEM。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：高分辨率激光斑点对比成像，确认小鼠尾部灌注淋巴水肿小鼠尾部模型。 激光斑点用于评估小鼠尾血管术后，以验证淋巴的肿胀，并尽量减少尾部坏死。（A） 被激光斑点检测到的横静脉受伤（黑色箭头）的鼠尾。（B） 被激光斑点检测到的淋巴水肿手术后，横向尾静脉（黑色箭头）。（n=5） 分辨率 0.02 mm;颜色编码条表示以任意相对单位测量的灌注（蓝色：低、红色：高）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：小鼠尾部模型中使用近红外激光淋巴淋巴尿术评估淋巴功能。 注射到小鼠尾巴尖端的丁二氨酸绿色 （ICG） 本地化到淋巴。术前，淋巴沿鼠尾完好无损。术后，手术现场以外没有ICG转运，证实肿胀是由淋巴功能障碍引起的。黄色箭头表示尾部底部。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：利用组织纳米转化技术（TNT）进行基因货物的聚焦输送。 （A） TNT 交货的插图。（B） 普拉斯米德被装入TNT2.0 水库。连接正负电探头，并提供简短的方波脉冲电刺激（10 x 10 ms 脉冲，250 V， 10 mA），促进焦、非病毒、皮下转染。（C） 使用TNT2.0 的遗传货物运送效率，通过荧光素（FAM）标记的DNA输送到木耳尾部观察到。小鼠尾巴在TNT治疗两天后被分割，并通过荧光显微镜进行评估。白色虚线表示木质尾巴皮肤的上皮。白色箭头表示 FAM 标记的 DNA。请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
淋巴水肿分为原发性（先天性）或继发性（致畸淋巴）损伤38，39。继发性淋巴水肿占39例病例的99%。继发性淋巴水肿最常由感染（丝虫病）或肿瘤后治疗与淋巴切除术或辐射4，39引起。转化动物模型对继发性淋巴水肿具有挑战性，因为70%接受淋巴切除术和放射治疗的动物不会获得淋巴水肿2，16。此外，表型淋巴水肿表现出淋巴损伤后延迟发病（一年）。淋巴水肿的小鼠尾部模型克服了这些障碍，因为所有接受聚焦尾淋巴切除术的小鼠在手术后数日内出现淋巴水肿。全厚焦点皮下切除术在可视化下进行，手术显微镜可确定尾静脉和皮下组织之间的组织平面，并促进血管保存。我们以前用尼龙缝合线将淋巴通道连结，但由于持续淋巴水肿只能通过淋巴通道的转导诱导，因此必须认为结结是不必要的。鼠尾的两个横向淋巴通道与横向尾静脉非常接近。从组织学上讲，肿胀的尾巴显示炎症、闭际液体保留、脂肪沉积和纤维化，类似于临床淋巴水肿24、27、28、40。
此模型的一个陷阱是横静脉和血管受伤的风险。使用放大缩小字体功能 放大缩小字体功能 执行全厚皮肤切除手术可导致解剖过程中无意静脉出血。在高立体放大下小心切除，有助于更精确地停留在容器冒险和皮下层之间的血管平面内。另一个困难是，尾部坏死发生频率高达30%30，因为船舶损伤大大增加了尾部坏死的风险。该模型边缘化尾坏死与（1）使用手术显微镜进行细致的解剖和（2）确认血管拍点激光斑点成像41。如果血管损伤被识别出来，动物应该从研究中删除。其他调查人员已经使用腹腔微球注射来评估动脉灌注22。激光斑点成像除了动脉41外，还能够量化静脉的血流动力学。这种微创技术可以提供精确的微灌注数据。41
尾部体积用作模型的表型结果变量。评估模型中尾部的淋巴功能也用于评估实验效果。我们使用近红外激光淋巴成像来评估小鼠尾部的淋巴功能。这直接可视化活体动物的实时淋巴流动。ICG激光淋巴切除术也常用于临床淋巴显微外科栓塞手术，如淋巴静脉麻醉，所以它翻译得很好10。临床上，这有利于内在淋巴图谱和目标淋巴血管的识别，以连接他们到静脉淋巴静脉解剖，以治疗淋巴水肿7，10。使用ICG激光淋巴成像的一个陷阱是鼠尾和其他材料很容易涂上ICG，导致非光谱荧光，并阻碍淋巴的适当可视化。因此，我们在ICG处理和管理后立即更换手套，以最大限度地降低这种风险。
TNT最初是为体内组织重新编程33而开发的。它作为基因转移平台，更广泛地包括糖尿病外周神经病变的抢救和粉碎神经34、36的修复，并利用三个基本成分：（1）纳米芯片用于纳米细胞基因转移：（2） 核酸货物（带ORF或siRNA的质粒）：和 （3） 标准电源。TNT 通过快速聚焦电场促进直接、跨皮、非病毒基因的传递。它已被用于减少肢体缺血通过增加小鼠模型33的血管化。最近，TNT2.0被用来标记伤口外显体35。在小鼠尾淋巴水肿模型中使用TNT为基因疗法的提供提供了一个令人兴奋的未来。
小鼠尾淋巴水肿模型的转化限制是淋巴水肿21，22的自发分辨率，因为尾部肿胀在20-30天后在一些实验模型21中解决。在模型中，尾部肿胀体积，如常用的截断锥体方程37测量，已经持续了15周，没有表现出分辨率。也许技术增强使淋巴水肿的持久性最大化。技术改造包括显微镜放大下的完全解剖、尾血管的激光斑点评估以确保淋巴水肿淋巴起源的严格性、ICG激光淋巴成像的功能评估和治疗基因传递的TNT2.0。 淋巴水肿的改性小鼠尾部模型是淋巴水肿的可重复和临床可翻译的动物模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有相互竞争的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国整形外科医生协会学术奖学金和国防部W81XWH2110135 向AHH提供的赠款资助的支持。美容外科教育和研究基金会向NIH女士U01DK119099、R01NS042617和R01DK125835授予CKS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tegaderm Film | 1626W | ||
| Surgical Microscope | Leica, Wetzlar, Germany | MSV266 | |
| Adherent Dressing (Tegaderm) | 3M, St. Paul, Minn. | 1626W | |
| Laser speckle (Pericam PSI System ) | Perimed AB, Stockholm, Sweden) | PSIZ | |
| Near-infrared laser (LUNA) | Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada) | LU3000 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth | Fine Science Tools (USA) Inc. | 11019-12 | |
| V-Hook | Fine Science Tools (USA) Inc. | 18052-12 | |
| Scalpel SS NO15 | Fischer Scientific | 29556 | |
| Disposable Needle 30GX1 | Fischer Scientific | 305128 | |
| Operating Scissors | Fischer Scientific | 12-460-796 | |
| Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in | Fischer Scientific | 50-118-4255 | |
| Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge | Fine Science Tools (USA) Inc. | 15024-10 | |
| Cardiogreen | Sigma | I2633-25MG | |
| IsosulfanBlue (Lymphazurin) 50 mg/5ml | Mylan | 67457-220-05 |
References
- Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
- Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
- Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S.
- Rockson, S. G., Rivera, K. K.
- Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
- Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 8 Suppl 2237-2249 (2012).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
- Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
- Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 3 Suppl 209-218 (2016).
- Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
- Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
- Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 4S Suppl 3 234-241 (2019).
- Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
- Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J.
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
- Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
- Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
- Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
- Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
- Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
- Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
- Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
- Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
- Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
- Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
- Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
- Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
- Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
- Maclellan, R. A., Greene, A. K.
- Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
