Summary
El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. Describimos un modelo de cola murina crónica de linfedema y el uso novedoso de la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola.
Abstract
El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis. No hay cura para esta enfermedad. Un modelo de cola de ratón que utiliza una escisión focal de piel de espesor completo cerca de la base de la cola, lo que resulta en hinchazón de la cola, se ha utilizado para estudiar el linfedema. Sin embargo, este modelo puede dar lugar a una comprendeción vascular y la consiguiente necrosis de la cola y la resolución temprana de la hinchazón de la cola, lo que limita su traducibilidad clínica. El modelo de linfedema crónico de cola murina induce linfedema sostenido durante 15 semanas y una perfusión confiable a la cola. Las mejoras del modelo tradicional de linfedema de cola murina incluyen 1) escisión precisa de espesor completo y recorte linfático utilizando un microscopio quirúrgico, 2) confirmación de perfusión arterial y venosa postoperatoria utilizando manchas láser de alta resolución, y 3) evaluación funcional utilizando linfangiografía láser de infrarrojo cercano verde de indocianina. También utilizamos la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la nueva entrega focal no viral, transcutánea y de carga genética a la vasculatura de la cola del ratón.
Introduction
El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis1. El linfedema afecta a 250 millones de personas en todo el mundo2,3,4. Se estima que el 20-40% de las pacientes que se someten a tratamiento para neoplasias malignas sólidas, como cáncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos o sarcomas, desarrollan linfedema2,4,5. La morbilidad por linfedema incluye infecciones recurrentes, dolor y deformidad6. No hay cura para esta enfermedad progresiva de por vida. Las terapias actuales son varias por efectividad7 e incluyen compresión, terapia descongestiva completa por fisioterapeutas, procedimientos de escisión y operaciones microquirúrgicas, incluida la transferencia vascularizada de ganglios linfáticos y el bypass linfovenoso7,8,9, 10,11,12,13,14. El tratamiento ideal para el linfedema aún no se ha descubierto.
El estudio del mecanismo y la terapia del linfedema ha sido limitado. Hay un retraso promedio de inicio de un año después de la lesión linfática15,16 y la mayoría de los individuos que experimentan lesión iatrogénica con radiación y cirugía no desarrollan linfedema4,6,17. Aunque se han descrito modelos animales grandes, incluidos caninos, ovejas y cerdos18,19,20,el modelo de cola de ratón ha sido el más ampliamente aplicado debido a la facilidad, el costo y la reproducibilidad. Los modelos de ratón para investigar el linfedema incluyen un modelo de cola, ablación linfática mediada por toxina difteria y disección de ganglios linfáticos axilares o poplíteos21,22,23,24,25,26. La mayoría de los modelos de cola utilizan una escisión focal de la piel de espesor completo con recorte del canal linfático que se realiza cerca de la base de la cola22,lo que resulta en hinchazón de la cola y características histológicas similares al linfedema humano24,27,28,29. Sin embargo, el modelo de cola murina estándar típicamente se resuelve espontáneamente en tan solo 20 días y se acompaña de necrosis de cola periódica30. El modelo de cola de ratón con linfedema extiende un linfedema sostenido más allá de las 15 semanas, demuestra permeabilidad arterial y venosa confirmada y permite la evaluación de la disfunción linfática funcional.
Un modelo de linfedema de cola murina permite la evaluación de nuevas terapias para tratar el linfedema. Se han utilizado estrategias basadas en genes en el modelo de ratón mediado por vectores virales31,32. También utilizamos una novedosa tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola linfedematosa del ratón. TNT facilita la entrega directa y transcutánea de genes utilizando un chip con nanocanales en un campo eléctrico de enfoque rápido33,34,35,36. El modelo incluye el uso de TNT2.0 para permitir la entrega focal de genes potenciales terapéuticos basados en genes al sitio de lesión linfática de la cola deratón 35.
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Protocol
El protocolo sigue las directrices del comité de ética en investigación animal de la institución. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana. Los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum.
1. Interrupción quirúrgica de los linfáticos de la cola de ratón
- Use ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad de igual distribución de género.
- Coloque un ratón bajo anestesia general en una cámara de inducción con 3-4% de isoflurano en oxígeno al 100% seguido de sedación de mantenimiento al 1-3% durante el procedimiento.
- Administrar 0,5 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (SR) por vía subcutánea para el control del dolor.
NOTA: Medicamentos analgésicos adicionales administrados después de la operación: Carprofeno una vez cada 24 h durante al menos 48 h y Bupivacaína una vez después de que se realizó la incisión o antes de cerrar la incisión, aplicado goteando sobre los bordes de la piel (dura hasta 4 – 6 h). - Coloque el ratón dorsalmente y prepare la cola con alcohol isopropílico al 70%.
- Mida el diámetro de la cola antes del procedimiento en incrementos de 5 mm a partir de 20 mm desde la base de la cola usando una pinza. Estas mediciones se utilizarán para calcular el volumen utilizando la ecuación del cono truncado37.
- Marque una escisión circunferencial de 3 mm en la cola a 20 mm de la base.
- Realice una meticulosa escisión de piel de 3 mm de espesor completo con una cuchilla quirúrgica estéril (tamaño 15), dejando intacta toda la vasculatura subyacente bajo aumento microscópico quirúrgico. Incise la marca circunferencial superior (20 mm desde la base de la cola) primero a través de la dermis seguido de una incisión circunferencial de espesor completo 3 mm distlal a la primera incisión.
- Haga una incisión vertical perpendicular de espesor completo para conectar las dos incisiones. Use una pastilla fina dentada para agarrar un borde de ataque y use microscisores para diseccionar cuidadosamente profundamente dentro del plano avascular a la dermis y superficial a la adventicia venosa.
- Inyecte 0,1 ml de azul isosulfán (1%) por vía subcutánea proximal a la punta de la cola.
- Identifique los dos canales linfáticos adyacentes a las venas laterales de la cola bajo el microscopio quirúrgico. Los linfáticos aparecerán azules debido a la inyección de isosulfán. Transecte los linfáticos usando tijeras microquirúrgicas rectas. Use las tijeras para diseccionar cuidadosamente un plano entre la vena lateral y la linfática. Luego pase la punta de una hoja de tijera entre el vaso linfático y la vena lateral y cierre las cuchillas para transectar el vaso linfático.
- Vístase la herida de la cola con un apósito transparente adherente estéril. Revise las incisiones postoperatorias diariamente para asegurarse de que no estén infectadas o sangrando y brinde cuidado de la herida durante 2 semanas.
- Alquila a los animales solos para evitar cualquier lesión adicional en la cola y para evitar que los animales se muerda entre sí, lo que conduciría a complicaciones quirúrgicas.
2. Evaluación vascular de la cola con imágenes de contraste de manchas láser
- Anestesiar el ratón como en el paso 1.2.
- Para usar imágenes de contraste de manchas láser para visualizar la vascularización de la cola, establezca el ancho en 0,8 cm, la altura en 1,8 cm, la densidad de puntos en alta, la velocidad de fotogramas en 44 imágenes / segundo, el tiempo en 30 segundos y la foto en color en 1 por 10 segundos.
- Evaluar la perfusión venosa y arterial para la permeabilidad. Cualitativamente, se debe visualizar la continuidad del flujo.
3. Evaluación linfática funcional con angiografía láser de infrarrojo cercano
- Anestesiar al animal como en el paso 1.2
- Reconstituir el verde de indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) y administrar 0,1 ml por vía subcutánea en la cola distal del ratón cerca de la punta.
- Atenúa las luces de la habitación. Coloque la angiografía láser de infrarrojo cercano en un entorno de almacenamiento en búfer seguido de una captura en vivo.
4. Entrega focal de carga de ácido nucleico a la cola de ratón utilizando TNT
- Anestesiar al animal como en el paso 1.2.
- Exfolia la cola de ratón usando crema tópica exfoliante para la piel.
- Sumergir la cola de ratón en solución de colagenasa (10 mg/ml) a 37 °C durante 5 minutos.
- Cargue ADN en el depósito del chip TNT2.0 35.
- Coloque el dispositivo de chip de silicona TNT2.0 sobre el sitio focal deseado de entrega en la cola con nanoagujas en contacto con la cola.
- Coloque una sonda eléctrica positiva en el depósito. Conecte la sonda negativa a una aguja de 30 G e inserte la aguja por vía subcutánea en la cola hasta el sitio de entrega.
- Aplicar estimulación eléctrica de pulso de onda cuadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).
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Representative Results
La técnica para el modelo de cola de ratón para el linfedema sostenido se muestra en la Figura 1. La figura exhibe la anatomía relevante del modelo de cola de ratón. La Figura 2 demuestra la hinchazón progresiva y el linfedema persistente sostenido en la cola del ratón después de la inducción del linfedema. El volumen de la cola del ratón, calculado por la ecuación del cono truncado, alcanza su punto máximo en la semana 4 y se estabiliza en la semana 6, seguido de una mejora gradual que se mantiene hasta la semana 15. El volumen de la cola se puede utilizar como variable de resultado para evaluar el efecto de las intervenciones terapéuticas para el linfedema en el modelo. En la Figura 3,se puede observar una mancha láser de alta resolución para la evaluación de la permeabilidad de la vasculatura de la cola. Esto agrega rigor al modelo para garantizar que la brotación sea secundaria a la disfunción linfática en lugar de a la lesión venosa. El efecto de las intervenciones puede entonces traducirse potencialmente en el tratamiento del linfedema con mayor confianza. La Figura 4 muestra una evaluación linfática funcional realizada a través de linfangiografía láser de infrarrojo cercano. Esta variable de resultado adicional permite un efecto linfático funcional de las intervenciones. La Figura 5 demuestra la entrega focal de carga genética por vía transcutánea en el sitio quirúrgico utilizando tecnología de nanotransfección tisular (TNT2.0). TNT2.0 facilita la prestación en el punto de atención de posibles terapias candidatas basadas en genes en este modelo de linfedema.
Figura 1: Modelo de cola de ratón para linfedema sostenido. (A) Se realiza una escisión cutánea de espesor completo de 3 mm de ancho en una cola murina a 20 mm de la base debajo del microscopio quirúrgico. Se tiene cuidado de preservar la vasculatura. (B) Un esquema de la sección transversal de la cola del ratón. DV=vena dorsal, LV=venas laterales, A=arteria caudal ventral, CV=vértebra caudal, T=tendón y músculo, las flechas amarillas muestran los linfáticos. (C) Después de la administración de azul isosulfán en la punta de la cola para localizar los linfáticos, los linfáticos (flecha amarilla) exhiben color azul. Los linfáticos se interrumpen mientras se preservan las venas laterales adyacentes (flecha blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Hinchazón progresiva del modelo de linfedema de la cola del ratón. (A) Después de la escisión de la piel de espesor completo y la transección linfática, la cola del ratón exhibe una hinchazón progresiva que se mantiene durante 15 semanas. El soporte denota 20 mm desde la base de la cola hasta el inicio de la escisión quirúrgica de piel de espesor completo. (B-C) Cuantificación del cambio en el volumen de la cola durante 15 semanas representado como gráficos de barras (B), cada punto representando un animal, n = 15, o como (C) gráfico de líneas. Datos representados como ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de contraste de manchas láser de alta resolución para confirmar la perfusión de la cola del ratón en el modelo de cola del ratón con linfedema. La mancha láser se utiliza para evaluar la vasculatura de la cola del ratón después de la operación para validar la hinchazón de la etiología linfática y minimizar la necrosis de la cola. (A) Una cola de ratón con venas laterales lesionadas (flecha negra) detectada por manchas láser. (B) Vena de la cola lateral intacta (flecha negra) cirugía posterior al linfedema detectada por la mancha láser. (n=5) resolución 0,02 mm; La barra codificada por colores indica perfusión (azul: bajo, rojo: alto) medida en unidades relativas arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la función linfática mediante linfangiorafia láser de infrarrojo cercano en el modelo de cola de ratón. El verde de indocianina (ICG) inyectado en la punta de la cola del ratón se localiza en los linfáticos. Antes de la operación, los linfáticos están intactos a lo largo de la cola del ratón. Después de la operación, no hay tránsito de ICG más allá del sitio quirúrgico, lo que confirma que la hinchazón es causada por una disfunción linfática. La flecha amarilla indica la base de la cola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Entrega focal de carga genética utilizando tecnología de nanotransfección tisular (TNT). (A) Ilustración de la entrega de TNT. (B) Los plásmidos se cargan en el depósito de TNT2.0. Se unen las sondas eléctricas positivas y negativas y se administra una breve estimulación eléctrica de pulso de onda cuadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA), lo que facilita la transfección transcutánea focal, no viral. (C) Eficiencia de la entrega de carga genética utilizando TNT2.0 como se observa a través de la entrega de ADN etiquetado con fluoresceína amidita (FAM) a la cola murina. Las colas de ratón se seccionaron dos días después del tratamiento con TNT y se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia. Las líneas punteadas blancas indican el epitelio de la piel de la cola murina. Las flechas blancas indican el ADN etiquetado con FAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El linfedema se clasifica como una lesión primaria (congénita) o secundaria (linfática iatrogénica)38,39. El linfedema secundario comprende el 99% de los casos39. El linfedema secundario es más comúnmente causado por infección (filariasis) o tratamiento post-oncológico con linfadenectomía o radiación4,39. Un modelo animal traslacional es un desafío para el linfedema secundario, ya que el 70% de los animales tratados con linfadectomía y radiación no adquieren linfedema2,16. Además, el linfedema fenotípico exhibe un inicio tardío (un año) después de la lesión linfática. El modelo de linfedema de cola de ratón supera estos obstáculos, ya que todos los ratones sometidos a escisión linfática focal de cola exhiben linfedema a los pocos días posteriores al procedimiento21,23. La escisión subcutánea focal de espesor completo se realiza bajo visualización con el microscopio quirúrgico permitiendo la identificación definitiva del plano tisular entre las venas de la cola y los tejidos subcutáneos y facilitando la preservación de los vasos. Hemos ligado previamente el canal linfático con sutura de nylon, pero como el linfedema persistente se puede inducir solo con la transección del canal linfático, la ligadura debe considerarse innecesaria. Los dos canales linfáticos laterales en la cola del ratón están muy cerca de las venas laterales de la cola. Histológicamente, la cola hinchada muestra inflamación, retención de líquido intersitial, deposición adiposa y fibrosis, similar al linfedema clínico24,27,28,40.
Una trampa de este modelo es el riesgo de lesión en las venas laterales y la vasculatura. Realizar el procedimiento en la escisión de la piel de espesor completo utilizando la ampliación de la lupa puede provocar sangrado venoso inadvertido durante la disección. La escisión cuidadosa bajo alta ampliación estereoscópica facilita una mayor precisión para permanecer dentro del plano vascular entre la adventicia del vaso y la capa subdérmica. Otra dificultad es que la necrosis de la cola ocurre con una frecuencia tan alta como 30%30,ya que la lesión del vaso aumenta en gran medida el riesgo de necrosis de la cola. El modelo margina la necrosis de la cola con (1) el uso de un microscopio quirúrgico para una disección meticulosa y (2) la confirmación de la permeabilidad de los vasos mediante imágenes de motas láser41. Si se identifica una lesión vascular, el animal debe ser retirado del estudio. Otros investigadores han utilizado la inyección de microesfera intracardíaca para evaluar la perfusión arterial22. La imagen de manchas láser permite cuantificar la cinética del flujo sanguíneo de las venas además de las arterias41. Esta técnica mínimamente invasiva puede proporcionar datos precisos de microperfusión. 41
El volumen de la cola se utiliza como variable de resultado fenotípica del modelo. La evaluación de la función linfática de la cola en el modelo también se utiliza para evaluar el efecto experimental. Utilizamos la linfangiografía láser de infrarrojo cercano para evaluar la función linfática en la cola del ratón. Esto visualiza directamente el flujo linfático en tiempo real en el animal vivo. La linfangiografía con láser ICG también se usa comúnmente clínicamente durante los procedimientos troapéuticos microquirúrgicos linfáticos, como la anastomosis linfovenosa, por lo que se traduce bien10. Clínicamente, esto facilita el mapeo linfático introperativo y la identificación de vasos linfáticos diana para conectarlos en venas en la anatomosis linfovenosa para tratar el linfedema7,10. Una trampa del uso de la linfangiografía láser ICG es la facilidad con la que la cola del ratón y otros materiales pueden recubrirse con ICG, lo que resulta en una fluoresencia no específica y dificulta la visualización adecuada de los linfáticos. Por lo tanto, cambiamos los guantes inmediatamente después de la manipulación y administración de ICG para minimizar este riesgo.
TNT fue desarrollado inicialmente para la reprogramación de tejidos in vivo33. Se utiliza como una plataforma de transferencia de genes, que incluye más ampliamente el rescate de la neuropatía periférica diabética y la reparación de nervios aplastados34,36 y utiliza tres componentes esenciales: (1) un nanochip de silicona para la transferencia de genes basada en nanoagujas; (2) una carga de ácido nucleico (plásmidos con ORF o siRNAs); y (3) una fuente de alimentación estándar. TNT facilita la entrega directa, transcutánea y no viral de genes con un campo eléctrico de enfoque rápido. Se ha utilizado para disminuir la isquemia de las extremidades mediante el aumento de la neovascularización en un modelode ratón 33. Más recientemente, TNT2.0 se ha utilizado para etiquetar exosomas en el sitio de la herida35. El uso de TNT en el modelo de linfedema de cola de ratón ofrece un futuro emocionante para la administración de terapias basadas en genes.
Una limitación traslacional del modelo de linfedema de cola de ratón ha sido la resolución espontánea del linfedema21,22,ya que la hinchazón de la cola se resuelve después de 20-30 días en algunos modelos experimentales21. En el modelo, el volumen de hinchazón de la cola, medido por la ecuación del cono truncado comúnmente utilizada37,se ha mantenido durante 15 semanas sin exhibir resolución. Quizás las mejoras de la técnica han maximizado la persistencia del linfedema. Las modificaciones de la técnica incluyen la disección completa bajo aumento microcópico, la evaluación de manchas láser de la vasculatura de la cola para garantizar el rigor para el origen linfático del linfedema, la evaluación funcional con linfangiografía láser ICG y TNT2.0 para la administración terapéutica de genes. El modelo modificado de linfedema en la cola de ratón es un modelo animal reproducible y clínicamente traducible de linfedema.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de subvención proporcionados por la Beca Académica de la Asociación Americana de Cirujanos Plásticos y el Departamento de Defensa W81XWH2110135 a AHH. Subvención de la Fundación de Educación e Investigación en Cirugía Estética a MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 y R01DK125835 a CKS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tegaderm Film | 1626W | ||
| Surgical Microscope | Leica, Wetzlar, Germany | MSV266 | |
| Adherent Dressing (Tegaderm) | 3M, St. Paul, Minn. | 1626W | |
| Laser speckle (Pericam PSI System ) | Perimed AB, Stockholm, Sweden) | PSIZ | |
| Near-infrared laser (LUNA) | Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada) | LU3000 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth | Fine Science Tools (USA) Inc. | 11019-12 | |
| V-Hook | Fine Science Tools (USA) Inc. | 18052-12 | |
| Scalpel SS NO15 | Fischer Scientific | 29556 | |
| Disposable Needle 30GX1 | Fischer Scientific | 305128 | |
| Operating Scissors | Fischer Scientific | 12-460-796 | |
| Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in | Fischer Scientific | 50-118-4255 | |
| Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge | Fine Science Tools (USA) Inc. | 15024-10 | |
| Cardiogreen | Sigma | I2633-25MG | |
| IsosulfanBlue (Lymphazurin) 50 mg/5ml | Mylan | 67457-220-05 |
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