Summary
ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。
Abstract
新血管新生は、通常、既存の正常血管系から初期化され、初期段階における内皮細胞(ECs)の生体力学的微小環境は、次の新血管化の過程から劇的に変化する。新血管新生の異なる段階をシミュレートするモデルはたくさんありますが、正常な血管系微小環境の対応する刺激の下で新血管新生の初期プロセスをキャピテーションする in vitro 3Dモデルはまだ欠けています。ここでは、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣した インビトロ 3Dモデルを再構築しました。MIENモデルはマイクロ流体発芽の破片および自動制御、非常に能率的な循環システムを含んでいる。内皮でコーティングされた機能的で透過性のマイクロチャネルが形成され、マイクロ流体発芽チップで発芽のプロセスをシミュレートした。新血管形成の初期の生理学的微小環境は、マイクロ流体制御システムで再現され、それによって、ECは高い発光せん断応力、生理学的経皮流、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布に同時に曝露されるであろう。MIENモデルは新血管新生メカニズムの研究に容易に適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学の適用のための低コストのプラットホームとして潜在的な約束を保持する。
Introduction
新血管新生は、成人における2つの主要なプロセス、血管新生および動脈新生5を含む多くの正常および病理学的プロセス1、2、3、4で起こる。血管内皮成長因子(VEGF)6のような最もよく知られた成長因子のほかに、機械的刺激、特に血流誘発せん断ストレスは、新血管新生7の調節において重要である。我々が知っているように、せん断応力の大きさと形態は脈管構造の異なる部分で劇的かつ動的に変化し、血管細胞8、9、10、11、12に重要な影響を及ぼす。これまでの研究では、せん断応力が、細胞表現型の変化、シグナル伝達、遺伝子発現、および壁画細胞13、14、15、16、17、18、19、20を含むECsの様々な側面に影響を及ぼす可能性があることを示している。したがって、新血管新血管化21、22、23、24を調節する。
したがって、新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境でのプロセスをvitroで再構築することが重要である。近年、マイクロ血管を作り、微細構造とマイクロ流体技術の進歩を生かして、マイクロ環境25、26、27を精密に制御するモデルが確立されています。これらのモデルでは、マイクロ血管は、ヒドロゲル28、29、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体チップ30、31、32または3Dバイオプリンティング33、34によって生成することができる。光性せん断応力22、23、35、36、経内皮流量37、38、39、40、血管新生因子41、42、株/ストレッチ43、44、45、および他のタイプの細胞との共培養など、微小環境のいくつかの側面が模倣および制御されている。通常、大きな貯留層またはシリンジポンプを用い、浸透媒体を提供した。これらのモデルの経皮流は、リザーバーとマイクロチューブ22、23、38、40の間の圧力降下によって作成された。しかし、機械的な微小環境は、このように絶えず維持するのが難しかった。高い剪断応力を伴う高い流量を灌流に使用すると、経年皮流の流れが増加し、その後生理学的レベルを超える。以前の研究では、新血管新生の初期の時期に、経内皮流の速度は、通常0.05 μm/s 8の下で、無傷のECと基部膜のために非常に低いことが示されました。一方、血管系における発光せん断応力は大きく異なりますが、5-20 dyn/cm2、11、47の平均値で比較的高い。今のところ、以前の作品における経皮流の速度は、一般的に0.5-15 μm/s22、38、39、40の間に保たれているが、発光せん断応力は通常10 dyn/cm223の下にあった。高い発光せん断応力と経経皮流の生理学的レベルに同時にICを常に曝露することは困難な対象です。
本研究では、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣する in vitro 3Dモデルについて説明する。マイクロ流体チップと自動制御、高効率循環システムを開発し、灌流マイクロチューブを形成し、発芽プロセスをシミュレートしました。MIENモデルでは、新血管新生の初期に刺激されたICの微小環境が最初に再現される。高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々なVEGF分布によって同時に、ICを刺激することができます。MIENモデルを確立するステップと注意点を説明し、他の研究者への参考文献を提供することを期待しています。
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Protocol
1. ウエハ準備
注:このプロトコルは、この研究で使用されるSU-8 2075陰性フォトレジストに固有のものです。
- スピンコーターにメタノールとイソプロパノールを使用してシリコンウエハを3~5回洗浄します:最初に500rpmで15 sスピンし、3,000rpmで60s回転します。
- シリコンウェーハをホットプレートに移し、180°Cに予熱し、ウエハを10分間焼きます。
- ホットプレートからシリコンウェーハを取り出し、室温まで冷却します。スピンコーティングを進める前に、圧縮空気でウエハを再び清掃してください。ウエハの中央にSU-8 2075フォトレジストの4 mLを塗布します。
- スピンコーターの特徴高さ70μmを取得します:最初に500rpmで12 s回転し、次に2,100 rpmで50s回転します。
- ホットプレートでウエハースを柔らかく焼く:最初に65°Cで8分間焼き、次に95°Cで20分間焼きます。 次に、ホットプレートからシリコンウエハを取り出し、リソグラフィの前に室温まで冷却します。
- フォトレジストフィルムにフォトマスクを置きます。200 mJ/cm 2 の総露出を達成するためにリソグラフィ装置とウエハを露出します。
注:フォトマスクにはチップの9セットのパターンが含まれているため、毎回9個のマイクロ流体発芽チップを製造できます。 - ポストは、ホットプレート上のウエハースを露出させます:最初に65°Cで5分間焼き、次に95°Cで20分間焼きます。 次に、シリコンウェーハをホットプレートから取り出し、現像する前に室温まで冷却します。
- 開発を開始するためにSU-8開発者(PGMEA)で満たされたガラスペトリ皿にウエハーを転送します。
注意:開発者は目や気道に刺激を与えています。ヒュームフードで開発を行います。操作中にスプラッシュゴーグル、ニトリル手袋、航空会社のマスクを着用してください。 - 流路の方向に沿って皿を優しく振り、10分後に開発者を変えます。
- パターンが明確に観察されるまで、ステップ1.9を3〜5回繰り返します。
注:ウエハーにフォトレジスト残渣が残っていないか確認し、それ以外の場合は、再び開発者のウエハをすすいでください。 - ウエハースを予熱ホットプレートセットを120°Cに移し、30分間焼きます。
- シラン35μLをカバースリップにピペットし、ウエハーと一緒にカバースリップをデシケータに入れ、真空を引っ張ります。デシケータを密封し、柔らかいリソグラフィプロセス中にPDMSの接着を防ぐためにウエハをシラナナイズするために4時間真空下でウエハを残します。
注意:シランは有毒です。中毒を防ぐために、ヒュームフードでのシナナイゼーションを行い、取り扱い中にニトリル手袋を着用してください。 - デシケータから真空を放します。シラナイズされたウエハーを予熱したホットプレートに取り出し、65°Cで2時間焼きます。
- 必要になるまで、ウエハーをきれいなペトリ皿に入れます。
2. マイクロ流体発芽チップの製造
- プラスチックビーカーに20gの塩基剤と2gの硬化剤(10:1比)を組み合わせ、混合ロッドと十分に混ぜます。
- ビーカーをデシケーターに入れ、真空を1時間引き、PDMS混合物中の気泡を取り除きます。
- PDMS混合物をペトリ皿のウエハースに注ぎ、ペトリ皿をデシケーターに戻し、さらに30分間脱気します。
注:両面粘着テープを使用してウェハをペトリ皿の底に接着し、脱気および硬化時にウェハが水平に保たれるようにするのに役立ちます。 - デシケータからペトリ皿を取り出し、80°Cの乾燥オーブンに3時間置いて治します。
- 慎重にウェハからPDMS層を分離し、パターンに従ってメスで9チップに層をカットします。
注:分離後にフィーチャーの側面を上に置いてください。 - 1 mm と 3.5 mm のバイオプシー パンチを使用して、各チップから 2 つのヒドロゲル注入ポートと 4 つのメディアインジェクション ポートをそれぞれパンチします。
- パンチチップを残渣のないテープで洗浄し、PDMS残渣を除去します。チップと9個のガラスカバーリップをプラズマクリーナーに入れ、30 sの酸素プラズマで処理して表面に共有結合を形成します。
- チップとカバーリップを取り出します。チップのフィーチャー側をカバースリップに取り付けます。
- 取り付けたチップを80°Cの乾いたオーブンに1時間置き、ボンディングを強めます。
- 使用前にチップをオートクレーブし、手順の残りの部分のために無菌に保ちます。
3. 表面改質とヒドロゲル注入
- 各チップに対して、40 μLの40 μLのポリD-リジン(PDL)を1 mg/mL(PDL)に入れ、ヒドロゲル注入口からチップ内のチャネルに注入します。
注: PDL が、特にポートの近くの狭いチャネルでチャネルを満たしていることを確認してください。 - チップを37°Cで4時間インキュベートし、PDMSの表面を修正します。
- 滅菌水のピペット200 μLを、ハイドロゲル注入ポートからチップ内のチャネルに注入してPDLを洗い流します。
- 120°Cの乾燥したオーブンに3時間取り出し、疎水性を回復させます。
- 氷の上に滅菌チューブを置き、次の式として使用されるタイプIコラーゲンの体積を計算します。
最終容積 (50 μL) x 最終コラーゲン濃度 (本研究では 3 mg/mL) / ボトル内濃度 = 添加するボリュームコラーゲン - 以下の式として使用するNaOHの体積を計算します。
(添加するボリュームコラーゲン)x 0.023 =体積1 N NaOH - 50 μLのヒドロゲルを次のプロトコルとしてチューブに調製します:10x PBSの5μL、フェノールレッドの0.5 μL、計算された体積の1 N NaOH、4 μLの1 mg/mLフィブロネクチン、タイプIコラーゲンの計算された体積を順番に加えます。dH2Oの適切な量を加えて、総容積が50μLに達するようにします。
注:氷上のすべての操作を実行します。酸ベースの指標としてフェノールレッドを使用して、ヒドロゲルのpHの視覚的決定を支援します。最終的なヒドロゲルは、pHが約7.4で、剛性が約15kPa49のときにオレンジ色に終わります。 - 各チップのヒドロゲルのピペット2〜3 μLを、ハイドロゲル注入口から中央ヒドロゲルチャネルにゆっくりと注入します。
- 37°Cで30分間インキュベートし、ゲル化を可能にします。
注:すぐに使用されていない場合は、無菌水の1 mLで密封箱にチップを密封します。密閉チップは、37°Cで、せいぜい24時間保存することができます。
4. 細胞の播種
- 125 μg/mL フィブロネクチンのピペット 20 μL を細胞培養チャネルの 1 つの媒体注入口に入れておく。
- 細胞培養チャネルのポートにハサミを合わせるようにピペットチップを切ります。
- ピペットチップを細胞培養チャネルの他の媒体注入口に挿入します。次いで、細胞培養チャネルから空気をパイプアウトし、フィブロネクチンで満たす。
- チップを37°Cで1時間インキュベートします。
- 細胞の播種前に、各媒体注入口にECM媒体の20 μLをピペットし、30分間37°Cでチップをインキュベートする。
- 次に、すべてのメディア インジェクション ポートのすべてのメディアをパイプアウトします。
- 次に、細胞培養チャネルの1つの培地注入口に細胞懸濁液の5μLをピペットする。その後、内皮細胞は、差動静圧下でチャネル全体に急速に広がった。
注:培養フラスコからヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をトリプシンして400 x gで遠心分離することによって細胞懸濁液を調製する。その後、チューブ内の細胞を10個の7 個の細胞/mLに再懸濁させる。 - 約4~6μLのECMメディアを他のポートに加え、静水圧を調整し、セルの移動を停止します。
- 細胞インキュベーターにチップを取り出します。次いで、内皮細胞が細胞培養チャネル2時間後の内部表面の周りにコートするまで、30分ごとにチップを裏返す(図1)。
注:チップを逆さまにするには、カバースリップの背面に少し水を入れます。その後、チップはペトリ皿のカバーに取り付けることができます。 - ピペットチップを使用して、注入ポートに取り付けられたセルを非常に慎重に取り除きます。
- 次に、4つの有刺鉄線の女性ルアーアダプターをメディアインジェクションポートに挿入し、ECMメディアで充填します。
注:アダプターは、流路内の細胞に栄養素を提供するために流体貯留層として機能することができます。 - 細胞インキュベーターへのチップを取り除きます。Luer アダプタの ECM メディアを 12 時間ごとに変更します。
5. FITC-デキストラン拡散透過性の測定
注:マイクロ血管のバリア機能を評価するために、細胞内層の有無にかかわらずEC培養チャネルの拡散透過性が評価される。
- ヒドロゲルを注入したマイクロ流体発芽チップを取り出します。
- 手順 4.1 ~ 4.6 を繰り返します。
- すべての Luer アダプターを取り外し、4 つのメディアインジェクションポート内のすべてのメディアをパイプアウトします。
- チップを共焦点レーザー走査顕微鏡に置きます。
- 500 μg/mL 40 kDa FITC デキストランを含む培養培地のパイプ5 μLを、細胞培養チャネルの1つのポートに入れた。
注:40 kDa FITCデキストランはVEGF-165(39-45 kDa)と同様の分子サイズを有します。 - 30 s の場合は 3 s ごとに画像をキャプチャします。これにより、細胞内層を含まない拡散透過率が測定される。
- HUVECが細胞培養チャネルでコンフルエント化した後、マイクロ流体発芽チップを取り出します。
- 手順 5.3 ~ 5.5 を繰り返します。
- 30 s の場合は 3 s ごとに画像をキャプチャします。これにより、細胞内層を用いた拡散透過率が測定される。
- 次の修正式50を用いて経時の蛍光強度の変化を定量することにより、拡散透過性を算出する。
Pd= (I2- I1)/ (I1- Ib)·Δt)·S/d
ここで、Pdは拡散透過係数、I1は初期時点での平均強度、I2はデルタ時間(Δt)後の平均強度(Δt)、Ibはバックグラウンド強度、Sは蛍光画像のチャネルの面積、dは蛍光画像におけるマイクロポストの全間隔である。現在の作業では、Δtは9sに設定されています。
注:この方程式は、チップ内の蛍光の拡散方向がECチャンネルからヒドロゲルチャネルに対してのみであるため、元の50とは若干異なりますが、これはすべての放射方向に拡散する円形のチューブとは異なります。
6. マイクロ流体制御システムのセットアップ
注:本研究のマイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプ、電磁ピンチバルブ、バブルトラップチップ、マイクロ流体チップ、マイクロペリスタリックポンプ、およびリザーバで構成されています。システムの各部分は、同じ機能を実行できる代替手段によって置き換えることができます。
- バブルトラップチップの製造
注:バブルトラップチップは、循環中の気泡を除去するために使用されます。チップは3つのPDMS層から成っている。最上層は、液体チャンバとしてグリッド構造を形成するためにソフトリソグラフィを使用して構築されます。グリッド構造の各チャンネルは幅100μmです。下層は穴のある PDMS チャンクです。2つの層の間に、100 μmの薄いPDMSフィルムが敷設される。- 手順1を繰り返して、バブルトラップチップ用のウェハを準備します。
- 手順 2.1 ~ 2.5 を繰り返して、バブル トラップ チップの最上層と最下層を作成します。
注:一番上のレイヤーのフォトマスクには3組のパターンが含まれているので、パターンに従ってPDMS層を3つのチップにカットします。 - 3.5 mm バイオプシー パンチを使用して、最上層の入口と出口チャネルの端に 6 つの穴をパンチします。
- 最上層のパターンに従って6mm生検パンチを使用して、下層の対応する位置に2つの穴を開けます。
- ステップ 2.1~2.2 を繰り返して、10 g の PDMS 混合物を調製し、洗浄されたシリコンウエハの中央に注ぎます。
- 次のスピンプロトコルを適用して100 μm PDMSフィルムを製造:500 rpmで15 sスピンし、スピン速度を1,300rpmに上げ、45秒保持します。
- ウエハースを予熱ホットプレートセットを180°Cに移し、30分間焼きます。
- PDMS残基を除去するために残渣のないテープでパンチ層をきれいにします。上層とウエハーをプラズマクリーナーに入れ、30 sの酸素プラズマで処理し、表面に共有結合を形成します。
- トップレイヤーとウエハーを取り出します。上部レイヤーのフィーチャ側を PDMS フィルムに取り付けます。
- フィルムを針で上の層の端に沿って慎重に切ります。
- フィルムをウエハーからゆっくりと分離し、切り屑を裏返して分離後にフィルム側を上にします。
- 底の層と取り付けたチップをプラズマクリーナーに入れ、酸素プラズマで30sを再び処理します。
- 底の層と取り付けられたチップを取り出します。PDMSフィルムに底層を取り付けると、バブルトラップチップが行われます。
注: アタッチする際に、最下部レイヤーの穴を上のレイヤーのパターンに合わせます。 - チップを80°Cの乾燥オーブンに1時間置き、ボンディングを強めます。
- マイクロ流体制御システムを組み立てる
メモ:バブルトラップチップ、リザーバ、チューブ、コネクタなど、システムのすべての部品は、電子機器を除くオートクレーブ滅菌後に使用されます。クリーンベンチでマイクロ流体制御システムを組み立てます。- マイクロ流体制御システムを組み立てるには、2つのポリテトラフルオロエチレンチューブ、2つの短いシリコンチューブ、3つの長いシリコンチューブ、1つの有刺鉄線の女性ルアーアダプター、1つのYタイプコネクタ、および3つのLタイプコネクタを準備します。
注:ポリテトラフルオロエチレンチューブの利点は、低弾性であり、したがって、より少ないメディアは、パイプラインで必要とされます。これに対してシリコーンチューブは、高い弾性を有し、従って、ピンチバルブおよび蠕動ポンプに適している。 - シリンジに予熱(37°C)のECM培地10mLを充填します。
注意:予熱は、中液放出溶解ガスを助けます。 - ポリテトラフルオロエチレンチューブを有刺鉄ブされた女性ルアーアダプターで注射器に接続します。次に、ポリテトラフルオロエチレンチューブの他端をY型コネクタに接続します。
- 次に、2本の長いシリコンチューブをY型コネクタの他の2つの端に接続し、一方のチューブをリザーバに接続し、もう一方のチューブをバブルトラップチップに接続します。
- 別の長いシリコンチューブをリザーバーに接続します。
- 次に、2つの短いシリコンチューブを使用して、バブルトラップチップの最上層にあるすべての入口と出口穴を接続します。ポリテトラフルオロエチレンチューブをチップのバックエンドに接続します。
- 次に、注射器をマイクロシリンジポンプに固定します。
- 2本の長いシリコンチューブを電磁ピンチバルブにクリップします。
- 次に、電磁ピンチバルブを切り替えて、シリンジとリザーバの間のパイプラインを開きます。マイクロシリンジポンプを使用して媒体をリザーバーに注入し、チューブ内の空気を排出します。
- 次に、再度バルブを切り替えて、シリンジとバブルトラップチップの間のパイプラインを開きます。液体チャンバーとバブルトラップチップのバックエンドチューブを充填するためにメディアを注入します。
- マイクロ流体制御システムを組み立てるには、2つのポリテトラフルオロエチレンチューブ、2つの短いシリコンチューブ、3つの長いシリコンチューブ、1つの有刺鉄線の女性ルアーアダプター、1つのYタイプコネクタ、および3つのLタイプコネクタを準備します。
7. 内皮発芽アッセイ
注:位相コントラスト顕微鏡で組み立てられたステージトップインキュベーターを本研究で使用し、リアルタイムで発芽する過程を観察しています。ステージトップインキュベーターは、マイクロスコープステージ上で温度、湿度、CO2 制御を維持することができ、生細胞イメージングに適しています。しかし、機器はアッセイのために必要ではありません。ここで提供されるプロトコルは、基本的な細胞インキュベーターでも働くことができる。
- 細胞インキュベーターから内皮発芽チップを取り出す。
- 次いで、細胞培養側のルアーアダプターを除去する。マイクロ流体発芽チップのハイドロゲル注入口に2つのパイププラグを挿入します。
メモ:プラグは針から変換することができ、その主な機能は、メディアがこぼれるのを防ぐためです。 - バブルトラップチップのバックエンドチューブを細胞培養チャネルの1つのポートに接続します。
注:接続前にチューブに泡がないことを確認してください。 - T型コネクタを他のポートに挿入し、リザーバに接続された長いシリコンチューブに接続します。
- 長いシリコンチューブをマイクロペリスタリポンプにクリップします。
- 次に、エアフィルターを貯留槽に挿入します。
- 次に、マイクロ流体発芽チップをステージ上のインキュベーターに組み立てます。
- 次に、真空ポンプをTPUチューブでバブルトラップチップの底層の穴に接続します。
- マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するカスタムプログラムで循環量と流量を設定します(図2)。
注: 内皮細胞培養チャネル全体の流量は、従来の方程式に従って計算されます。
τ = 6μQ / Wh2
ここで、τは剪断応力(dyn/cm2)、μは培地の粘度(8.8 x 10-4 Pa)、Qは内皮細胞培養チャネル(ml/s)の流量、hはチャネル高さ(70μm)、Wはチャネル幅(1,000μm)である。培地の粘度は、同軸円筒型回転粘度計を用いて測定される。チャネルの高さおよび幅は、4倍の倍率で位相コントラスト顕微鏡を使用してあらかじめ決め、手動で確認する。循環量は5mLで、流量は85μL/分(細胞培養チャネルで平均0.2 m/s)で、計算に従って15 dyn/cm2のせん断応力が生じます。 - 次に、マイクロペリスタチックポンプの流量を設定します。
注:マイクロペリスタチックポンプの流量は、マイクロシリンジポンプよりもわずかに高く、メディアがこぼれるのを防ぎます。 - マイクロシリンジポンプをオンにします。そして、循環制御システムが確立される。
8. データ分析
注: スプラウトを定量化するために、スプラウトの正規化された領域、平均スプラウト長、および最長のスプラウト長が計算されました。結果は、3つの独立した研究から得られた平均±SEMを表す。統計的有意性(P<0.05)は、学生の t-testによって評価されます。
- PBSで4%パラホルムアルデヒドを15分間実験した後、マイクロ流体発芽チップ内の細胞および芽を修正します。4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール二塩酸塩(DAPI;1:1000;シグマ・アルドリッチ)10分間、そしてトリチウム・ファロイジン(P5285、1:100)で細胞骨格を染色する。シグマ・アルドリッチ) 1時間。各ステップ間の5分間隔で3回PBSで細胞を洗浄する。
- タイルモードでチップの共焦点画像を撮り、画像編集ソフトウェアを使用してそれらをステッチします。
- プログラミング ソフトウェアのカスタム コードを使用して Z-projection 画像の蛍光ピクセル数をカウントし、発芽の正規化された領域を定量化します (「 補足ファイル」を参照)。
- Z投影画像のスプラウトの各先端を手動で識別してラベル付けし、平均スプラウト長と最長スプラウト長を定量化する別のカスタムコードを使用して、ECs基質膜へのスプラウトチップ間の距離を計算 します(補足ファイルを参照)。
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Representative Results
ここで提示した新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣するin vitro 3Dモデルは、マイクロ流体発芽チップとマイクロ流体制御システムで構成されていました。マイクロ流体発芽チップは、以前の出版物22、23、37、40、51、52、53から最適化されました。簡単に言えば、3つのチャネルと6つのポートが含まれていました:内皮細胞培養チャネルと4つのメディア注入ポートを備えた液体チャネル、および2つのヒドロゲル注入ポートを備えた中央ヒドロゲルチャネル(図3)。マイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプ、電磁ピンチバルブ、バブルトラップチップ、マイクロ蠕動ポンプ、および培地リザーバから構成された(図4)。マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するためにカスタムプログラムを使用し、流量と循環量を設定することができます。システム・エラーによる複数サイクルの後にボリュームのわずかな変化を修正するために補償量が導入されました。灌流に使用される媒体を最小限に抑えるために、媒体リサイクル用に電磁ピンチバルブを導入しました。電磁ピンチバルブは、サイクル内の2つの段階でマイクロ流体システムを作るために2つの状態を切り替えることができます。注入段階では、培養培地をマイクロシリンジポンプからマイクロ流体発芽チップにゆっくりと注入した。リサイクル段階では、培養培地を、リザーバーからマイクロシリンジポンプに非常に迅速に抽出した。
当社のMIENモデルにおけるマイクロ容器のバリア機能を、40kDa FITC-dextranの拡散透過係数(Pd)を測定して評価しました。図5に示すように、セルライニングを有する静培養チップのPdは0.1±0.3 μm/s、セルライニングのない空のチャンネルのPdは5.4±0.7μm/sです。次いで、静的および灌流下での内皮発芽アッセイをMIENモデルで行った。静的な条件では、播種後約4時間で内皮発芽が発生し、スプラウトは中央ヒドロゲルチャネルを横切って約48時間で反対側に移動する。もやしは48時間後に徐々に劣化した。5 または 15 dyn/cm2せん断応力(細胞培養チャネルで平均 0.07 または 0.2 m/s)に 24 時間曝露した後、多角形から変化する流れ方向に位置合わせされた IC、石畳の形状をフシフォームに変え、噴出の度合いはせん断応力の増加に伴って減少した(図 6)。しかし、せん断条件下のもやしは、静的培養条件下よりも安定していた。彼らは灌流の下で48時間以上維持することができた。定量的統計によると、内皮芽芽は発芽面積、平均芽長、および最長の芽長の点で有意に減少した(図7)。
図1:内皮細胞は細胞培養チャネルの内部表面の周りにコートする。 HUVECは、細胞播種後2時間の細胞培養チャネルに均等に分散される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するカスタムプログラム。 流量と循環量を設定できるカスタムプログラムのメインページ(アップ)とサブページ(下)システム・エラーによる複数サイクルの後にボリュームのわずかな変化を修正するために補償量が導入されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: マイクロ流体発芽チップの概略図 このチップには、内皮細胞培養チャネルと4つのメディア注入ポートを備えた液体チャネル、および2つのヒドロゲル注入ポートを備えた中央ヒドロゲルチャネルの3つのチャネルと6つのポートが含まれています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: マイクロ流体制御システムの概略図 マイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプ、電磁ピンチバルブ、バブルトラップチップ、マイクロ蠕動ポンプ、および培地リザーバから構成されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:40kDa FITCデキストランの拡散透過性(Pd)。セルライニングを有する静培養チップのPdは0.1±0.3 μm/sであり、セルライニングのない空のチャネルのPdは5.4±0.7 μm/s <です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:異なるせん断条件下での内皮発芽の代表的な画像。 24時間の静的培養後、HUVECは細胞培養チャネルから、マイクロポストおよびヒドロゲル内の大量の芽を介して隣接するヒドロゲルチャネルに侵入する。5または15 dyn/cm2 せん断応力に24時間曝露した後、発芽の程度は明らかに減少する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: 発芽領域、平均スプラウト長、最長スプラウト長の定量化24時間の静的培養(S0)または5(S5)または15(S15)dyn/cm2の剪断応力に曝露した後、剪断応力の増加に伴って発芽度が低下する。*, p < 0.05;**、p < 0.01.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
長い間、新生血管のリアルタイム観察が問題となっていた。最近では、22,32,40,46,54を発芽させるために、ICと並ぶ透過血管を作り出すアプローチが開発されていますが、機械的微小環境は常に維持するのが難しいです。高い光のせん断応力と経皮流の低速度を受けるICの初期の生体力学的微小環境を模倣することは困難な対象のままである。ここでは、まず、生理学的微小環境を模倣した新生血管形成の初期事象をシミュレートするMIENモデルを発表した。MIENモデルにより、自動、効率的、かつバブルフリーの長期灌流が実現されます。生理学的レベルにとどまる経経皮流の実験中に、ICの発光せん断応力は、任意に随時変化させることができました。
MIENモデルの鍵は、経経皮流からICに対する発光流の影響を切り離す。このため、T型コネクタはECカルチャーチャンネルの出口ポートにクリエイティブに挿入されます。コネクタの一端は、マイクロペリスタリックポンプを介してリザーバに接続されています。コネクタのもう一方の端は、インキュベーターの空気にさらされます。圧力を高めるために余剰媒体が集まって圧力を高めることも、チャネル内に負圧を形成するために余分な媒体が引き離されることもないので、内皮細胞培養チャネル内の圧力を大気圧と同じに保ちます。このように、マイクロ流体発芽チップ後の流れ抵抗は非常に小さいため、高い発光せん断応力下でも経内皮流を生理学的範囲で維持することができる。
プロトコル内の重要なステップの1つは、中央ヒドロゲルチャネルにおけるヒドロゲルの注入に成功した点です。Huangららは、ゲルの充填成功は、マイクロ流体ゲルチャネル55内の毛細管力と表面張力のバランスをとることに依存することを提案した。彼らは、バランスを制御するための3つの異なる変数を発見しました:マイクロポスト間の間隔、デバイスの表面特性、およびヒドロゲル前駆体溶液の粘度。本モデルでは、マイクロ流体発芽チップの設計は、以前の作品22、23、37、40、51、52、53から最適化されています。3つのチャンネルを分離するためのマイクロポストの形状と間隔は、以前の計算と多数の実験に基づいて決定されます。また、PDLコーティングと高温焼成はPDMS表面を修正するために行われる。したがって、ヒドロゲル注入前に親水性と疎水性のバランスを調整してください。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、気泡の除去です。T型コネクタやマイクロペリスタルポンプによる実験中に大量の空気が循環媒体に溶け込み、泡が循環し、内皮細胞の機能に大きな影響を与えます。気泡を除去するために、マイクロ流体発芽チップの前にバブルトラップチップが導入されます。PDMS膜の高いガス透過性に基づいて動作します。気泡がトラップに入ると、小さく密なグリッド構造によって分散され、真空ポンプによって発生する負圧のために閉じ込められ、マイクロ流体発芽チップに前進することができません。また、PDMS膜を通して気泡が真空ポンプに接続された負圧穴に輸送され、最終的には消失する。それでも、実験中の気泡の形成には大きな注意が払われるべきです。パイプライン内のマイクロ流体発芽チップの前に気泡が見つかるとすぐに、マイクロシリンジポンプを直ちに停止します。そっと指でパイプラインをひるんで、気泡がバブルトラップチップに移動し、取り除きます。
新血管新生の初期微小環境は部分的に再現されるが、このMIENモデルにはいくつかの制限がある。血液誘発せん断応力や細胞外マトリックスの剛性などの内皮細胞の機械的微小環境は、新血管新生プロセス中に変化しています。血管新生前、内皮性地下膜は完全なバリア機能を持ったままであり、経皮流および間質流の低速度で高い発光せん断応力を生じさせる8,9。血管新生と動脈新生の発症時に顕著な事象は、地下分解のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)仲介であり、ECsの透過性および改造マトリックスを増加させ、血液誘発せん断応力および細胞外マトリックス剛性などの機械的微小環境の変化を引き起こします。本研究では、新血管新生の開始に焦点を当て、マイクロ流体発芽チップ内の機械的環境が生理学的状態をシミュレートするために安定的に保つように設計されています。しかし、機械的な微小環境の変化は、in vivoと同様に、ECsの発芽によって起こります。また、多くの以前の研究に似ています34,53,56,本モデルは、細胞外マトリックスとしてコラーゲンヒドロゲルを取ります.流れ誘発せん断応力の影響に焦点を当てると、剛性ヒドロゲルは1つだけ使用されます。しかし、細胞の挙動や新血管化に対するマトリックス剛性の重要な影響を考慮すると、コラーゲンの異なる剛性を研究する必要があり、コラーゲンの機械的特性がそのpH49に依存するため、コラーゲンのpHを調節することによって達成することができる。しかし、細胞の損傷を防ぐために、細胞播種前に残留酸または塩基を除去するために、ヒドロゲルをPBSで十分に洗い流す必要があることに注意することが重要です。また、インビボでECMの複合成分を模倣するために、マトリゲル、ヒアルロン酸(HA)、フィブリノーゲン等の各種ヒドロゲルを今後、本モデルの改良に用いるべきである。血圧誘発環状株は、血管細胞57の形態および機能を調節するもう一つの重要な血行力である。これまでの研究では、血管内皮基盤膜59におけるIV型コラーゲンの分解を介して、ヒト間葉系幹細胞58における血管新生因子の増強発現および誘導血管新生の増強が示されている。これらの結果は、血圧誘発株が新血管新生にも影響を及ぼす可能性があることを示した。このモデルは流れ誘発せん断応力の影響に焦点を当てているため、ハイドロゲルがチャネルに十分に固執せず、伸ばすと脱落するため、歪みを導入することは可能ではありません。今後の作品では、この困難を克服するために注意を払います。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国補助金援助の国立自然科学研究財団(助成金11827803、31971244、31570947、31570947、援助の国立自然科学研究財団によって支援されました。 11772036、61533016、U20A20390および32071311)、中国の国家主要研究開発プログラム(助成金2016YFC11011101および2016YFC1102202)、111プロジェクト(B13003)、自然科学4104(北京4104年)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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