Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrofluidisk modell for å etterligne første hendelse av neovaskularisering

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Her gir vi en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrollert, svært effektivt sirkulasjonsmikrofluidisk system som rekastatiserer det første mikromiljøet av neovaskularisering, slik at endotelceller (ECer) stimuleres av høyt luminalskjærstress, fysiologisk nivå av transendothelial flyt og ulike vaskulære endotelvekstfaktor (VEGF) distribusjon samtidig.

Abstract

Neovaskularisering initialiseres vanligvis fra en eksisterende normal vaskulatur, og det biomekaniske mikromiljøet av endotelceller (ECer) i første fase varierer dramatisk fra følgende prosess med neovaskularisering. Selv om det er mange modeller for å simulere ulike stadier av neovaskularisering, mangler en in vitro 3D-modell som kapitulerer den første prosessen med neovaskularisering under tilsvarende stimuleringer av normale vaskulaturmikromiljøer fortsatt. Her rekonstruerte vi en in vitro 3D-modell som etterligner den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN). MIEN-modellen inneholder en mikrofluidisk spirende chip og et automatisk kontrollsystem, svært effektivt sirkulasjonssystem. En funksjonell, perfuserbar mikrokanal belagt med endotel ble dannet og prosessen med spirende ble simulert i mikrofluidisk spirende chip. Det første fysiologiske mikromiljøet av neovaskularisering ble rekaitulert med mikrofluidisk kontrollsystem, der EC ville bli utsatt for høyt luminal skjærstress, fysiologisk transendothelial flyt og ulike vaskulære endotelvekstfaktor (VEGF) distribusjoner samtidig. MIEN-modellen kan lett brukes på studiet av neovaskulariseringsmekanisme og har et potensielt løfte som en rimelig plattform for narkotikascreening og toksikologiapplikasjoner.

Introduction

Neovaskularisering skjer i mange normale og patologiske prosesser1,2,3,4,som inkluderer to store prosesser hos voksne, angiogenese og arteriogenese5. Foruten de mest kjente vekstfaktorer, som vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF)6, mekaniske stimuleringer, spesielt blodstrømmen indusert skjær stress, er viktig i regulering av neovaskularisering7. Som vi vet, varierer størrelsen og formene for skjærstress dramatisk og dynamisk i forskjellige deler av vaskulaturen, noe som resulterer i viktige effekter på vaskulæreceller 8,9,10,11,12. Tidligere studier har vist at skjærstress kan påvirke ulike aspekter av EC, inkludert cellefenotypiske endringer, signaltransduksjon, genuttrykk og kommunikasjon med veggmalericeller13,14,15,16,17,18,19,20; dermed regulere neovaskularisering21,22,23,24.

Derfor, for å bedre forstå neovaskularisering, er det viktig å rekonstruere prosessen i naturlig cellulær mikromiljøin vitro. Nylig har mange modeller blitt etablert for å skape mikro-fartøy og gi presis kontroll over mikromiljø25,26,27, dra nytte av fremskritt i mikrofabrikasjon og mikrofluidisk teknologi. I disse modellene kan mikrobeholdere genereres av hydrogel28,29, polydimetylsiloxane (PDMS) mikrofluidiske chips30,31,32 eller 3D bioprinting33,34. Noen aspekter ved mikromiljøet, som luminal skjær stress22,23,35,36, transendothelial flyt37,38,39,40, biokjemisk gradient av angiogenefaktorer 41,42, belastning /strekk 43,44,45, og co-kultivert med andre typer celler32,46 har blitt etterlignet og kontrollert. Vanligvis ble et stort reservoar eller sprøytepumpe brukt til å gi perfundert medium. Transendothelial strømning i disse modellene ble opprettet av trykkfall mellom reservoaret og mikro-rør22,23,38,40. Imidlertid var det mekaniske mikromiljøet vanskelig å opprettholde hele tiden på denne måten. Transendothelial flyt ville øke og deretter overstige fysiologisk nivå hvis en høy strømningshastighet med høy skjær stress ble brukt for perfusjon. Forrige studie viste at i den første perioden av neovaskularisering er hastigheten på transendothelial strømning svært lav på grunn av intakte ECer og kjellermembran, vanligvis under 0,05 μm / s8. I mellomtiden, selv om luminal skjær stress i vaskulært system varierer sterkt, er det relativt høy med gjennomsnittlige verdier på 5-20 dyn / cm2,11,47. For nå har hastigheten på transendothelial flyt i tidligere arbeider generelt blitt holdt mellom 0,5-15 μm / s22,38,39,40, og luminal skjær stress var vanligvis under 10 dyn / cm223. Det er fortsatt vanskelig å stadig utsette ECer for høy luminal skjær stress og fysiologisk nivå av transendothelial flyt samtidig. 

I den nåværende studien beskriver vi en in vitro 3D-modell for å etterligne den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN). Vi utviklet en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrollsystem, svært effektivt sirkulasjonssystem for å danne perfusjonsmikrorør og simulere prosessen medspirende 48. Med MIEN-modellen blir mikromiljøet av ECer stimulert i den første perioden av neovaskularisering først rekakabilisert. ECer kan stimuleres av høy luminal skjær stress, fysiologisk nivå av transendothelial flyt og ulike VEGF distribusjon samtidig. Vi beskriver trinnene for å etablere MIEN-modellen i detalj og de viktigste punktene som skal tas hensyn til, i håp om å gi en referanse til andre forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Wafer forberedelse

MERK: Denne protokollen er spesifikk for su-8 2075 negativ fotoresist som brukes under denne forskningen.

  1. Rengjør silisiumwaferen 3 til 5 ganger med metanol og isopropanol på et spin-strøk som følger: første spinn for 15 s ved 500 o/min, og spinn deretter for 60 s ved 3000 o/min.
  2. Overfør silisiumwaferen til en kokeplate, som er forvarmet til 180 °C og stek waferen i 10 min.
  3. Fjern silisiumwaferen fra kokeplaten og avkjøl den til romtemperatur. Rengjør wafer igjen med trykkluft før du fortsetter med spin belegget. Påfør 4 ml av SU-8 2075 fotoresisten til midten av wafer.
  4. Få en funksjonshøyde på 70 μm på spin coater som følger: første spinn for 12 s ved 500 rpm, og deretter spinne for 50 s ved 2100 rpm.
  5. Myk bake wafer på en kokeplate som følger: først bake i 8 min ved 65 °C, deretter bake i 20 min ved 95 °C. Deretter fjerner du silisiumwaferen fra kokeplaten og kjøler den ned til romtemperatur før litografi.
  6. Plasser en fotomaske på den fotoresiste filmen. Utsett wafer med et litografiutstyr for å oppnå en total eksponering på 200 mJ/cm2.
    MERK: Fotomasken inneholder ni sett med mønstre av brikken, slik at den kan fremstille ni mikrofluidiske spirende chips hver gang.
  7. Post utsett wafer på en kokeplate slik: stek først i 5 min ved 65 °C, og stek deretter i 20 min ved 95 °C. Deretter fjerner du silisiumwaferen fra kokeplaten og kjøler den ned til romtemperatur før du utvikler den.
  8. Overfør wafer til et glass Petri skål fylt med SU-8 utvikler (PGMEA) for å begynne å utvikle.
    FORSIKTIG: Utvikleren irriterer øynene og luftveiene. Utfør utvikling i en røykhette. Bruk sprutbriller, nitrilhansker og flymaske under operasjonen.
  9. Rist fatet forsiktig langs retningen på strømningskanalen og endre utvikleren etter 10 min.
  10. Gjenta trinn 1,9 3-5 ganger til mønstrene kan observeres tydelig.
    MERK: Pass på at det ikke er noen fotoresistrester igjen på wafer, ellers skyll waferen i utvikleren igjen.
  11. Overfør wafer til et forvarmet kokeplatesett til 120 °C og stek den i 30 min.
  12. Pipet 35 μL silan på en dekkslips, og sett deretter dekkslipsen sammen med waferen inn i en desiccator og trekk vakuum. Forsegle desiccatoren og la wafer under vakuum i 4 timer for å silanize wafer for å hindre vedheft av PDMS under myk-litografi prosesser.
    FORSIKTIG: Silanen er giftig. For å forhindre forgiftning, utfør silanisering i røykhetten og bruk nitrilhansker under håndtering.
  13. Slipp vakuumet fra desiccatoren. Fjern den silaniserte waferen på en forvarmet kokeplate og stek den ved 65 °C i 2 timer.
  14. Oppbevar wafer i en ren petriskål til det er nødvendig.

2. Mikrofluidisk spirende chip fabrikasjon

  1. Kombiner 20 g basismiddel og 2 g herdingsmiddel (10:1-forhold) i et plastbeger og bland dem grundig med en blandestang.
  2. Plasser begeret i en desiccator og trekk vakuum i 1 time for å fjerne luftbobler i PDMS-blandingen.
  3. Hell PDMS-blandingen på waferen i petriskålen og legg petriskålen tilbake i desiccatoren, avgassing i ytterligere 30 min.
    MERK: Det er nyttig å bruke dobbeltsidig tape for å lime wafer på bunnen av petriskålen for å sikre at wafer holdes horisontal under avgassing og herding.
  4. Fjern petriskålen fra desiccatoren og legg den i en 80 °C tørr ovn i 3 timer for å kurere.
  5. Separer FORSIKTIG PDMS-laget fra waferen og kutt laget til ni sjetonger med en skalpell i henhold til mønsteret.
    MERK: Hold funksjonen side opp etter separasjon.
  6. Punch to hydrogel injeksjon porter og fire media injeksjon porter ut av hver chip ved hjelp av en 1 mm og en 3,5 mm biopsi punch, henholdsvis.
  7. Rengjør de stansede sjetongene med restfri tape for å fjerne PDMS-rester. Legg chips og ni glassdeksler i en plasmarenser og behandle dem med oksygenplasma i 30 s for å danne kovalent binding på overflaten.
  8. Ta ut sjetonger og dekkslips. Fest funksjonssiden av sjetongene på dekkglassene.
  9. Plasser de vedlagte sponene i en 80 °C tørr ovn i 1 time for å intensivere bindingen.
  10. Autoklav sjetongene før bruk og hold dem sterile resten av prosedyren.

3. Overflatemodifikasjon og hydrogelinjeksjon

  1. For hver chip, pipet 40 μL av 1 mg / ml poly-D-lysin (PDL) og injisere den i kanaler i brikken fra hydrogel injeksjon port.
    MERK: Kontroller at PDL fyller kanaler, spesielt i trange kanaler i nærheten av portene.
  2. Inkuber sjetongene ved 37 °C i 4 timer for å modifisere overflaten på PDMS .
  3. Pipet 200 μL sterilt vann og injisere den i kanaler i brikken fra hydrogel injeksjon port for å vaske ut PDL.
  4. Fjern sponene i en 120 °C tørr ovn i 3 timer for å gjenopprette hydrofobicity.
  5. Plasser på is et sterilt rør og beregn volumet av type I kollagen som skal brukes som følgende ligning.
    Endelig volum (50 μL) x Endelig kollagenkonsentrasjon (3 mg/ml i denne forskningen) / Konsentrasjon i flaske = volum kollagen som skal tilsettes
  6. Beregn volumet av NaOH som skal brukes som følgende ligning.
    (volum kollagen som skal legges til) x 0,023 = volum 1 N NaOH
  7. Forbered 50 μL hydrogel i røret som følgende protokoll: tilsett 5 μL μL 10x PBS, 0,5 μL fenolrødt, beregnet volum på 1 N NaOH, 4 μL 1 mg/ml Fibronectin, beregnet volum av type I kollagen i sin tur. Tilsett riktig mengde dH2O slik at det totale volumet når 50 μL. Bland alt innholdet i røret grundig.
    MERK: Utfør alle operasjonene på isen. Bruk fenolrød som en syrebasert indikator for å bistå i visuell bestemmelse av hydrogelens pH. Den endelige hydrogelen ender opp oransje når pH er ca 7,4 og stivheten er ca 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 μL hydrogel for hver chip og sakte injisere den i den sentrale hydrogel kanal fra hydrogel injeksjon port.
  9. Inkuber sjetongene ved 37 °C i 30 min for å tillate gelasjon.
    MERK: Forsegle sponene i en forseglet boks med 1 ml sterilt vann hvis de ikke brukes umiddelbart. Forseglede spon kan oppbevares ved 37 °C i det meste 24 timer.

4. Cellesåing

  1. Pipet 20 μL på 125 μg/ml Fibronectin i én medieinjeksjonsport på cellekulturkanalen.
  2. Klipp en pipettespiss for å passe til havnen på cellekulturkanalen med saks.
  3. Sett pipettespissen inn i den andre medieinjeksjonsporten på cellekulturkanalen. Deretter pipet ut luft fra cellekulturkanalen for å fylle den med Fibronectin.
  4. Inkuber sjetongene ved 37 °C i 1 time.
  5. Før cellesåing, pipet 20 μL ECM media inn i hver media injeksjon port og inkubere chips ved 37 ° C i 30 min.
  6. Deretter pipet ut alle mediene i alle media injeksjon porter.
  7. Deretter pipet 5 μL celle suspensjon i en media injeksjon port av celle kultur kanal. Deretter spredte endotelceller seg raskt over hele kanalen under differensialhydrostatisk trykk.
    MERK: Klargjør cellesuspensjonen ved å prøve å hjelpe menneskelige navlestrengendeotelceller (HUVECs) fra kulturkolben og sentrifugere dem på 400 x g. Deretter bruker cellene til 107 celler / ml i et rør.
  8. Tilsett ca. 4-6 μL ECM-medier i den andre porten for å justere det hydrostatiske trykket og stoppe cellebekjeks.
  9. Fjern sjetongene til celleinkubatoren. Deretter snu chips hver 30 min til endotelceller strøk rundt den indre overflaten av cellekulturkanalen 2 t senere (Figur 1).
    MERK: For å gjøre brikken opp ned, pipet litt vann på baksiden av dekkslippen. Deretter kan brikken festes til dekselet på petriskålen.
  10. Bruk pipettespissen til å fjerne de vedlagte cellene i injeksjonsportene svært nøye.
  11. Deretter setter du inn fire piggete kvinnelige Luer-adaptere i mediainjeksjonsportene og fyller med ECM-medier.
    MERK: Adapterne kan fungere som væskereservoarer for å gi næringsstoffer til cellene i kanalen.
  12. Fjern sjetongene til celleinkubatoren. Endre ECM-medier i Luer-adaptere hver 12.

5. Måling av FITC-dextran diffus permeabilitet

MERK: For å vurdere barrierefunksjonen til mikrokaret vurderes diffus permeabilitet av EC-kulturkanalen med eller uten cellefôr.

  1. Ta ut en mikrofluidisk spirende chip med hydrogel injisert.
  2. Gjenta trinn 4.1-4.6.
  3. Fjern alle Luer-adapterne og pipet ut alle medier i fire medieinjeksjonsporter.
  4. Plasser brikken på det konokale laserskanningsmikroskopet.
  5. Pipet 5 μL kulturmedier som inneholder 500 μg/ml 40 kDa FITC-dextran til en port av cellekulturkanal.
    MERK: 40 kDa FITC-dextran har lignende molekylær størrelse som VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Ta bilder hver 3 s for 30 s. Dermed måles diffus permeabilitet uten cellefôr.
  7. Ta ut den mikrofluidiske spirende brikken etter at HUVECs er samløpet i cellekulturkanalen.
  8. Gjenta trinn 5.3-5.5.
  9. Ta bilder hver 3 s for 30 s. Dermed måles diffus permeabilitet med cellefôr.
  10. Beregn diffus permeabilitet ved å kvantifisere endringer av fluorescerende intensitet over tid ved hjelp av følgende modifiserteligning 50.
    Pd= (I2- I1) / ((Jeg1- Jegb)· Δt) · S/d
    hvor, Pd er diffus permeabilitetskoeffisient, I 1 er den gjennomsnittlige intensiteten på et startpunkt, I 2 er den gjennomsnittlige intensiteten etter deltatid (Δt), jegb er bakgrunnsintensiteten, S er området av kanalen i fluorescensbilder, og d er det totale intervallet av mikroinnlegg i fluorescensbilder. I det nåværende arbeidet er Δt satt som 9 s.
    MERK: Den nåværende ligningen er litt forskjellig fra denopprinnelige 50, på grunn av diffusjonsretningen til fluorescensen i brikken er bare fra EC-kanalen til hydrogelkanalen, som ikke er som det sirkulære røret som sprer seg i all radial retning.

6. Oppsett av mikrofluidisk kontrollsystem

MERK: Det mikrofluidiske kontrollsystemet i den nåværende studien består av en mikrosprøytepumpe, en elektromagnetisk klypeventil, en boblefellebrikke, en mikrofluidisk chip, en mikroperistaltisk pumpe og et reservoar. Hver del av systemet kan erstattes av alternativer som kan utføre samme funksjon.

  1. Boble felle chip fabrikasjon
    MERK: Boblefellebrikken brukes til å fjerne luftbobler i omløp. Brikken består av tre PDMS-lag. Det øverste laget er konstruert ved hjelp av myk litografi for å danne rutenettstruktur som væskekammeret. Hver kanal av rutenettet strukturen er 100 μm bred. Det nederste laget er en PDMS-del med et hull. Mellom de to lagene legges en 100 μm tynn PDMS-film.
    1. Gjenta trinn 1 for å forberede wafer for boblefellechip.
    2. Gjenta trinn 2.1-2.5 for å fremstille det øverste laget og bunnlaget på boblefellebrikken.
      MERK: Fotomasken på det øverste laget inneholder tre sett med mønstre, så kutt PDMS-laget til tre sjetonger i henhold til mønsteret.
    3. Punch seks hull på enden av innløps- og utløpskanaler på det øverste laget ved hjelp av en 3,5 mm biopsipunch.
    4. Punch to hull på tilsvarende posisjon av bunnlaget ved hjelp av en 6 mm biopsi punch i henhold til mønsteret på det øverste laget.
    5. Gjenta trinn 2.1-2.2 for å forberede 10 g PDMS-blanding og hell den i midten av en rengjort silisiumwafer.
    6. Fremstille en 100 μm PDMS-film ved å bruke følgende spinnprotokoll: spinn for 15 s ved 500 o/min, øk sentrifugeringshastigheten til 1300 o/min og hold her i 45 s.
    7. Overfør wafer til et forvarmet kokeplatesett til 180 °C og stek den i 30 min.
    8. Rengjør de stansede lagene med restfri tape for å fjerne PDMS-rester. Plasser de øverste lagene og wafer i en plasma renere og behandle dem med oksygen plasma for 30 s for å danne kovalent binding på overflaten.
    9. Ta ut de øverste lagene og wafer. Fest funksjonssiden av de øverste lagene på PDMS-filmen.
    10. Klipp filmen forsiktig langs kanten av de øverste lagene med en nål.
    11. Sakte skille filmen fra wafer og snu chips for å gjøre filmen side opp etter separasjon.
    12. Legg de nederste lagene og festet chips i en plasma renere og behandle dem med oksygen plasma for 30 s igjen.
    13. Ta ut nederste lag og vedlagte sjetonger. Fest de nederste lagene på PDMS-filmen, og boblefellebrikkene er ferdige.
      MERK: Juster hullene på det nederste laget etter mønstrene på det øverste laget når du fester.
    14. Legg sponene i en 80 °C tørr ovn i 1 time for å intensivere bindingen.
  2. Montere det mikrofluidiske kontrollsystemet
    MERK: Alle deler av systemet, for eksempel boblefellebrikke, reservoar, rør og kontakter, brukes etter autoklavsterilisering, unntatt elektronisk utstyr. Monter det mikrofluidiske kontrollsystemet på en ren benk.
    1. For å montere det mikrofluidiske kontrollsystemet, klargjør du to polytetrafluoretylenrør, to korte silikonrør, tre lange silikonrør, en piggete hunn Luer-adapter, en Y-typekontakt og tre L-typekontakter.
      MERK: Fordelen med polytetrafluoretylenrør er lav elastisitet, derfor er det nødvendig med mindre medier i rørledningen. Silikonrør har derimot høy elastisitet, derfor er det egnet for klypeventilen og peristaltisk pumpe.
    2. Fyll sprøyten med 10 ml forvarmet (37 °C) ECM medium.
      MERK: Forvarming hjelper medium slippe oppløst gass.
    3. Koble et polytetrafluoretylenrør til sprøyten med en piggete lueradapter for hunn. Deretter kobler du den andre enden av polytetrafluoretylenrøret til en Y-typekontakt.
    4. Deretter kobler du to lange silikonrør til de to andre endene av Y-typekontakten med ett rør som kobles til reservoaret og det andre røret som kobles til boblefellebrikken.
    5. Koble et annet langt silikonrør til reservoaret.
    6. Deretter bruker du to korte silikonrør for å koble alle innløps- og utløpshull på det øverste laget av boblefellebrikken. Koble et polytetrafluoretylenrør til baksiden av brikken.
    7. Fest deretter sprøyten på mikrosprøytepumpen.
    8. Klip to lange silikonrør inn i den elektromagnetiske klemventilen.
    9. Deretter bytter du den elektromagnetiske klemventilen for å åpne rørledningen mellom sprøyten og reservoaret. Injiser mediet i reservoaret ved hjelp av en mikrosprøytepumpe for å avtrekke luft i røret.
    10. Bytt deretter ventilen igjen for å åpne rørledningen mellom sprøyten og boblefellebrikken. Injiser mediet for å fylle væskekammeret og bakendrøret på boblefellebrikken.

7. Endotelspirerende analyse

MERK: En trinntopp inkubator montert med fasekontrastmikroskop brukes i den nåværende studien for å observere spireprosessen i sanntid. Scenen topp inkubator kan opprettholde temperatur, fuktighet, og CO2 kontroll på mikroskop stadier, å være bra for live celle imaging. Men utstyret er ikke nødvendig for analysen. Protokollene som er gitt her kan også bes brukes i en grunnleggende celle inkubator.

  1. Ta ut endotelspirende chips fra celleinkubatoren.
  2. Deretter fjerner du Luer-adaptere på cellekultursiden. Sett to rørplugger inn i hydrogelinjeksjonsportene på den mikrofluidiske spirende brikken.
    MERK: Pluggene kan forvandles fra nåler, og hovedfunksjonen er å hindre at media søler.
  3. Koble backend-røret av boblefellebrikke til en port av cellekulturkanal.
    MERK: Pass på at det ikke er bobler i røret før tilkobling.
  4. Sett inn en T-typekontakt til den andre porten og koble den til langt silikonrør som er koblet til reservoaret.
  5. Fest det lange silikonrøret inn i den mikroperistaltiske pumpen.
  6. Sett deretter inn et luftfilter i reservoaret.
  7. Deretter monterer du den mikrofluidiske spirende brikken til scenen topp inkubator.
  8. Deretter kobler du vakuumpumpen til hullene i det nederste laget av boblefellebrikke med et TPU-rør.
  9. Sett opp sirkulasjonsvolumet og strømningshastigheten i det egendefinerte programmet, som styrer mikrosprøytepumpen og elektromagnetisk klemventil samtidig (figur 2).
    MERK: Strømningshastigheten på tvers av den endotelcellekulturkanalen beregnes i henhold til den klassiske ligningen.
    τ = 6μQ / Bt2
    hvor, τ er skjær stress (dyn / cm2), μ er viskositet av mediet (8,8 x 10-4 Pa • s), Q er strømningshastigheten over endotelcellekulturkanal (ml / s), h er kanalhøyde (70 μm), og W er kanalbredde (1000 μm). Viskositeten til mediet måles ved hjelp av et koaksial sylindertype rotasjonsviscometer. Høyden og bredden på kanalen er forhåndsbestemt og manuelt bekrefte ved hjelp av en fase kontrast mikroskop ved 4x forstørrelse. Sirkulasjonsvolumet er 5 ml og strømningshastigheten er 85 μL/min (gjennomsnittlig 0,2 m/s i cellekulturkanal) for 15 dyn/cm2 skjærstress i henhold til beregning.
  10. Deretter setter du opp strømningshastigheten til mikroperistaltisk pumpe.
    MERK: Strømningshastigheten til mikroperistaltisk pumpe er litt høyere enn mikrosprøytepumpen, for å hindre at mediet søler.
  11. Slå på mikrosprøytepumpen. Deretter er sirkulasjonskontrollsystemet etablert.

8. Dataanalyse

MERK: For å kvantifisere spirene ble det normaliserte området av spire, gjennomsnittlig spirelengde og lengste spirelengde beregnet. Resultatene representerer gjennomsnittlig ± SEM hentet fra tre uavhengige studier. Statistisk signifikans (P < 0,05) vurderes etter Studentens t-test.

  1. Fiks celler og spirer i mikrofluidisk spirende chip etter eksperimenter med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Flekkkjerner med 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) i 10 min og deretter flekke cytoskeleton med TRITC falloidin (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) for 1 t. Vask celler med PBS tre ganger ved 5 min intervaller mellom hvert trinn.
  2. Ta confocal bilder av chips i en flislegging modus og sy dem ved hjelp av bilderedigering programvare.
  3. Telle antall fluorescerende piksler av Z-projeksjon bilder ved hjelp av en tilpasset kode i programmering programvare for å kvantifisere normalisert område av spirende (Se Supplerende Fil).
  4. Identifiser og merk hver spiss av spirer manuelt i Z-projeksjonsbilder og beregn avstander mellom spiretips til ECs kjellermembran ved hjelp av en annen egendefinert kode for å kvantifisere gjennomsnittlig spirelengde og lengste spirelengde (se tilleggsfil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro 3D-modellen for å etterligne den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN) presentert her besto av en mikrofluidisk spirende chip og et mikrofluidisk kontrollsystem. Den mikrofluidiske spirende chip ble optimalisert fra tidligerepublikasjoner 22,23,37,40,51,52,53. Kort tid inneholdt den tre kanaler og seks porter: en endotelcellekulturkanal og en væskekanal med fire medieinjeksjonsporter, og en sentral hydrogelkanal med to hydrogelinjeksjonsporter (figur 3). Det mikrofluidiske kontrollsystemet besto av en mikrosprøytepumpe, en elektromagnetisk klypeventil, en boblefellebrikke, en mikroperistaltisk pumpe og et kulturmediumreservoar (figur 4). Et tilpasset program ble brukt til å kontrollere mikrosprøytepumpen og elektromagnetisk klypeventil samtidig, som strømningshastigheten og sirkulasjonsvolumet kan settes opp med. Et kompensasjonsvolum ble innført for å korrigere den lille volumendringen etter flere sykluser på grunn av systemisk feil. For å minimere mediet som brukes til perfusjon, ble det innført en elektromagnetisk klemventil for middels resirkulering. Den elektromagnetiske klemventilen kan bytte mellom to tilstander for å gjøre mikrofluidisk system i to faser i en syklus. I injeksjonsfasen ble kulturmediet langsomt injisert fra mikrosprøytepumpen til den mikrofluidiske spirende brikken. Mens du er i resirkuleringsfasen, ble kulturmediet svært raskt hentet fra reservoaret tilbake til mikrosprøytepumpen.

Barrierefunksjonen til mikrofartøyet i VÅR MIEN-modell ble vurdert ved å måle den diffuse permeabilitetskoeffisienten (Pd) på 40 kDa FITC-dextran. Som det er vist i figur 5, er P dav statisk kultivert chip med cellefôr 0,1 ± 0,3 μm / s, og P dtom kanal uten cellefôr er 5,4 ± 0,7 μm / s. Deretter ble endotelspirerende analyse under statisk og perfusjon utført i MIEN-modellen. Under statiske forhold oppstod endotelspirering ca 4 timer etter såing og spirene ville migrere over den sentrale hydrogelkanalen til den andre siden i ca 48 timer. Spirene brytes gradvis etter 48 timer. Mens etter 24 timer eksponering for 5 eller 15 dyn / cm2 skjær stress (gjennomsnittlig 0,07 eller 0,2 m / s i cellekultur kanal), ECs justert i strømningsretningen endres fra polygonal, brostein form til fusiform, og graden av spirende redusert med økningen av skjærstress (Figur 6). Spirene under skjærforhold var imidlertid mer stabile enn under statiske kulturforhold. De kunne opprettholde over 48 timer under perfusjon. Kvantitativ statistikk viste at endotelspiren gikk betydelig ned når det gjelder spireområde, gjennomsnittlig spirelengde og lengste spirelengde (figur 7).

Figure 1
Figur 1:Endotelceller belegger rundt den indre overflaten av cellekulturkanalen. HUVECs er jevnt spredt i cellekulturkanalen 2 timer etter cellesåing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2:Det tilpassede programmet som brukes til å styre mikrosprøytepumpen og elektromagnetisk klemventil samtidig. Hovedsiden (opp) og undersiden (ned) av det egendefinerte programmet som flythastigheten og sirkulasjonsvolumet kan settes opp med. Et kompensasjonsvolum ble innført for å korrigere den lille volumendringen etter flere sykluser på grunn av systemisk feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Den skjematiske av mikrofluidisk spirende chip. Brikken inneholder tre kanaler og seks porter: en endotelcellekulturkanal og en væskekanal med fire medieinjeksjonsporter, og en sentral hydrogelkanal med to hydrogelinjeksjonsporter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Det skjematiske i mikrofluidisk kontrollsystem. Det mikrofluidiske kontrollsystemet består av en mikrosprøytepumpe, en elektromagnetisk klypeventil, en boblefellebrikke, en mikroperistaltisk pumpe og et kulturmediumreservoar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Diffus permeabilitet ( Pd) på 40 kDa FITC-dextran. Pd av statisk kultivert chip med celle fôr er 0,1 ± 0,3 μm / s, og P d tom kanal uten celle fôr er 5,4 ± 0,7 μm / s. **, p < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative bilder av endotelspirer under forskjellige skjærforhold. Etter 24 timer statisk kultering invaderer HUVECs fra cellekulturkanalen inn i den tilstøtende hydrogelkanalen gjennom mikrostolper og et stort antall spirer i hydrogelen. Mens etter 24 timer eksponering for 5 eller 15 dyn / cm2 skjær stress, graden av spirende nedgang åpenbart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Kvantifisert spireområde, gjennomsnittlig spirelengde og lengste spirelengde. Etter 24 timer statisk kultur (S0) eller eksponering for 5 (S5) eller 15 (S15) dyna/cm2 skjærstress, reduseres graden av spirende stress med økningen av skjærstress. *, p < 0,05; **, s < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lang tid har sanntidsobservasjon av neovaskularisering vært et problem. Flere tilnærminger har blitt utviklet nylig for å skape perfused fartøy fôr med ECer og ved siden av ekstracellulær matrise for spirende22,32,40,46,54, men den mekaniske mikromiljøet er fortsatt vanskelig å opprettholde hele tiden. Det er fortsatt vanskelig å etterligne det første biomekaniske mikromiljøet av ECer, som utsettes for høyt luminalskjærstress og lav hastighet på transendothelial strømning. Her presenterte vi en MIEN-modell som for det første simulerer den første hendelsen av neovaskularisering i etterligne fysiologisk mikromiljø. Med MIEN-modellen oppnås automatisk, effektiv og boblefri langsiktig perfusjon. Luminal skjær stress på ECs kan eventuelt endres når som helst under eksperimenter med transendothelial flyt bor på fysiologisk nivå.

Nøkkelen til MIEN-modellen er å koble effekten av luminalflyt på ECer fra transendothelial flyt. For dette formål settes en T-type-kobling kreativt inn i utløpsporten til EC-kulturkanalen. Den ene enden av kontakten er koblet til reservoaret gjennom den mikroperistaltiske pumpen. Den andre enden av kontakten er utsatt for luft av inkubatoren. Det holder trykket inne i endeoksial celle kultur kanal det samme som atmosfærisk trykk, siden det er verken overskudd media samling for å øke trykket eller overflødig media blir trukket bort for å danne negativt trykk i kanalen. På denne måten er strømningsmotstanden etter mikrofluidisk spirende chip svært liten, slik at transendothelial strømning kan opprettholdes på fysiologisk rekkevidde selv under høyt luminal skjærstress.

Et kritisk skritt i protokollen er vellykket injeksjon av hydrogel i sentral hydrogelkanal. Huang et al. foreslo at vellykket fylling av gelene avhenger av å balansere kapillære krefter og overflatespenning i mikrofluidisk gelkanal55. De fant tre forskjellige variabler for å kontrollere balansen: avstanden mellom mikrostolper, enhetens overflateegenskaper og viskositeten til hydrogelforløperløsningene. I den nåværende modellen er utformingen av mikrofluidisk spirebrikke optimalisert fra tidligere arbeider22,23,37,40,51,52,53. Geometrien og avstanden mellom mikroinnlegg for å skille tre kanaler bestemmes basert på tidligere beregninger og mange eksperimenter. Videre utføres PDL-belegg og høy temperatur baking for å modifisere PDMS-overflaten; Dermed justerer du balansen mellom hydrofilisitet og hydrofobiitet før hydrogelinjeksjon.

Det andre kritiske trinnet i protokollen er fjerning av bobler. En stor mengde luft vil oppløses i sirkulasjonsmedium under forsøket på grunn av T-type-kontakten og mikroperistaltisk pumpe, noe som resulterer i bobler i omløp og i stor grad påvirker funksjonen til endotelceller. For å fjerne bobler introduseres en boblefellebrikke før mikrofluidisk spirende chip. Det fungerer basert på den høye gasspermeabiliteten til PDMS-membranen. Når bobler kommer inn i fellen, blir de spredt av den lille og tette rutenettstrukturen og fanget på grunn av det negative trykket som genereres av vakuumpumpen, slik at de ikke beveger seg fremover i den mikrofluidiske spirende chipen. Videre transporterer boblene gjennom PDMS-membranen inn i trykkhullet som er koblet til vakuumpumpen og forsvinner til slutt. Likevel bør det rettes stor oppmerksomhet mot dannelsen av bobler under forsøket. Så snart det er funnet bobler før mikrofluidisk spirende chip i rørledningen, stopp mikrosprøytepumpen umiddelbart. Flinch forsiktig rørledningen med fingeren for å la boblene flytte til boblefelle chip og fjernes.

Selv om det første mikromiljøet av neovaskularisering er delvis rekakabilisert, er det noen begrensninger i denne MIEN-modellen. De mekaniske mikromiljøene til endotelceller som blodindusert skjærstress og ekstracellulær matrisestivhet endres under neovaskulariseringsprosessene. Før neovaskularisering er endeoktelkjembranen fortsatt intakt med fullstendig barrierefunksjon, noe som resulterer i høyt luminalskjærstress med lav hastighet av transendothelial strømning og interstitiellstrømning 8,9. Ved utbruddet av angiogenese og arteriogenese er en kjennetegnhendelse matrise metalloproteaser (MMPs) mekling av kjellerforringelse, noe som vil øke ECs permeabilitet og remodel matrise, noe som fører til endringer i mekaniske mikromiljøer som blodindusert skjærstress og ekstracellulær matrisestivhet. I det nåværende arbeidet fokuserer vi på initiering av neovaskularisering slik at de mekaniske miljøene i mikrofluidisk spirende chip er designet for å holde seg stabile for å simulere de fysiologiske forholdene. Imidlertid vil endringer av mekaniske mikromiljøer oppstå med ECs spire, akkurat som in vivo. Foruten, i likhet med mangetidligere studier 34,53,56, tar den nåværende modellen kollagenhydrogel som en ekstracellulær matrise. Når vi fokuserer på effekten av strømningsindusert skjærstress, brukes bare en stivhethydrogel. Men med tanke på den viktige effekten av matrisestivhet på celleatferd og neovaskularisering, bør forskjellige stivheter av kollagen studeres og kan oppnås ved å regulere pH av kollagen siden de mekaniske egenskapene til kollagen er avhengig av pH49. Men det er viktig å merke seg at hydrogelen må skylles grundig med PBS for å fjerne restsyrer eller baser før cellesåing for å forhindre skade på cellene. Videre, for å etterligne de komplekse komponentene i ECM in vivo, bør ulike hydrogeler som Matrigel, hyaluronsyre (HA) og fibrinogen etc. brukes i fremtiden for å forbedre dagens modell. Blodtrykksindusert syklisk stamme er en annen viktig heodynamisk kraft som modulerer morfologien og funksjonene til vaskulære celler57. Tidligere studier har vist at strekkbelastning forbedret uttrykk for angiogene faktorer i humanmesenchymalestamceller 58 og indusert angiogenese via nedbrytning av type IV kollagen i vaskulær endotelkjembran59. Disse resultatene indikerte at blodtrykksindusert belastning kan påvirke neovaskularisering også. Den nåværende modellen fokuserer på effekten av strømningsindusert skjærstress, slik at det ikke er aktuelt å innføre belastning, da hydrogelen ikke holder seg tett nok til kanalen og vil falle av når den strekkes. Vi vil ta hensyn til å overvinne denne vanskeligheten i fremtidige verk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (stipend nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 og 32071311), Kinas nasjonale viktige forsknings- og utviklingsprogram (stipendnr. 2016YFC1101101 og 2016YFC1102202), 111 Project (B13003) og Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Bioteknologi utgave 170 neovaskularisering mikrofluidier skjærstress mikromiljø transendothelial strømning 3D-kultur
Mikrofluidisk modell for å etterligne første hendelse av neovaskularisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang,… More

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter