Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrofluidisk modell för att efterlikna inledande händelse av neovaskularisering

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Här tillhandahåller vi ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt kontrollerat, högeffektivt cirkulationsmikrofluidiskt system som rekapitulerar den ursprungliga mikromiljön av neovaskularisering, vilket gör att endotelceller (ECs) kan stimuleras av hög luminal shearstress, fysiologisk nivå av transendotelflöde och olika vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) distribution samtidigt.

Abstract

Neovascularization initieras vanligtvis från en befintlig normal vaskulatur och biomekaniska microenvironment av endotelceller (ECs) i det inledande skedet varierar dramatiskt från följande process av neovascularization. Även om det finns gott om modeller för att simulera olika stadier av neovaskularisering, saknas fortfarande en in vitro 3D-modell som kapitulerar den ursprungliga processen för neovaskularisering under motsvarande stimuleringar av normala vaskulaturmikrovironment. Här rekonstruerade vi en in vitro 3D-modell som efterliknar den första händelsen av neovaskularisering (MIEN). MIEN-modellen innehåller ett mikrofluidiskt spirande chip och ett automatiskt styrsystem med hög effektiv cirkulation. En funktionell, perfusable microchannel belagda med endotel bildades och processen att spira simulerades i mikrofluidic spirande chip. Den ursprungligen fysiologiska mikromiljön av neovascularization recapitulated med det mikrofluidiska kontrollsystemet, genom vilket ECs skulle utsättas för hög luminal shear stress, fysiologiska transendotelial flöde och olika vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) distributioner samtidigt. MIEN-modellen kan enkelt tillämpas på studier av neovaskulariseringsmekanism och har ett potentiellt löfte som en billig plattform för läkemedelsscreening och toxikologiska tillämpningar.

Introduction

Neovascularization händer i många normala och patologiska processer1,2,3,4, som inkluderar två stora processer hos vuxna, angiogenes och arteriogenesis5. Förutom de mest kända tillväxtfaktorerna, såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)6, mekaniska stimuleringar, i synnerhet blodflödet inducerad savspänning, är viktigt vid regleringen av neovaskularisering7. Som vi vet varierar omfattningen och formerna av saxstress dramatiskt och dynamiskt i olika delar av vaskulaturen, vilket resulterar i viktiga effekter påkärlceller 8,9,10,11,12. Tidigare studier har visat att shear stress kan påverka olika aspekter av ECs, inklusive cell fenotypiska förändringar, signaltransduktion, genuttryck, och kommunikationen med muralceller13,14,15,16,17,18,19,20; därför reglera neovaskularisering21,22,23,24.

För att bättre förstå neovaskularisering är det därför viktigt att rekonstruera processen i naturlig cellulär mikromiljö in vitro. Nyligen har många modeller etablerats för att skapa mikrokärl och ge exakt kontroll över mikromiljön25,26,27, och dra nytta av framsteg inom mikrotillverkning och mikrofluidisk teknik. I dessa modeller kan mikrokärl genereras av hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidiska chips30,31,32 eller 3D bioprinting33,34. Vissa aspekter av mikromiljön, såsom luminal shear stress22,23,35,36, transendotelial flöde37,38,39,40, biokemisk gradient av angiogena faktorer41,42, stam / sträcka43,44,45, och samkulturerad med andra typer av celler32,46 har efterliknats och kontrollerats. Vanligtvis användes en stor reservoar eller sprutpump för att ge perfused medium. Transendotelflödet i dessa modeller skapades av tryckfall mellan reservoaren och mikroröret22,23,38,40. Den mekaniska mikromiljön var dock svår att upprätthålla hela tiden på detta sätt. Transendotelflödet skulle öka och sedan överstiga den fysiologiska nivån om ett högt flöde med hög savspänning användes för perfusion. Tidigare studie visade att vid den första perioden av neovaskularisering är hastigheten på transendotelflödet mycket låg på grund av de intakta ECs och källarmembranet, vanligtvis under 0,05 μm/s8. Under tiden, även om luminal shear stress i vaskulär systemet varierar kraftigt, är det relativt högt med medelvärden på 5-20 dyn/cm2,11,47. För närvarande har hastigheten på transendotelflödet i tidigare verk i allmänhet hållits mellan 0,5-15 μm/s22,38,39,40, och luminal shear stress var vanligtvis under 10 dyn / cm223. Det är fortfarande ett svårt ämne att ständigt utsätta ECs för hög luminal shear stress och fysiologisk nivå av transendotelial flöde samtidigt. 

I den aktuella studien beskriver vi en in vitro 3D-modell för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN). Vi utvecklade ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt styrsystem, mycket effektivt cirkulationssystem för att bilda perfusionsmikrorör och simulera processen med att spira48. Med MIEN-modellen rekapituleras först mikromiljön för ECs som stimulerades vid den första perioden av neovaskularisering. ECs kan stimuleras av hög luminal shear stress, fysiologisk nivå av transendotelial flöde och olika VEGF distribution samtidigt. Vi beskriver stegen för att etablera MIEN-modellen i detalj och de viktigaste punkterna som ska uppmärksammas, i hopp om att ge en referens till andra forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Wafer förberedelse

OBS: Detta protokoll är specifikt för SU-8 2075 negativ fotoresist som används under denna forskning.

  1. Rengör silikonskivan 3 till 5 gånger med metanol och isopropanol på en spincoater enligt följande: snurra först i 15 s vid 500 varv/min och snurra sedan i 60 s vid 3 000 varv/min.
  2. Överför kiselskivan till en kokplatta, som är förvärmd till 180 °C och grädda skivan i 10 minuter.
  3. Ta bort kiselskivan från värmeplattan och kyl den till rumstemperatur. Rengör skivan igen med tryckluft innan du fortsätter med spinnbeläggningen. Applicera 4 ml su-8 2075 fotoresist i mitten av skivan.
  4. Få en funktionshöjd på 70 μm på spincoatern enligt följande: snurra först i 12 s vid 500 varv/min och snurra sedan i 50 s vid 2 100 varv/min.
  5. Mjuk grädda skivan på en kokplatta enligt följande: grädda först i 8 min vid 65 °C och grädda sedan i 20 min vid 95 °C. Ta sedan bort kiselskivan från värmeplattan och kyl den till rumstemperatur före litografi.
  6. Placera en fotomask på fotoresistfilmen. Exponera skivan med en litografiutrustning för att uppnå en total exponering på 200 mJ/cm2.
    OBS: Fotomasken innehåller nio uppsättningar mönster av chipet, så att den kan tillverka nio mikrofluidiska spirande chips varje gång.
  7. Post exponera skivan på en kokplatta enligt följande: grädda först i 5 min vid 65 °C och grädda sedan i 20 min vid 95 °C. Ta sedan bort kiselskivan från värmeplattan och kyl den till rumstemperatur innan du utvecklar den.
  8. Överför skivan till en petriskål fylld med SU-8-utvecklare (PGMEA) för att börja utvecklas.
    VARNING: Utvecklaren är irriterande för ögon och andningsorgan. Utför utveckling i en rökhuv. Använd stänkglasögon, nitrilhandskar och flygmask under operationen.
  9. Skaka skålen försiktigt längs flödeskanalens riktning och byt utvecklare efter 10 min.
  10. Upprepa steg 1,9 3-5 gånger tills mönstren tydligt kan observeras.
    OBS: Se till att det inte finns några fotoresistrester kvar på skivan, skölj annars skivan i utvecklaren igen.
  11. Överför skivan till en förvärmd värmeplatta inställd på 120 °C och grädda den i 30 minuter.
  12. Rör 35 μL silan på ett täckglas, lägg sedan täcket tillsammans med skivan i en sugdccator och dra vakuum. Försegla sugapparaten och lämna skivan under vakuum i 4 timmar för att silanisera skivan för att förhindra vidhäftning av PDMS under mjuklitografiprocesserna.
    VARNING: Silanen är giftig. För att förhindra förgiftning, utför silanisering i rökhuven och använd nitrilhandskar under hantering.
  13. Lossa vakuumet från sugdockatorn. Ta bort den silaniserade skivan på en förvärmd värmeplatta och grädda den vid 65 °C i 2 timmar.
  14. Förvara skivan i en ren Petri-skål tills det behövs.

2. Mikrofluidisk spirande chiptillverkning

  1. Kombinera 20 g basmedel och 2 g härdmedel (10:1-förhållande) i en plastbägare och blanda dem noggrant med en blandningsstång.
  2. Placera bägaren i en desiccator och dra vakuum i 1 timme för att ta bort luftbubblor i PDMS-blandningen.
  3. Häll PDMS-blandningen på skivan i Petri-skålen och placera petriskålen tillbaka i oredan och avgasa i ytterligare 30 minuter.
    OBS: Det är bra att använda dubbelsidig tejp för att limma skivan på botten av Petri-skålen för att säkerställa att skivan hålls horisontell under avgasning och härdning.
  4. Ta bort Petri-skålen från utsnubstansen och placera den i en torr ugn på 80 °C i 3 timmar för att härda.
  5. Separera försiktigt PDMS-skiktet från skivan och skär skiktet till nio chips med en skalpell enligt mönstret.
    OBS: Håll funktionssidan uppe efter separationen.
  6. Stansa ut två hydrogelinjektionsportar och fyra mediainsprutningsportar ur varje chip med en 1 mm respektive en 3,5 mm biopsislag.
  7. Rengör de stansade spånorna med restfri tejp för att avlägsna PDMS-rester. Placera chipsen och nio glaslock i en plasmarengöringsmedel och behandla dem med syreplasma i 30 s för att bilda kovamerande bindning på ytan.
  8. Ta ut chipsen och täckena. Fäst spånornas funktionssida på täckena.
  9. Placera de bifogade spånorna i en torr ugn på 80 °C i 1 timme för att intensifiera bindningen.
  10. Spara chipsen automatiskt före användning och håll dem sterila under resten av proceduren.

3. Ytmodifiering och hydrogelinsprutning

  1. För varje spån, rör 40 μL 1 mg/ml poly-D-lysin (PDL) och injicera det i kanaler i chipet från hydrogelinsprutningsporten.
    OBS: Se till att PDL fyller kanaler, särskilt i smala kanaler nära portarna.
  2. Inkubera spånorna vid 37 °C i 4 timmar för att ändra PDMS yta .
  3. Rör 200 μL sterilt vatten och injicera det i kanaler i chipet från hydrogelinsprutningsporten för att tvätta bort PDL.
  4. Ta bort spånorna i en torr ugn på 120 °C i 3 timmar för att återställa hydrofobin.
  5. Placera på is ett sterilt rör och beräkna volymen av typ I-kollagen som ska användas som följande ekvation.
    Slutlig volym (50 μL) x Slutlig kollagenkoncentration (3 mg/ml i denna forskning) / Koncentration i flaska = volymkolagen som ska tillsättas
  6. Beräkna volymen av NaOH som ska användas som följande ekvation.
    (volymkollage som ska tillsättas) x 0,023 = volym 1 N NaOH
  7. Förbered 50 μL hydrogel i röret som följande protokoll: tillsätt 5 μL 10x PBS, 0,5 μL fenolrött, beräknad volym på 1 N NaOH, 4 μL 1 mg/ml Fibronectin, beräknad volym av typ I-kollagen i tur och ordning. Tillsätt rätt mängd dH2O så att den totala volymen når 50 μL. Blanda allt innehåll i röret noggrant.
    OBS: Utför alla operationer på is. Använd fenolrött som en syrabaserad indikator för att hjälpa till vid visuell bestämning av hydrogelens pH. Den slutliga hydrogelen slutar orange när pH är ca 7,4 och styvheten är ca 15 kPa49.
  8. Rör 2-3 μL hydrogel för varje spån och injicera det långsamt i den centrala hydrogelkanalen från hydrogelinsprutningsporten.
  9. Inkubera spånorna vid 37 °C i 30 minuter för att möjliggöra gelering.
    OBS: Försegla spånorna i en förseglad låda med 1 ml sterilt vatten om de inte används omedelbart. Förseglade spån kan förvaras vid 37 °C i högst 24 timmar.

4. Cell sådd

  1. Rör 20 μL på 125 μg/mL Fibronectin i en medieinsprutningsport i cellkulturkanalen.
  2. Klipp en pipettspets för att passa cellkulturkanalens port med sax.
  3. Sätt in pipettspetsen i cellkulturkanalens andra mediainjektionsport. Rör sedan ut luft från cellkulturkanalen för att fylla den med Fibronectin.
  4. Inkubera spånorna vid 37 °C i 1 timme.
  5. Före cellsådd, rör 20 μL ECM-media i varje mediainjektionsport och inkubera spånorna vid 37 °C i 30 min.
  6. Rör sedan ut alla media i alla mediainjektionsportar.
  7. Därefter rör 5 μL cellupphängning i en mediainjektionsport i cellkulturkanalen. Sedan spred sig endotelceller snabbt över hela kanalen under differentiellt hydrostatiskt tryck.
    OBS: Förbered cellfjädringen genom att prova på att prova mänskliga navelsträngsceller (HUVECs) från odlingskolven och centrifugera dem vid 400 x g. Återanvänd sedan cellerna till 107 celler/ml i ett rör.
  8. Tillsätt ca 4-6 μL ECM-media till den andra porten för att justera det hydrostatiska trycket och stoppa cellens rörelse.
  9. Ta bort chipsen till cellinkubatorn. Vänd sedan spånorna var 30:e minut tills endotelcellerna täcker runt cellkulturkanalens inre yta 2 timmar senare (bild 1).
    OBS: För att göra chipet upp och ner, rör lite vatten på baksidan av täckglaset. Då kan chippet fästas på petriskålens lock.
  10. Använd pipettspetsen för att avlägsna de bifogade cellerna i injektionsportarna mycket noggrant.
  11. Sätt sedan in fyra taggiga kvinnliga Luer-adaptrar i mediainjektionsportarna och fyll med ECM-media.
    OBS: Adaptrar kan fungera som vätskebehållare för att ge näringsämnen till cellerna i kanalen.
  12. Ta bort chipsen till cellinkubatorn. Byt ECM-media i Luer-adaptrar var 12:e timme.

5. Mätning av FITC-dextran diffusionell permeabilitet

OBS: För att bedöma mikrokärlets barriärfunktion bedöms eg-odlingskanalens diffusa permeabilitet med eller utan cellfoder.

  1. Ta ut ett mikrofluidiskt spirande chip med hydrogel injicerat.
  2. Upprepa steg 4.1-4.6.
  3. Ta bort alla Luer-adaptrar och pipet ut alla media i fyra mediainjektionsportar.
  4. Placera chippet på det konfokala laserskanningsmikroskopet.
  5. Rör 5 μL odlingsmedier som innehåller 500 μg/ml 40 kDa FITC-dextran till en cellkulturkanal.
    OBS: 40 kDa FITC-dextran har liknande molekylär storlek som VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Ta bilder var tredje s för 30 s. Således mäts den diffusionella permeabiliteten utan cellfoder.
  7. Ta ut det mikrofluidiska groddchipet efter att HUVECs har konfluent i cellkulturkanalen.
  8. Upprepa steg 5.3-5.5.
  9. Ta bilder var tredje s för 30 s. Således mäts den diffusionella permeabiliteten med cellfoder.
  10. Beräkna den diffusionella permeabiliteten genom att kvantifiera förändringar av fluorescerande intensitet över tid med hjälp av följande modifierade ekvation50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    Där Pd är den diffusionella permeabilitetskoefficienten är I 1 den genomsnittliga intensiteten vid en inledande tidpunkt, I2 är medelintensiteten efter deltatiden (Δt), Ib är bakgrundsintensiteten, S är kanalens område i fluorescensbilder, och d är det totala intervallet av mikroinlägg i fluorescensbilder. I det nuvarande verket är Δt inställd som 9 s.
    OBS: Den nuvarande ekvationen skiljer sig något från deursprungliga 50, på grund av diffusionsriktningen för fluorescensen i chipet är endast från EG-kanalen till hydrogelkanalen, vilket inte är som det cirkulära röret som sprider sig i all radiell riktning.

6. Inställningar för mikrofluidiska styrsystem

OBS: Det mikrofluidiska styrsystemet i denna studie består av en mikrosprutapump, en elektromagnetisk klämventil, ett bubbelfällechips, ett mikrofluidiskt chip, en mikroperistaltisk pump och en reservoar. Varje del av systemet kan ersättas av alternativ som kan utföra samma funktion.

  1. Bubbelfälla chip tillverkning
    OBS: Bubbelfällschipet används för att avlägsna luftbubblor i omlopp. Chippet består av tre PDMS-lager. Det övre lagret är konstruerat med mjuk litografi för att bilda gallerstruktur som vätskekammare. Varje kanal i rutnätsstrukturen är 100 μm bred. Det nedre lagret är en PDMS-bit med ett hål. Mellan de två lagren läggs en 100 μm tunn PDMS-film.
    1. Upprepa steg 1 för att förbereda skivan för bubbelfällschips.
    2. Upprepa steg 2.1-2.5 för att tillverka det övre lagret och bottenskiktet i bubbelfällans chip.
      OBS: Fotomasken i det övre lagret innehåller tre uppsättningar mönster, så klipp PDMS-lagret till tre chips enligt mönstret.
    3. Stansa sex hål i slutet av inlopps- och utloppskanalerna på det övre lagret med en 3,5 mm biopsi stans.
    4. Stansa två hål på motsvarande position för bottenskiktet med en 6 mm biopsi stans enligt mönstret på det övre lagret.
    5. Upprepa steg 2.1-2.2 för att förbereda 10 g PDMS-blandning och häll den på mitten av en rengjord kiselskiva.
    6. Tillverka en PDMS-film på 100 μm genom att tillämpa följande spinnprotokoll: snurra i 15 s vid 500 varv/min, öka spinnhastigheten till 1 300 varv/min och håll här i 45 s.
    7. Överför skivan till en förvärmd värmeplatta inställd på 180 °C och grädda den i 30 minuter.
    8. Rengör de stansade lagren med restfri tejp för att avlägsna PDMS-rester. Placera de översta lagren och wafer i en plasmarengöringsmedel och behandla dem med syreplasma i 30 s för att bilda kovamerande bindning på ytan.
    9. Ta ut de översta lagren och skivan. Fäst funktionssidan av de översta lagren på PDMS-filmen.
    10. Skär filmen försiktigt längs kanten av de övre lagren med en nål.
    11. Separera långsamt filmen från skivan och vänd på chipsen för att göra filmsidan uppåt efter separationen.
    12. Placera de nedre lagren och fäst chipsen i en plasmarengöringsmedel och behandla dem med syreplasma i 30 s igen.
    13. Ta ut de nedre lagren och de bifogade chipsen. Fäst de nedre lagren på PDMS-filmen och bubbelfällorna är klara.
      OBS: Justera hålen på det nedre lagret med mönstren på det övre lagret vid fastsättning.
    14. Placera spånorna i en torr ugn på 80 °C i 1 timme för att intensifiera bindningen.
  2. Montera det mikrofluidiska styrsystemet
    OBS: Alla delar av systemet, såsom bubbelfällschip, reservoar, rör och kontakter används efter autoklavsterilisering, utom elektronisk utrustning. Montera det mikrofluidiska styrsystemet på en ren bänk.
    1. För att montera det mikrofluidiska styrsystemet, förbered två polytetrafluoretylenrör, två korta silikonrör, tre långa silikonrör, en taggig kvinnlig Luer-adapter, en Y-typkontakt och tre L-typkontakter.
      OBS: Fördelen med polytetrafluoretylenrör är låg elasticitet, därför behövs mindre media i pipeline. Silikonrör har däremot hög elasticitet, därför är det lämpligt för klämventilen och peristaltic pumpen.
    2. Fyll sprutan med 10 ml förvärmt (37 °C) ECM-medium.
      OBS: Förvärmning hjälper mediet att frigöra upplöst gas.
    3. Anslut ett polytetrafluoretylenrör till sprutan med en taggig honadapter. Anslut sedan den andra änden av polytetrafluoretylenröret till en Y-typkontakt.
    4. Anslut sedan två långa silikonrör till de andra två ändarna av Y-typkontakten med ett rör som ansluter till behållaren och det andra röret som ansluter till bubbelfällans chip.
    5. Anslut ett annat långt silikonrör till behållaren.
    6. Använd sedan två korta silikonrör för att ansluta alla inlopps- och utloppshål på det övre lagret av bubbelfällschipet. Anslut ett polytetrafluoretylenrör till spånets backend.
    7. Fäst sedan sprutan på mikrosprutans pump.
    8. Kläm in två långa silikonrör i den elektromagnetiska klämventilen.
    9. Byt sedan den elektromagnetiska klämventilen för att öppna rörledningen mellan sprutan och behållaren. Injicera mediet i behållaren med hjälp av en mikrosprutapump till frånluft i röret.
    10. Byt sedan ventil igen för att öppna rörledningen mellan sprutan och bubbelfällschipet. Injicera mediet för att fylla vätskekammaren och backend-röret på bubbelfällschipet.

7. Endotel spirande analys

OBS: En inkubator monterad med faskontrastmikroskop används i denna studie för att observera groddprocessen i realtid. Scenens övre inkubator kan bibehålla temperatur-, fuktighets- och CO2-kontrollen på mikroskopsteg, vilket är bra för levande cellavbildning. Men utrustningen är inte nödvändig för analysen. Protokollen som tillhandahålls här kan också bearbetas i en grundläggande cellinkubator.

  1. Ta ut endotelgroddschips från cellinkubatorn.
  2. Ta sedan bort Luer-adaptrar på cellkultursidan. Sätt in två rörpluggar i hydrogelinsprutningsportarna på det mikrofluidiska spirande chipet.
    OBS: Pluggarna kan omvandlas från nålar och deras huvudfunktion är att förhindra att media spiller.
  3. Anslut backend-röret med bubbelfällschip till en port av cellkulturkanal.
    OBS: Se till att det inte finns några bubblor i röret före anslutning.
  4. Sätt i en T-typkontakt till den andra porten och anslut den till långt silikonrör som är anslutet till behållaren.
  5. Fäst det långa silikonröret i den mikroperistaltiska pumpen.
  6. Sätt sedan in ett luftfilter i behållaren.
  7. Montera sedan det mikrofluidiska spirande chipet på scenens inkubator.
  8. Anslut sedan vakuumpumpen till hålen i det nedre lagret av bubbelfällschip med ett TPU-rör.
  9. Ställ in cirkulationsvolymen och flödeshastigheten i det anpassade programmet, som styr mikrosprutans pump och elektromagnetiska klämventil samtidigt (figur 2).
    OBS: Flödeshastigheten över den endotelcellskulturkanalen beräknas enligt den klassiska ekvationen.
    τ = 6μQ / Wh2
    där det är saxspänning (dyn/cm2),μ är livsmediets viskositet (8,8 x 10-4 Pa•s), Q är flödeshastigheten över den endotelcellskulturkanalen (ml/s), h är kanalhöjd (70 μm) och W är kanalbredd (1 000 μm). Mediets viskositet mäts med hjälp av en koaxialcylindertyp rotationsviskoräknare. Kanalens höjd och bredd är förutbestämda och bekräftar manuellt med hjälp av ett faskontrastmikroskop vid 4x förstoring. Cirkulationsvolymen är 5 ml och flödeshastigheten är 85 μL/min (i genomsnitt 0,2 m/s i cellkulturkanalen) för 15 dyn/cm2 skjuvspänning enligt beräkning.
  10. Ställ sedan in flödeshastigheten för mikroperistaltisk pump.
    OBS: Flödeshastigheten för mikroperistaltisk pump är något högre än mikrosprutans pump, för att förhindra att media spiller.
  11. Slå på mikrosprutapumpen. Därefter upprättas cirkulationskontrollsystemet.

8. Dataanalys

OBS: För att kvantifiera groddarna beräknades det normaliserade groningsområdet, den genomsnittliga groddlängden och den längsta groddlängden. Resultaten representerar genomsnittlig ± SEM erhållit från tre oberoende studier. Statistisk signifikans (P < 0,05) bedöms av Studentenst-test.

  1. Fixera celler och groddar i det mikrofluidiska groddarchipet efter experiment med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Fläckkärnor med 4′,6-diamidino-2-fenylindoledikydroklorid (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) i 10 min och sedan fläck cytoskeleton med TRITC falloidin (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) för 1 h. Tvätta celler med PBS tre gånger med 5 minuters mellanrum mellan varje steg.
  2. Ta konfokala bilder av chipsen i ett plattsättningsläge och sy dem med hjälp av bildredigeringsprogram.
  3. Räkna antalet fluorescerande pixlar av Z-projektionsbilder med hjälp av en anpassad kod i programmeringsprogram för att kvantifiera normaliserat groningsområde (Se kompletterande fil).
  4. Identifiera och märk manuellt varje spets av groddar i Z-projektionsbilder och beräkna avstånd mellan groddar tips till ECs källarmembran med hjälp av en annan anpassad kod för att kvantifiera genomsnittlig groddlängd och längsta groddlängd(Se kompletterande fil ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro 3D-modellen för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN) som presenteras här bestod av ett mikrofluidiskt spirande chip och ett mikrofluidiskt kontrollsystem. Det mikrofluidiska groddarchipet optimerades från tidigare publikationer22,23,37,40,51,52,53. Kortfattat innehöll den tre kanaler och sex portar: en endotelcellskulturkanal och en flytande kanal med fyra mediainsprutningsportar och en central hydrogelkanal med två hydrogelinjektionsportar (figur 3). Det mikrofluidiska styrsystemet bestod av en mikrosprutapump, en elektromagnetisk klämventil, ett bubbelfällechips, en mikroperistaltisk pump och en odlingsmediebehållare (figur 4). Ett anpassat program användes för att styra mikrosprutans pump och elektromagnetiska klämventil samtidigt, med vilken flödeshastigheten och cirkulationsvolymen kan ställas in. En kompensationsvolym infördes för att korrigera den lilla volymförändringen efter flera cykler på grund av systemfel. För att minimera mediet som används för perfusion introducerades en elektromagnetisk nypventil för medium återvinning. Den elektromagnetiska klämventilen kan växla mellan två tillstånd för att göra det mikrofluidiska systemet i två faser i en cykel. I injektionsfasen injicerades odlingsmediet långsamt från mikrosprutapumpen till det mikrofluidiska groddarchipet. I återvinningsfasen extraherades odlingsmediet mycket snabbt från behållaren tillbaka till mikrosprutans pump.

Barriärfunktionen hos mikrokärlet i vår MIEN-modell bedömdes genom att mäta den diffusionella permeabilitetskoefficienten(Pd)på 40 kDa FITC-dextran. Som det visas i figur 5är P dstatiskt odlat chip med cellfoder 0,1 ± 0,3 μm/s och P dav tom kanal utan cellfoder är 5,4 ± 0,7 μm/s. Sedan utfördes endotel spirande analys under statisk och perfusion i MIEN-modellen. Under statiska förhållanden inträffade endotel grodd ca 4 h efter sådd och groddarna skulle migrera över den centrala hydrogelkanalen till andra sidan i ca 48 h. Groddarna försämrades gradvis efter 48 timmar. Efter 24 timmar exponering för 5 eller 15 färgämne/cm2 saxspänning (i genomsnitt 0,07 eller 0,2 m/s i cellkulturkanalen), anpassade ECs i flödesriktningen från polygonal, kullerstensform till fusiform, och graden av spirande minskade med ökningen av saxspänning(figur 6). Groddarna under savförhållanden var dock stabilare än under statiska odlingsförhållanden. De kan hålla över 48 h under perfusion. Kvantitativ statistik visade att endotelgroddsgrodd minskade betydligt när det gäller groningsareal, genomsnittlig groddlängd och längst groddarlängd (figur 7).

Figure 1
Figur 1:Endotelceller täcker runt cellkulturkanalens inre yta. HUVECs är jämnt spridda i cellkulturen kanal 2 h efter cell sådd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Det anpassade program som används för att styra mikrosprutans pump och elektromagnetiska klämventil samtidigt. Huvudsida (upp) och undersida (nedåt) för det anpassade program med vilket flödeshastigheten och cirkulationsvolymen kan ställas in. En kompensationsvolym infördes för att korrigera den lilla volymförändringen efter flera cykler på grund av systemfel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Schemat för det mikrofluidiska groddarchipet. Chippet innehåller tre kanaler och sex portar: en endotelcellskulturkanal och en flytande kanal med fyra mediainsprutningsportar och en central hydrogelkanal med två hydrogelinjektionsportar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Schemat för det mikrofluidiska styrsystemet. Det mikrofluidiska styrsystemet består av en mikrosprutapump, en elektromagnetisk klämventil, ett bubbelfällechip, en mikroperistaltisk pump och en odlingsmediebehållare. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5:Diffusionell permeabilitet(Pd)på 40 kDa FITC-dextran. Pd statiskt odlat chip med cellfoder är 0,1 ± 0,3 μm/s och Pd av tom kanal utan cellfoder är 5,4 ± 0,7 μm/s. **, s < 0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativa bilder av endotelgrodd under olika savförhållanden. Efter 24 h statisk odling invaderar HUVECs från cellkulturkanalen in i den intilliggande hydrogelkanalen genom mikrostolpar och ett stort antal groddar i hydrogelen. Medan efter 24 h exponering för 5 eller 15 dyn / cm2 savspänning, minskar graden av spirande uppenbarligen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7:Kvantifierat groningsområde, genomsnittlig groddlängd och längst groddlängd. Efter 24 timmar statisk kultur (S0) eller exponering för 5 (S5) eller 15 (S15) dyn/cm2 savspänning minskar graden av spirande med ökningen av savspänning. *, p < 0,05; **, p < 0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under lång tid har realtidsobservation av neovaskularisering varit ett problem. Flera metoder har utvecklats nyligen för att skapa perfused fartyg foder med ECs och intill extracellulär matris för spirande22,32,40,46,54, men den mekaniska mikromiljön är fortfarande svårt att upprätthålla ständigt. Det är fortfarande ett svårt ämne att efterlikna den ursprungliga biomekaniska mikromiljön av ECs, som utsätts för hög luminal shear stress och låg hastighet av transendotelial flöde. Här presenterade vi en MIEN-modell som först simulerar den första händelsen av neovaskularisering i mimic fysiologisk mikromiljö. Med MIEN-modellen uppnås automatisk, effektiv och bubbelfri långsiktig perfusion. Luminal shear stress på ECs kan eventuellt ändras när som helst under experiment med transendotelial flöde stannar på fysiologisk nivå.

Nyckeln till MIEN-modellen är att frikoppla effekten av luminalt flöde på ECs från transendotelialflödet. För detta ändamål sätts en T-typkontakt kreativt in i utloppsporten på EG-kulturkanalen. Ena änden av kontakten ansluts till behållaren via den mikroperistaltiska pumpen. Den andra änden av kontakten utsätts för inkubatorns luft. Det håller trycket inne i den endotelcellskulturkanal som atmosfärstrycket, eftersom det varken finns överskott av media för att öka trycket eller överskottsmedia som dras bort för att bilda negativt tryck i kanalen. På detta sätt är flödesresistensen efter mikrofluidisk spirande chip mycket liten så att transendotelflödet kan bibehållas på fysiologiskt intervall även under hög luminal shearstress.

Ett kritiskt steg inom protokollet är den framgångsrika injektionen av hydrogel i centrala hydrogelkanalen. Huang et al. föreslog att framgångsrik fyllning av gelerna beror på balansering av kapillärkrafterna och ytspänningen inom den mikrofluidiska gelkanalen55. De hittade tre olika variabler för att kontrollera balansen: avståndet mellan mikrostolpar, enhetens ytegenskaper och hydrogelprekursorlösningarna viskositet. I den nuvarande modellen optimeras designen av det mikrofluidiska groddarchipet från tidigare verk22,23,37,40,51,52,53. Geometrin och avståndet mellan mikrostolpar och separata tre kanaler bestäms baserat på tidigare beräkningar och många experiment. Vidare utförs PDL-beläggning och högtemperaturbakning för att modifiera PDMS-ytan; justera därför balansen mellan hydrofilicitet och hydrofobi före hydrogelinjektion.

Det andra kritiska steget i protokollet är borttagning av bubblor. En stor mängd luft löses upp i cirkulationsmedium under experimentet på grund av T-typkontakten och mikroperistaltisk pump, vilket resulterar i bubblor i cirkulation och i hög grad påverkar funktionen hos endotelceller. För att ta bort bubblor introduceras ett bubbelfällchip före mikrofluidiskt spirande chip. Det fungerar baserat på PDMS-membranets höga gaspermeabilitet. När bubblor kommer in i fällan sprids de av den lilla och täta nätstrukturen och fångas på grund av det negativa trycket som genereras av vakuumpumpen så att de inte lyckas gå framåt i det mikrofluidiska spirande chipet. Vidare transporterar bubblorna genom PDMS-membranet in i det undertryckshål som är anslutet till vakuumpumpen och försvinner så småningom. Trots detta bör stor uppmärksamhet ägnas åt bildandet av bubblor under experimentet. Så snart bubblor hittas före mikrofluidiskt spirande chip i rörledningen, stoppa mikrosprutan omedelbart. Ryck försiktigt rörledningen med fingret för att låta bubblorna röra sig till bubbelfällschip och avlägsnas.

Även om den första mikromiljön av neovascularization är delvis recapitulated, det finns vissa begränsningar för denna MIEN modell. De mekaniska mikromiljöerna i endotelceller som blodinducerad savspänning och extracellulär matrisstelhet förändras under neovaskulariseringsprocesserna. Före neovascularization är det endotelial källare membranet fortfarande intakt med fullständig barriär funktion, vilket resulterar i hög luminal skjuvning stress med låg hastighet av transendotelial flöde och interstitiell flöde8,9. Vid uppkomsten av angiogenes och arteriogenesis är en kännetecken händelse matris metalloproteaser (MMPs) medling av källaren nedbrytning, vilket kommer att öka ECs permeabilitet och remodel matris, vilket leder till förändringar i mekaniska mikromiljöer såsom blod inducerad shear stress och extracellulär matris styvhet. I det nuvarande arbetet fokuserar vi på initiering av neovaskularisering så att de mekaniska miljöerna i det mikrofluidiska groddarchipet är utformade för att hålla sig stabila för att simulera de fysiologiska förhållandena. Förändringar av mekaniska mikromiljöförändringar kommer dock att ske med ECs spirande, precis som in vivo. Dessutom, liknar många tidigare studier34,53,56, tar den nuvarande modellen kollagenhydrgel som en extracellulär matris. När vi fokuserar på effekten av flödesinducerad savspänning används endast en styvhetshydel. Men med tanke på den viktiga effekten av matrisstelhet på cellbeteende och neovaskularisering bör olika styvheter av kollagen studeras och kan uppnås genom att reglera pH av kollagen eftersom kollagenets mekaniska egenskaper är beroende av dess pH49. Men det är viktigt att notera att hydrogelen måste sköljas noggrant med PBS för att avlägsna restsyror eller baser före cellfröning för att förhindra skador på cellerna. Vidare, för att efterlikna de komplexa komponenterna i ECM in vivo, bör olika hydrogeler som Matrigel, hyaluronsyra (HA) och fibrinogen etc. användas i framtiden för att förbättra den nuvarande modellen. Blodtryck inducerad cyklisk stam är en annan viktig hemodynamisk kraft som modulerar morfologin och funktionerna i kärlceller57. Tidigare studier har visat att dragkraft stam förstärkt uttryck av angiogenic faktorer i mänskliga mesenchymal stamceller58 och inducerad angiogenes via nedbrytning av typ IV kollagen i vaskulär endotel källarmembran59. Dessa resultat visade att blodtryck inducerad stam kan påverka neovascularization också. Den nuvarande modellen fokuserar på effekten av flödesinducerad savspänning så det är inte tillämpligt att införa belastning eftersom hydrogelen inte håller tillräckligt hårt på kanalen och kommer att falla av när den sträcks ut. Vi kommer att vara uppmärksamma på att övervinna denna svårighet i framtida arbeten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (bidrag nr 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 och 32071311), Kinas nationella centrala forsknings- och utvecklingsprogram (bidrag nr 2016YFC1101101 och 2016YFC1102202), 111-projektet (B13003) och Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Bioengineering Nummer 170 neovaskularisering mikrofluidik savspänning mikromiljö transendotelflöde 3D-kultur
Mikrofluidisk modell för att efterlikna inledande händelse av neovaskularisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang,… More

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter