Summary
שינויים פתופיזיולוגיים במערכת העצבים האוטונומית הלבבית, במיוחד בענף הסימפטי שלה, תורמים לתחזוקה ולתחזוקה של הפרעות קצב חדריות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד לאפיין גרעינים כוכביים מורין כדי לשפר את ההבנה של התהליכים המולקולריים והתאים הבסיסיים.
Abstract
מערכת העצבים האוטונומית היא מניע משמעותי של אלקטרופיזיולוגיה לבבית. במיוחד תפקידו של הענף האוהד שלה הוא עניין מתמשך של חקירה בפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב חדריות (VA). נוירונים בגרעינים הכוכביים (SG) – מבנים דו-צדדיים בצורת כוכב של השרשרת הסימפתטית – הם מרכיב חשוב בתשתית הסימפתטית. SG הם יעד מוכר לטיפול באמצעות denervation לב אוהד בחולים עם VA עקשן טיפול. בעוד שיפוץ עצבי והפעלה גליה ב SG תוארו בחולים עם VA, התהליכים התאיים והמולקולריים הבסיסיים שעלולים להקדים את תחילת הפרעות קצב אינם מובנים מספיק ויש לברוח כדי לשפר את אפנון האוטונומי. מודלים של עכבר מאפשרים לנו לחקור שיפוץ עצבי אוהד, אבל זיהוי של SG מורין מאתגר עבור החוקר חסר הניסיון. לכן, מחקרים ביולוגיים תאיים ומולקולריים מעמיקים של ס"ג מורין חסרים למחלות לב נפוצות רבות. כאן, אנו מתארים רפרטואר בסיסי לניתוח ולמידה של ה- SG בעכברים בוגרים עבור ניתוחים ברמת ה- RNA (בידוד RNA עבור ניתוחי ביטוי גנים, בהכלאה במקום), רמת חלבון (כתמי הר שלם אימונופלואורסצנטיים) ורמת התא (מורפולוגיה בסיסית, מדידת גודל תאים). אנו מציגים פתרונות פוטנציאליים להתגבר על אתגרים בטכניקת ההכנה, וכיצד לשפר את הכתמים באמצעות מרווה של autofluorescence. זה מאפשר הדמיה של נוירונים, כמו גם תאי גליה באמצעות סמנים הוקמה על מנת לקבוע את הרכב התא ותהליכי שיפוץ. השיטות המוצגות כאן מאפשרות לאפיין את ה- SG כדי לקבל מידע נוסף על תפקוד אוטונומי בעכברים הנוטים ל- VA וניתן להשלים טכניקות נוספות החוקרות רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים האוטונומית בלב.
Introduction
מערכת העצבים האוטונומית הלבית היא שיווי משקל מוסדר היטב של רכיבים סימפטיים, פרזימפתטיים וסנסיריים המאפשרים ללב להסתגל לשינויים סביבתיים עם התגובה הפיזיולוגית המתאימה1,2. הפרעות בשיווי משקל זה, למשל, עלייה בפעילות אוהדת, הוקמו כנהג מפתח לתערוכה, כמו גם תחזוקה של הפרעות קצב חדריות (VA)3,4. לכן, אפנון אוטונומי, שהושג באמצעות הפחתה פרמקולוגית של פעילות אוהדת עם חוסמי בטא, היה אבן פינה בטיפול בחולים עם VA במשךעשרות שנים 5,6. אבל למרות התערבויות פרמקולוגיות וצנתר מבוסס, מספר רלוונטי של חולים עדיין סובל VA7חוזר .
קלט סימפטי ללב מתווך בעיקר באמצעות גופי תאים עצביים בגרעיני הכוכבים (SG), מבנים בצורת כוכב דו-צדדי של השרשרת הסימפתטית, המעבירים מידע באמצעות עצבים תוך-אתאורקטיים רבים מגזע המוח ללב8,9,10. עצב נבט מן SG לאחר פציעה קשורה VA ומוות לבבי פתאומי11,12, המדגיש את SG כיעד אפנון אוטונומי13,14. הפחתת קלט אוהד ללב ניתן להשיג באופן זמני באמצעות הזרקה עורית של הרדמה מקומית או לצמיתות על ידי הסרה חלקית של SG באמצעות בית החזה בסיוע וידאו15,16. denervation אוהד לב מציג אפשרות עבור חולים עם VA עקשן טיפול עם תוצאות מבטיחות14,16,17. למדנו מ SG המוסבר של חולים אלה כי שיפוץ עצבי ונוירוכימי, נוירו-דלקת והפעלה גליאלית הם סימני היכר של שיפוץ אוהד שעלול לתרום או להחמיר תפקוד אוטונומי18,19. ובכל זאת, התהליכים התאיים והמולקולריים הבסיסיים בתאי העצב האלה נשארים מעורפלים עד כה, למשל, תפקיד הטרנס-דיפרנטיציה העצבית לפנוטיפ כולינרגי20,21. מחקרים ניסיוניים מציגים גישות חדשניות לטיפול VA, למשל, הפחתת פעילות עצבית אוהדת באמצעות אופטוגנטיקה22, אבל אפיון מעמיק של SG עדיין חסר פתולוגיות לב רבות ללכת ביד עם VA. מודלים עכבר לחקות פתולוגיות אלה לאפשר ללמוד שיפוץ עצבי כי פוטנציאל לפני תחילת הפרעות קצב12,23. אלה יכולים להסתיים על ידי ניתוחים מורפולוגיים ותפקודיים נוספים לאפיון אוטונומי של הלב ומערכת העצבים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מספקים רפרטואר בסיסי של שיטות המאפשר לנתח ולאפיין את SG מורין כדי לשפר את ההבנה של VA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש במדינת המבורג (ORG870, 959) והסוכנות הממלכתית נורדריין-ווסטפליאן לטבע, סביבה והגנת הצרכן (LANUV, 07/11) ומתאימים למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011). מחקרים בוצעו באמצעות גברים ונשים (בגילאי 10-24 שבועות) עכברי C57BL/6 (מספר מלאי 000664, מעבדות ג'קסון) ועכברים הומוזיגוס (db/db) או הטרוזיגוס (db/het; שליטה) עבור המוטציה הספונטנית של הסוכרת (Leprdb; בי.סי.אקס. Cg-Dock7m +/+ Leprdb /J, מספר מלאי 000642, מעבדות ג'קסון). המחברים השתמשו בפרוטוקולים בהישג יד ללא וריאציות לעכברים בגילאי עד 60 שבועות.
1. מיקום וריצוי של גרעיני כוכבית מורין
הערה: למרות תיאורים וציורים זמינים בעיקר במינים גדולים יותר, כמה פרסומים תיארו בעבר את המיקום של SG בחולדות24 ועכברים25 באמצעות שיטות אנטומיות וקווי כתב פלואורסצנטיים, בהתאמה.
- הכן 50 מ"ל של קרח קר (3-4 °C) הפרין (20 יחידות / מ"ל, ראה טבלה של חומרים) תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). בצעו ניתוח של ה- SG בטמפרטורת החדר (RT).
- עכבר מרדים עמוק על ידי שאיפה של 3%-5% איזופלוראן על פי ההנחיות המוסדיות והמקומיות. לאמת הרדמה נאותה על ידי אובדן רפלקס גמילה דוושה. לערוף את ראשם של עכברים או לבצע פריקת צוואר הרחם.
הערה: נקע צוואר הרחם שגוי יכול לגרום לשבירה של עמוד השדרה ונזק של כלי בית החזה המובילים לדימום אשר מעכב את ההכנה או ניתוק של שרשרת הסימפתטית, כך SG אינם במצב הנכון שלהם. לכן, זה קריטי יש כוח אדם מנוסה לבצע נקע צוואר הרחם או לערוף בעלי חיים בנשימה עמוקה. - לרסס את העור עם אתנול ולפתוח את בית החזה עם שני חתכים לאורך הקווים הציריים הזרועים באמצעות מספריים מאיו ומלקחיים דפוס צר. חותכים את הסרעפת ומסירים את החלק הקדמי של בית החזה.
- הסר את חבילת הלב-ריאה על ידי אחיזת אבי העורקים ואת הוועד ממש מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים בלונדון חיתוך כל כלי ורקמות חיבור קרוב לעמוד השדרה למטה עם מספריים פזילה.
- לשטוף את בית החזה ביסודיות עם PBS הפריניזציה באמצעות פיפטה חד פעמית פלסטיק עד כל עקבות הדם מוסרים.
- מניחים את פלג הגוף התחתון תחת משקפת להכנת סטריאומיקוסקופ ומבטיחים תאורה טובה בבית החזה עם מקורות אור חיצוניים.
- אתר את הצלע הראשונה ואת שרירי הקולי הארוכים.
הערה: ה- SG ממוקמים דו-צדדית, במקביל לעמוד השדרה בענף שבין הצלע הראשונה לעמוד השדרה, בחריץ לרוחב לשרירי הקולי הארוכים24. הצד השטוח של ה- SG ממוקם בסמוך לשרירי הקולי הארוכים. בהתאם להכנה, חלקים של שרשרת הסימפתטית עשויים כבר להיות גלויים כמו סיבים לבנים, עקיפים במקביל לעמוד השדרה. אלה יכולים להיות נעוצים יחד לס"ג. - השתמש בעדינות בקצה המלקחיים של דומונט #5/45 כדי לחשוף את רקמת החיבור לרוחב לשריר הקולי הארוך.
- סובבו את המלקחיים ב-180° והשתמשו בצד השטוח כדי לאחוז בס"ג ולמשוך אותו החוצה בלחץ מינימלי.
- חזור על הפעולה עם ס"ג השני.
- מניחים את שני SG בצלחת (קוטר 6 ס"מ) מלא PBS קר ולבדוק עם ההגדלה המתאימה. במידת הצורך, להסיר כלי עודף, רקמת שומן, ועצבים גדולים יותר.
הערה: גרעינים אוטונומיים מוקפים כמוסת רקמת חיבור המורכב סיבי קולגן פיברובלסטים26,27. החן חמיץ של כמוסות אלה נראה להשתנות בין מינים, סוג אחר שלגרעינים 26 וגיל28. הסר כמה שיותר רקמת חיבור ככל האפשר באמצעות דומונט #5/45 מלקחיים, ואם יש צורך, מספריים קפיציים. - בהתאם למטרת הניסוי, המשך בסעיף 2, 3 או 5 של פרוטוקול זה.
2. פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה של הר שלם
הערה: פרוטוקול זה מותאם מכתמי הרכבה שלם4,29. בצע שלבי דגירה עבור כל ס"ג בבאר אחת של צלחת 96-well והשתמש ב-100 μL (לפתרונות המכילים נוגדנים) ל-200 μL (לכל הפתרונות האחרים) של הפתרון כדי להבטיח כיסוי מלא. בדוק באופן קבוע את הכיסוי וטבילה נכונה של SG עם משקפת. הסר נוזלים באופן ידני עם 200 μL pipette עם טיפ נוסף 10 μL על גבי קצה 200 μL. זה ימנע שאיפה של SG בקצה פיפטה. השתמש בפתרונות טריים ונוזלים סטריליים כדי למנוע צמיחה חיידקית.
- תקן SG עבור היסתולוגיה עבור 2 שעות ב RT ב 4% ללא מתנול paraformaldehyde (PFA)/PBS.
- תהליך SG מהר ככל האפשר, אבל הם יכולים להיות מאוחסנים במשך 2-4 שבועות ב 4-6 °C ב PBS עם 0.02% (w /v) נתרן אזיד בשלב זה.
- הכן פתרון מלאי שחור סודאן (1% סודאן שחור w / v ב 100% אתנול) להפחתת autofluorescence ושיפור של יחס איתות לרקע30. ממיסים במשך 2-3 שעות על מערבב מגנטי ב RT.
הערה: השתמש בפתרון המלאי למשך 6-8 שבועות לכל היותר, בטל מוקדם יותר כאשר מופיע מטען. - הכן פתרון עבודה שחור סודאני על ידי centrifuging פתרון המלאי במשך 30 דקות במלוא המהירות (13,000 x g)כדי להסיר פסולת ודילול המניה ב 70% אתנול לריכוז סופי של 0.25% סודאן שחור.
- לטפל SG עם אקונומיקה של דנט כדי לשפר את פרמביליזציה נוגדן31. הכינו טרי את האקונומיקה של דנט על ידי ערבוב מתנול (MeOH), תמיסת מי חמצן 30% (w/w) ב- H2O ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) ביחס של 4:1:1. הוסף 200 μL לכל SG ומניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך שעה אחד ב RT.
- בצע סדרת MeOH יורדת להתייבשות על ידי דגירה במשך 10 דקות כל אחת על שייקר מסלולית: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
- בצע פרמזביליזציה על ידי דגירה SG פעמיים במשך 60 דקות כל אחד PBS / 1% טריטון-X-100 ב RT.
- הסר פתרון permeabilization מן SG ולהוסיף פתרון עבודה שחור סודאן. דגירה במשך 2 שעות ב RT על שייקר מסלולית.
- בינתיים, להכין פתרון חסימה על ידי הוספת 5% קולטן כיתה סרום סרום אלבומין (BSA) ו 0.1% Triton-X-100 ב PBS כלי 15 מ"ל ולתת לו להתמוסס על שייקר רולר במשך כ 5-10 דקות. דקאנט דרך מסנן נייר קפלים מראש כדי להסיר פסולת.
- הסר סודאן שחור בזהירות רבה על ידי הטיית הצלחת בזהירות pipeing מהצד הזקוף.
הערה: לא ניתן לראות את ה- SG בסודאן שחור. השתמש במקור אור חזק ועבוד לאט. מצעד זה ואילך, ס"ג מוכתמים בשחור ומשפרים את הנראות. אם רקמת חיבור נוספת נראית סביב ס"ג בשלב זה, הסר אותה באמצעות מלקחיים #5/45 דומונט ומספריים קפיציים. - הוסף 200 μL של PBS / 0.1% Triton-X-100 (PBS-T) ולשטוף במשך 5 דקות ב RT על שייקר מסלולית.
- הסר PBS-T על ידי שאיפתו עם פיפטה ולחזור על 2 פעמים.
- הסר PBS; להוסיף 200 μL של פתרון חסימה ודגורה ב 4 °C (50 °F) לילה על שייקר מסלולית.
- למחרת, להכין פתרונות על ידי הוספת נוגדנים עיקריים בפתרון החסימה. התאם ריכוזי נוגדנים מפרוטוקולים שנקבעו.
הערה: כלול SG אחד כבקרה נוגדנים ללא נוגדן ראשוני (דגירה עם נוגדן antigen-preabsorbed או IgG, אם זמין, או בלוק חוצץ). - בצע דגירה נוגדן ראשוני עבור 36-48 שעות ב 4 °C (6 °F) על שייקר מסלולית. למדידות גודל התא והכתמת נוירונים אוהדים, השתמש בנוגדנים נגד טירוצין הידרוקסילאז (ראה טבלת חומרים להמלצות נוגדנים).
הערה: מניחים את הצלחת 96-well בתא רטוב (למשל, קופסת פלסטיק מרופדת במגבות נייר רטובות DDH2O) כדי למנוע אידוי בשלב זה. - הסר פתרון נוגדנים בזהירות ולהוסיף 200 μL של PBS-T. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 30 דקות.
- הסר PBS-T ולחזור על שלב הכביסה 5 פעמים נוספות.
- הכן את פתרון עבודת הנוגדנים המשני על ידי צנטריפוגה של נוגדנים משניים בעלי תווית פלואורסצנטית של Alexa למשך דקה אחת במהירות מלאה (13,000 x גרם) לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים על פי הנוגדנים העיקריים 1:500 בתמיסת החסימה ולהוסיף ל- SG. הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל של bisbenzimide H33342 trihydrochloride (הכתמת Hoechst) אם מכתים גרעיניים הוא הרצוי. דגירה במשך 12-24 שעות ב 4 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- הסר את פתרון הנוגדנים בזהירות ולהוסיף 200 μL של PBS-T. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 30 דקות.
- הסר PBS-T ולחזור על שלב הכביסה 5 פעמים נוספות. בשלב האחרון, השתמש PBS ללא טריטון.
- להטבעה, יש למרוח 50-100 מיקרו-לן של מדיום הרכבה פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים)על מגלשת זכוכית ולהניח מתחת למשקפת הכנה. השתמש Dumont #5/45 מלקחיים כדי לאסוף SG מן הצלחת 96-well ולהסיר נוזל עודף על ידי טבילת קצה אחד על נייר מסנן (למשל, כרית ייבוש Whatman) ומניחים אותו על הטיפה.
- השתמש במלקחי #5/45 של דומונט כדי לתקן מיקום עם ההגדלה המתאימה.
- מניחים בעדינות כיסוי זכוכית (20 מ"מ על 20 מ"מ) ליד ה- SG ויורדים לאט.
הערה: שימוש מדי מדיום הרכבה יגרום תנועה של SG או הסתבכות של עצבים. במקרה כזה, הסר במהירות את כיסויי השער וחזור על שלבים 2.9-2.21. - תן לשקופיות להתייבש בחושך בלילה ב RT. אחסון של הדגימה המוכתמת אפשרי לפחות 4-6 שבועות ב 4 °C (4 °F).
3. הר שלם בהכלאה במקום
הערה: הרה מלאה במקום-הכלאה של SG מותאם מן האיבר של קורטי32 ואת פלואורסצנטיות RNA מסחרי בפרוטוקול situ (ראה טבלה של חומרים). להשיג בדיקות עבור הגנים של עניין ומאגרים ופתרונות מהספק. כל שלבי הדגירה מבוצעים ב- RT, אם לא צוין אחרת. השתמש PBS סטרילי. אם מעוניינים להכתים מספר ס"ג בבאר אחת, השתמש לפחות 150 μL של חוצצים ופתרונות.
- בצע ניתוח של SG כמתואר בשלבים 1.1-1.13.
- קיבוע SG עבור 1 שעה ב 200 μL של 4% ללא MeOH PFA / PBS בבאר אחת של צלחת 96 טוב להציב על שייקר מסלולית.
- לשטוף את ס"ג שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחת ב 0.1% Tween-20/PBS על שייקר מסלולית.
- ייבשו את SG בסדרת MeOH/PBS על ידי הדגירה הבאה ב-50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS ו-100% MeOH למשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולי.
- חנות SG ב -20 °C (50 °F) ב 100% MeOH לילה.
- למחרת, מראש לחמם את החממה ל 40 °C (50 °F). בדוק את הטמפרטורה עם מדחום.
- Rehydrate SG בסדרת MeOH /PBS הפוכה (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) למשך 10 דקות כל אחד.
- לשטוף SG שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב PBS.
- בינתיים, להתחיל מראש לחמם את הבדיקות על ידי דגירה ב 40 °C (50 °F) במשך 10 דקות, ואחריו קירור במשך 10 דקות.
- דגירה SG ב 200 μL של פרוטאז III במשך 15 דקות.
- אופציונלי: בצע טיפול שחור בסודאן כדי להרוות את ההפלה האוטומטית לפי סעיפים 2.3, 2.4 ו-2.8 של פרוטוקול זה אם מתוכנן הכתמת אימונופלואורסצנטיות עוקבת.
- לשטוף SG ב 200 μL של 0.1% Tween-20 / PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד על שייקר מסלולית.
- אופציונלי: אם יש צורך בהכתמת שיתוף פעולה עם מספר בדיקות, לדלל ערוץ-2 (50x) ואת ערוץ-3 בדיקה (50x) בגשושית ערוץ-1 (1x).
- לכסות SG עם 100 μL של בדיקה עבור הגן של עניין ודגרה לילה ב 40 °C (50 °F) עם תסיסה קלה. מניחים את הצלחת 96-באר בתא רטוב ב 40 °C (40 °F) עבור כל מדרגות הדגירה.
הערה: כלול ס"ג אחד כשליטה שלילית, באמצעות בדיקה נגד גן חיידקי (למשל, דיהידרו-דיפיליקלינט רדוקטאז, Dapb) כדי לבדוק כריכה לא ספציפית של ריאגנטים להגברה בשלבים מאוחרים יותר. - לשטוף SG במאגר כביסה מסופק 3x במשך 15 דקות כל אחד על שייקר מסלולית.
- אמפר 1-3, HRP-C1 וחוסם HRP ל-RT. אם יש צורך בהכתמה משותפת עם גשושית ערוץ 2 ו/או ערוץ-2, יש צורך בחימום מראש של HRP-C2 ו-HRP-C3.
- לתקן מחדש את SG במשך 10 דקות ב RT ב 4% PFA / PBS על שייקר מסלולית.
- לשטוף SG ב 200 μL של חוצץ כביסה מסופק 3x במשך 5 דקות כל אחד על שייקר מסלולית ב RT.
- להגברה, דגירה SG עם 100 μL של Amp1 במשך 35 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- הסר בזהירות כל נוזל לשטוף SG ב 200 μL של חוצץ כביסה מסופק 3x במשך 5 דקות כל אחד ב RT על שייקר מסלולית.
- דגירה SG עם 100 μL של Amp2 במשך 35 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- חזור על שלב 3.18.
- דגירה SG עם 100 μL של Amp3 במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- חזור על שלב 3.18.
- דגירה SG עם 100 μL של מסופק Multiplex FL v2 HRP-C1 במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- חזור על שלב 3.18.
- הכן נוגדן משני מצומד אופל 1:1,000 ב 200 μL של מסופק TSA-חוצץ ודגרת SG במשך 35 דקות ב 40 °C (50 °F) על שייקר מסלולית. להגן מפני אור במהלך הדגירה ומשלב זה ואילך.
- חזור על שלב 3.18.
- דגירה SG ב 100 μL של חוסם HRP RRP R2 Multiplex FL מסופק במשך 15 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
- חזור על שלב 3.18.
- אופציונלי: להכתמת שיתוף פעולה עם בדיקה ערוץ-2, חזור על שלבים 3.25-3.30 עם HRP-C2 של Multiplex FL v2 שסופק.
- אופציונלי: להכתמת שיתוף פעולה עם בדיקה ערוץ-3, חזור על שלבים 3.25-3.30 עם HRP-C3 של Multiplex FL v2 שסופק.
- במקרה של כתמים חיסוניים הבאים, בצע שלבים 2.13-2.25 של פרוטוקול זה.
- דגירה ב 1% BSA / PBS במשך 30 דקות על שייקר מסלולית.
- דגירה SG במשך 30 דקות ב 1 מיקרוגרם / מ"ל של bisbenzimide H33342 trihydrochloride (הכתמת Hoechst) ב 1% BSA / PBS אם מכתים גרעיניים רצויים ו / או להוסיף אלכסה זוג חיטה נבט אגלוטינין (WGA, 1:500) על שייקר מסלולית.
- חזור על שלב 3.18.
- הטמע כמתואר בשלבים 2.19-2.22.
4. הדמיה ניתח של גרעיני כוכבית מורין
- בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית של SG מוטבע במתקן ההדמיה המקומי.
- אם נדרשות מדידות גודל תא, התמונה SG מוכתמת עבור טירוצין הידרוקסילאז (ראה טבלת חומרים ) בהגדלה שלפי 200 וצילום תמונות אקראיות של 4-6 מכל ס"ג.
- ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ33 כדי להעריך את גודל התא (למשל, עם טבלת עט, ראה טבלת חומרים). השתמש בבחירת יד חופשית, הקף כל תא ולחץ על ניתוח | מדוד כדי להשיג אזור תא. היזהר לכלול רק תאים שלמים, גלויים לחלוטין הממוקמים היטב בתוך SG.
- בשיטה זו, בצע מדידה של כ-100 תאים לכל ס"ג.
- יש חוקר עיוור לבצע שלבים 4.2-4.3 אם אתה רוצה להשוות ס"ג מעכברים שונים. השתמש בהתפלגות תדירות בתוכנה סטטיסטית כדי להציג באופן חזותי הבדלי גודל בין קבוצות34.
5. ניתוחים מולקולריים של גרעיני כוכבית מורין
הערה: כלול פקדים בהתאם לעיצוב הניסיוני שלך. זה יכול להיות SG עם גנוטיפים שונים רקע מחלות ו / או גרעינים אוטונומיים אחרים, כגון גנגליון צוואר הרחם העליון אוהד (הממוקם באזור הצוואר, ראה תיאור מפורט זיגלר ואח'35) או גרעינים parasympathetic (כגון גרעינים תוך לב, ראה יונגן ואח'.
- הכן צינור 2 מ"ל עם 500 μL של פנול / guanidine thiocyanate פתרון (למשל, Qiazol) לכל חיה ויש לי חנקן נוזלי מוכן לציפוי זעזועים או לשקול פתרונות מסחריים להגנה על RNA (אופציונלי, ראה טבלת חומרים)36. עבוד במהירות לבידוד RNA.
- בצע ניתוח של SG כמתואר בשלבים 1.1-1.13.
- מיד לטבול את שני SG ישירות בצינור אחד עם פנול / guanidine thiocyanate פתרון וצינור כפור הלם בחנקן נוזלי.
- יש לאחסן ב-80 °C (70 °F) עד לעיבוד נוסף.
- עבור תמוגה רקמה, לתת צינורות עם SG להפשיר עד פנול / guanidine thiocyanate פתרון הוא נזיל ולהוסיף שני חרוזים נירוסטה 7 מ"מ. מצננים את חלקי המתכת של הומוגניזר רקמות (טחנת כדור או מיקסר, למשל, רקמה ליסר II) על קרח יבש וצנטריפוגה ב 4 °C (50 °F).
- צינורות צנטריפוגות ב 500 x גרם במשך 1 דקות ב 4 °C (70 °F), כך SG נמצאים בתחתית הצינור.
- שים צינורות לתוך חלקי המתכת של ליזר רקמה וליזה במשך 1 דקות ב 20 הרץ.
- חזור על שלבים 5.6 ו 5.7 עד 5 פעמים עד שאין ניתן לזהות רקמה שלמה.
- מעבירים את הנוזל לצינור 1.5 מ"ל טרי.
- בצע בידוד RNA עם ערכת בידוד RNA מבוססת טורים (למשל, ערכת מיני miRNeasy) בהתאם להוראות היצרן.
- יש צורך ב-RNA ב-20 מיקרו-אל של מים נטולי RNase ומדוד ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: כדי לא לכלול זיהום של RNA מטוהר עם DNA גנומי, אנו מציעים לבצע תגובת שרשרת פולימראז עם פריימרים גנומיים ו 1 μL של RNA כתבנית, במקום פחות בקרת תמלול הפוכה. זה יחסוך כמות משמעותית של RNA. אם RNA מזוהם, השתמש בפריימרים גבול אקסון-intron או פריימרים לאגף intron עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית הבאה. - השתמש 250 ng SG RNA כדי לבצע סינתזה cDNA ולהשתמש בפרוטוקולים הוקמה. כאן, ערכת תמלול הפוך cDNA בקיבולת גבוהה שימשה בהתאם להוראות היצרן.
- לדלל לריכוז סופי של 2.5 ng/μL של cDNA ולבצע תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת עם הבדיקות המתאימות על פי הפרוטוקולים שנקבעו. כאן, TaqMan Assay (ראה טבלת חומרים)בוצע באמצעות 10 ng cDNA לכל תגובה.
הערה: בצע שליטה ללא תבנית עבור כל גן כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות. - נרמל ביטוי גנים של גן העניין שלך על גן שמירה על הבית (למשל, Cdkn1b) כדי להשוות ביטוי גנים יחסי בין קבוצות שונות של SG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדמיין כיצד לזהות ולנתח את ה-SG. איור 1A מציג ציור סכמטי של המיקום, ואילו איור 1B מציג את הנוף לבית החזה לאחר הסרת חבילת הלב-ריאה. שרירי הקולי הארוכים השמאליים והימניים מתווכים מהס"ג וכלוב הצלעות הם ציוני דרך חשובים להתמצאות. הניתוח מתבצע לאורך הקווים המנוקדים בין השרירים לצלע הראשונה. ה-SG והשרשרת הסימפתטית נראים כמבנים לבנים(איור 1C). איור 1D מראה הגדלה של האזור שבין שריר הקולי השמאלי של לונגו לצלע הראשונה, שם ממוקם ה-SG השמאלי. מורפולוגיה של SG שונה בין אנשים. זה מורכב לעתים קרובות היתוך של צוואר הרחם הנחות ואת הראשון עד השלישי הגרעינים בית החזה24. מגוון מסוים כי הנסיין יכול לצפות ב SG מורין מתואר איור 1E,F, שבו שמאל וימין SG של חמישה עכברי בר C57Bl6 זכרים מצולמים.
הערכה של סקירה אנטומית גולמית, כמו גם ניתוחים תאיים ותת-תאיים של תאים ב- SG innervating הלב יכול להתבצע על ידי טכניקות הרכבה שלמה על חלבון ורמת RNA. סקירה כללית של ס"ג מוצגת באיור 2. סיבים סימפטיים שריר הלב מקורם בגופי תאים ב- SG. אלה הם דמיון על ידי כתמים עם נוגדן נגד טירוצין הידרוקסילאז (TH). סומאטה עצבית המבטאת TH מוקפת בסיבי עצב המכתימים חיובי עבור כולין אצטילטרנספראז (ChAT). אלה הם סיבים presynaptic סביר37,38. הגדלה מופתית מתיוג משותף של TH ו- ChAT מוצגת באיור 2A. תאי גליה המקיפים את גופם של תאי העצב ניתנים להדמיה על ידי כתמים עבור S100B. זה מתואר באיור 2B בשילוב עם הסמן העצבי PGP9.5. איור 2C-F מראה ניתוחים למופת כדי ללמוד את ה- SG ברמה תת-תאית, תוך שימוש בהר שלם בהכלאה במקום ובהכתמה משותפת חיסונית. מולקולות החלבון TH(איור 2C,אדום) ו-mRNA של Tubb3 (איור 2D,לבן) מתבטאות בגופי תאים עצביים גדולים, ואילו mRNA של S100b (איור 2E,ירוק) ניתן לזיהוי גם בתאי גליה שמסביב. במיזוג (איור 2F),נראה כי כמה נוירונים הם שליליים עבור TH אבל אקספרס Tubb3, בעוד S100b mRNAs ניתן לזהות גם בתאים שמסביב, כפי שמתואר בהגדלה באיור 2G.
איור 3 מציג ניתוחים כמותיים פוטנציאליים ומלכודות לחקר ה- Murine SG. תמונות מ- SG מוכתם ב- TH (איור 3A) יכולות לשמש למדידות גודל התא כפי שבוצע למופת למודל עכבר של סוכרת. סומטה עצבית משליטה (db/het) SG היו 388.8 ± 123.8 מיקרומטר2 לעומת ב SG סוכרתי (db/db) 407.33 ± 139.6 מיקרומטר2 (איור 3B, n = 2 SG, 100 תאים לכל SG לכל גנוטיפ, P = 0.348, נתונים הושוו באמצעות מבחן מאן-ויטני). איור 3C מציג את הביטוי של גנים מסוגי תאים שונים של ה- SG (n = 6.7). איגום שני הס"ג מבעל חיים אחד מאפשר מדידות ביטוי גנים של כ-24 גנים (12 גנים בכפילויות). בדרך כלל אנו מנרמלים דגימות עבור Cdkn1b (זוהה בערכי Ct של 25.4 ± 0.97) כמו גם את הסמן העצבי Neun/ Rbfox3 (32.5 ± 0.7) אם יש צורך להסביר סוגי תאים אחרים וטוהר עצבי של ביתור. גנים שמצאנו שימושיים לאפיון תהליכים מולקולריים ב- SG כוללים את הגן הסימפתטי Th (22.4 ± 1.6), צ'אט, אשר יכול להצביע על transdifferentiation cholinergic (לידי ביטוי בערכי Ct של 30.8 ± 1.3) ו- Gap43, סמן לנבטים עצביים (ניתן לזיהוי בערכי Ct של 22.4 ± 1.4). גנים המתבטאים בסוג תאים שאינם תאי עצב כוללים S100b (עבור תאי גליה, 27.3 ± 1.2), Ki-67 (להתרבות תאים, 33.0 ± 1.6) ו- Cd45 (לתאי מערכת החיסון, 30.2 ± 1.1).
ה- SG מוקף בכמוסה של רקמת חיבור26, הדמוי באמצעות המטוקסילין וכתמי אאוזין באיור 3D,E. מדי פעם ראינו חוסר עקביות בהכתמה על בסיס נוגדנים כפי שהודגם באיור 3F, ככל הנראה בשל הסרה חלקית של הקפסולה. בעוד כתמי ChAT ו- TH ניתנים לזיהוי רק בחלקים מסוימים של ה- SG, גרעינים מוכתמים ב- DAPI ניתנים לזיהוי בכל רחבי. הקו המקווקו בתמונה הממוזגת מפריד בין הכתמה מוצלחת (מימין לקו) מכתמים לא מוצלחים (משמאל לקו).
הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כערך P של <0.05; ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה מסחרית.
איור 1: מיקום, ניתוח ומורפולוגיה של הגרעינים המורין סטולט. (א)ציור סכמטי של מיקום הגרעינים הכוכביים (ס"ג). (B)צפו בבית החזה לאחר הסרת חבילת הלב-ריאה. חשוב לציין כי ס"ג אינם גלויים באופן מיידי רוב הזמן. שרירי הקולי הארוכים ממוקמים לרוחב מעמוד השדרה. הס"ג ממוקמים לרוחב מהשרירים בצומת עם הצלע הראשונה. בזהירות לנתח לרוחב לשרירים (אזור מסומן על ידי קו מנוקד) כדי לחשוף את הגרעינים. לאחר הניתוח, גרעינים (שמאל וימין, LSG ו- RSG, בהתאמה) ואת השרשרת הסימפתטית ניתן לעשות כמו מבנים לבנים, ארוכים. (ג)ניתוח מופתי המציג את הגרעינים וציוני הדרך האנטומיים. (ד)הגדלה של LSG. (E)LSG ו -( F) RSG מסוג פראי, עכברי C57Bl6 זכרים (16 שבועות) נותחו וצולמו כדי להראות את הווריאציות במורפולוגיה ובגודל. סרגל קנה המידה מייצג 1,000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה של סוגי תאים שונים בגרעיני מורין סטלט באמצעות אימונוהיסטוכימיה שלמה בהרים ובהכלאה במקום. (א)סקירה גסה של גנגליון כוכבי מורין (SG) המוכתם עבור הסמן הסימפתטי טירוצין הידרוקסילאז (TH) וכולין אצטילטרנספראז (ChAT). ההגדלה מראה גופי תאים חיוביים TH ואת נוכחותם של ChAT חיובי, סביר להניח פרזינפטי, סיבי עצב המקיפים סומאטה עצבית. (B)תאי גליה המשתלבים בגופי תאים עצביים יכולים להיות חזותיים על ידי כתמים עבור S100B, כאן בשילוב עם הסמן העצבי PGP9.5. (C,D,E,F) תמונות מיקרוסקופיות של הר שלם מוכתם SG אחד באמצעות שילוב של אימונוהיסטוכימיה עבור TH (אדום) ו במקום הכלאה עבור Tubb3 (D, לבן) ו S100b (E, ירוק). גרעינים מוכתמים עם DAPI (כחול). (ו)המיזוג מראה כי לא כל התאים העצביים(Tubb3-חיובי) הם חיוביים TH. S100b mRNAs ניתן לזהות בתוך סומטה עצבית, אבל גם סביב תאים, כפי מסומן על ידי חץ בהגדלה ב (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוחים ומלכודות כמותיים פוטנציאליים. (A)ניתן להשתמש בתמונות מ- Tyrosine-hydroxylase (TH) מוכתם SG למדידות גודל התא באמצעות ImageJ. (B)זה בוצע במודל עכבר של סוכרת (100 תאים לכל SG, n = 2 SG לכל גנוטיפ, נתונים הושוו באמצעות מאן-ויטני בדיקה). (C)גנים למופת שבאים לידי ביטוי ב- SG שעשויים להיות שימושיים לאפיון תהליכים מולקולריים. Cdkn1b, כמו גם את הסמן העצבי Neun / Rbfox3 (כדי להסביר את נוכחותם של סוגי תאים אחרים) ניתן להשתמש לנורמליזציה. טירוצין הידרוקסילאז(Th)משמש כסמן אוהד, כולין אצטילטרנספראז(צ'אט)עבור טרנסדיפרנטיאציה כולינרגית, Gap43 לנבטות עצביות. גנים המתבטאים בסוגי תאים שאינם תאי עצב כוללים S100b (תאי גליה), Ki-67 (תאים מתרבים) ו- Cd45 (תאי מערכת החיסון). (ד)הכתמת המטוקסילין ואאוזין של ס"ג קבוע פורמרין מדמיינת רקמת חיבור ותאים מעל ה- SG.(E ) הגדלה מהאזור בקופסה. (ו)במקרים מסוימים, ראינו כשל בהכתמה מבוססת נוגדנים, ככל הנראה עקב הסרה חלקית של הקפסולה. בעוד כתמים ChAT (אדום) ו TH (ירוק) ניתנים לזיהוי רק בחלקים מסוימים של SG, גרעינים נגד DAPI (כחול כהה) ניתנים לזיהוי לאורך כל הדרך. הקו המקווקו בתמונה הממוזגת מפריד בין הכתמה מוצלחת (מימין לקו) מכתמים לא מוצלחים (משמאל לקו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההבנה של תהליכים תאיים ומולקולריים בתאי עצב ותאי גליה של מערכת העצבים הסימפתטית שקדמו לתהתפרצות VA היא עניין רב, כמו דום לב פתאומי נשאר הגורם הנפוץ ביותר למוות ברחבי העולם5. לכן, בכתב היד הנוכחי, אנו מספקים רפרטואר בסיסי של שיטות לזיהוי ה- Murine SG – אלמנט מורין בתוך רשת זו – ולבצע ניתוחים הבאים על RNA, חלבון, ורמת התא.
אתגר אחד של ס"ג מורינה הוא גודלו ומספר התאים המוגבל39. בשל כך, מודלים שונים של בעלי חיים, כגון חולדות40, כלבים22, וחזירים41 משמשים למחקרים על SG. ובכל זאת, יש מגוון של מודלים מחלה מבוססים היטב עבור פנוטיפים לב זמין בעכברים וחלקם כבר מאופיינים בהיבטים שונים של innervation הלב הפרעות קצב, כגון מודלים לסוכרת23, אוטם שריר הלב42, או שריר הלב43. לכן, מחקרים נוספים של SG murine מוצדקים לאפיין עוד יותר תפקוד אוטונומי לאור VA. אלה יכולים להסתיים על ידי גישות אחרות כדי לחקור innervation של הלב המוריני כגון ניסויים פונקציונליים4,23,44 כולל גירוי in-vivo של SG23.
בשל גודלו הקטן ומיקומו בתוך חלל בית החזה24, מניפולציה של SG מורין ב vivo הוא מאתגר, אם כי זה בוצע בהצלחה23. מסיבה זו, כמה מחקרים מתמקדים אפוא הגרעינים הצוואריים מעולה, אשר ממוקמים נגישים יותר בצוואר, במעלה הזרם של SG בשרשרת הסימפתטית מאחורי bifurcation עורקי עורקים פנימיים וחיצוניים24,35. denervation לב באמצעות הסרת הגרעינים הצוואריים מעולה הוכח כדי להקליש דלקת שריר הלב, היפרטרופיה, תפקוד לקוי לב לאחר אוטם שריר הלב35. עם זאת, חשוב לציין כי הגרעינים הצוואריים העליונים פנימיים אזורים שונים של הלב, הבולטים ביותר בצד45. בנוסף, סקירה ספרות מעמיקה שנערך לאחרונה הגיעה למסקנה כי התפקיד של גרעיני צוואר הרחם על innervation אוהד של הלב עדיין לא ברור בבניאדם 46. זה מדגיש את החשיבות של אפיון SG למחקרים של innervation אוהד לב.
חשוב לציין כי הלב אינו המטרה היחידה של ס"ג. בין היתר,ריאות 47 ובלוטות זיעה ב forepaw48 הם גם innervated סיבים שמקורם SG, האחרון הם יוצא מן הכלל פיזיולוגיה אוהד כפי שהם מבטאים כולין acetyltransferase37. מצור זמני של SG נחקר לגבי תהליכים דלקתיים בפגיעהריאות חריפה 49 או לטיפול ב גלי חום ושינה לקויה50; לכן, הפרוטוקולים בהישג יד עשויים להציע רפרטואר לשאלות מכניות בתחומים אלה. כאשר מתמקדים במודלים של מחלות לב, יש לזכור לפרשנות של תוצאות כי נוירונים לב לא ניתן להבדיל על ידי מורפולוגיה או תכונות אלקטרופיזיולוגיות נוירונים שאינם לב51. זה יכול להיות מושגת על ידי מעקב מדרדר, ובכך המיקום של נוירונים הקרנה ללב הוכח להיות ממוקם בחלקים cranio-medial של SG52.
בנוסף, חשוב לציין כי מלבד סוגים שונים של נוירונים, גרעינים אוהדים מורכבים גליה ensheathing, מה שנקרא תאי גליה לווין או תאי לווין מסומן על ידי ביטוי של סמן גליה S100B53. בעוד מעט ידוע על תפקידם של תאים אלה בפתולוגיות לב וכלי דם, הפעלת גליה וביטוי של חלבון חומצי פרברילי גליה (GFAP) תוארה ב SG מחולים עם הפרעות קצב18.
כמה מלכודות יש לזכור עם השיטות המוצגות: ראינו חוסר עקביות כתמים מבוססי נוגדנים במקרים מסוימים והשערה כי הסרה חלקית של כמוסת רקמת החיבור ensheathing SG עשוי להיות אשם, כפי שהם תוארו להשתנות חלידה בין סוגים שונים של גרעינים26. הסרה מכנית של הקפסולה באמצעות מלקחיים עדינים תוארה בגנגליון צוואר הרחם העליון של חולדות עד היום שלאחר ההולדה 1028 ו desheathing מוזכר בספרות עבור עכברוש מבוגר SG54,55 ועכברים56. הסרת כמוסת SG עשויה להשתנות בין גיל28 ובשל הבדלי גודל – מינים. מניסיוננו, ניתוח טרי, הסרת רקמת חיבור רבה ככל האפשר באמצעות מלקחיים עדינים וחלידה יסודית כמתואר בפרוטוקול בהישג יד, הם גורמים חשובים להכתמה מוצלחת. לגבי PCR כמותי בזמן אמת, עבודה מהירה ותסיסה יעילה הם חיוניים. איגום שני SGs מבעל חיים אחד באופן אמין מותר לניתוח של עד 12 גנים שונים (בעת ביצוע כפילויות).
למרות תפקוד אנטומיה גסה של ס"ג נחקר במשך עשרות שנים עכשיו וכל cardiomyocyte הוא innervated על ידי סיבים אוהדים46, שאלות פתוחות רבות נשארות. לדוגמה, עדיין לא ברור, מדוע נוירונים אוהדים של טרנסדיפרנטיאט SG חולף פנוטיפ כולינרגי ב איסכמי21 ואי ספיקת לב לא איסכמית, במודלים של בעלי חיים כמו גם בחולים20. לאחרונה, הקבוצה שלנו תיארה תפקיד של תאי גליה S100B חיובי, אשר נמצאים גם ב SG מורין, על עצב נבט במערכת העצבים הלב29. אם תאים אלה רלוונטיים לנבט עצב אוהד לאחר פציעה הקשורה VA11,12, צריך להיות מובהר במחקרים עתידיים. חשוב לציין, גישות חדשניות, כגון אופטוגנטיקה52 ניתוני transcriptome36 יכולים להשלים שיטות מבוססות כגון מעקב עצבי על מנת להעמיק את ההבנה של מערכת העצבים הסימפתטית ותפקידה באלקטרופיזיולוגיה לבבית.
לסיכום, רפרטואר זה מאפשר לחוקר חסר הניסיון לבצע אפיון בסיסי של ה- SG במודלים מוריניים של פתולוגיות לב. אנו מקווים כי זה יעורר את השימוש, שילוב, ויצירה של שיטות חדשניות. זה עשוי לעזור להגביר את ההבנה של התהליכים התאיים והמולקולריים הבסיסיים בנוירונים אוהדים שעשויים להיות אחראים לתחזוקה ותחזוקה של VA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות להארטוויג ויבולדט על הסיוע הטכני המצוין שלו, ולמתקן הדמיית המיקרוסקופיה בבריטניה (Umif) של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף על אספקת מיקרוסקופים ותמיכה. מחקר זה מומן על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W.
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I.
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
