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स्थान, विच्छेदन, और मुरीन स्टेलेट गैंगलियन का विश्लेषण

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

हृदय स्वायत्त तंत्रिका तंत्र में रोगविज्ञानी परिवर्तन, विशेष रूप से इसकी सहानुभूति शाखा में, वेंट्रिकुलर अतालता की शुरुआत और रखरखाव में योगदान देते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि अंतर्निहित आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ में सुधार करने के लिए मुरीन स्टेलेट गैंगलिया की विशेषता कैसे है।

Abstract

स्वायत्त तंत्रिका तंत्र कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का एक पर्याप्त चालक है। विशेष रूप से इसकी सहानुभूति शाखा की भूमिका वेंट्रिकुलर अतालता (वीए) के रोगविज्ञान में जांच का एक सतत मामला है । स्टेलेट गैंगलिया (एसजी) में न्यूरॉन्स   - सहानुभूति श्रृंखला के द्विपक्षीय स्टार के आकार की संरचनाएं -   सहानुभूति बुनियादी ढांचे का एक महत्वपूर्ण घटक हैं। एसजी चिकित्सा-रिफ्रैक्टरी वीए के साथ रोगियों में हृदय सहानुभूति denervation के माध्यम से उपचार के लिए एक मान्यता प्राप्त लक्ष्य हैं । जबकि एसजी में न्यूरोनल रीमॉडलिंग और ग्लियल एक्टिवेशन को वीए के रोगियों में वर्णित किया गया है, अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रक्रियाएं जो संभावित रूप से अतालता की शुरुआत से पहले होती हैं, केवल अपर्याप्त रूप से समझ में आती हैं और स्वायत्त मॉडुलन में सुधार करने के लिए स्पष्ट की जानी चाहिए। माउस मॉडल हमें सहानुभूति न्यूरोनल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, लेकिन मुरीन एसजी की पहचान अनुभवहीन अन्वेषक के लिए चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, मुरीन एसजी के गहन सेलुलर और आणविक जैविक अध्ययन में कई आम हृदय रोगों की कमी है। यहां, हम आरएनए स्तर पर विश्लेषण के लिए वयस्क चूहों में एसजी को विच्छेदन और अध्ययन करने के लिए एक बुनियादी प्रदर्शनों की सूची का वर्णन करते हैं (जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आरएनए अलगाव, सीटू संकरण में), प्रोटीन स्तर (इम्यूनोफ्लोर्सेंट पूरे माउंट धुंधला), और सेलुलर स्तर (बुनियादी आकृति विज्ञान, सेल आकार माप)। हम तैयारी तकनीक में चुनौतियों से उबरने के लिए संभावित समाधान प्रस्तुत करते हैं, और ऑटोफ्लोरेसेंस के शमन के माध्यम से धुंधला करने में कैसे सुधार करें। यह कोशिका संरचना और पुन तैयार करने की प्रक्रियाओं को निर्धारित करने के लिए स्थापित मार्कर के माध्यम से न्यूरॉन्स के साथ-साथ ग्लियल कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यहां प्रस्तुत किए गए तरीके एसजी को वीए से ग्रस्त चूहों में स्वायत्त शिथिलता के बारे में अधिक जानकारी हासिल करने की अनुमति देते हैं और हृदय में स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के न्यूरोनल और ग्लियल घटकों की जांच करने वाली अतिरिक्त तकनीकों द्वारा पूरित किया जा सकता है।

Introduction

हृदय स्वायत्त तंत्रिका तंत्र सहानुभूति, परानुभूति और संवेदी घटकों का कसकर विनियमित संतुलन है जो दिल को उचित शारीरिक प्रतिक्रिया1, 2के साथ पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूल होने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, इस संतुलन में गड़बड़ी, सहानुभूतिपूर्ण गतिविधि में वृद्धि, शुरुआत के साथ-साथ वेंट्रिकुलर अतालता (वीए)3, 4के रखरखाव के लिए एक प्रमुख चालक के रूप मेंस्थापितकी गई है। इसलिए, बीटा-ब्लॉकर्स के साथ सहानुभूतिपूर्ण गतिविधि की औषधीय कमी के माध्यम से प्राप्त स्वायत्त मॉड्यूलेशन,5,6दशकों से वीए के रोगियों के उपचार में एक आधारशिला रहा है। लेकिन औषधीय और कैथेटर आधारित हस्तक्षेप के बावजूद, रोगियों की एक प्रासंगिक संख्या अभी भी आवर्ती VA 7 सेग्रस्तहै ।

दिल के लिए सहानुभूति इनपुट ज्यादातर स्टेलेट गैंगलिया (एसजी) में न्यूरोनल सेल निकायों के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है, सहानुभूति श्रृंखला की द्विपक्षीय स्टार-आकार की संरचनाएं, जो ब्रेनस्टेम सेदिल8,9,10तक कई इंट्राथोरेसिक नसों के माध्यम से जानकारी रिले करती हैं। चोट लगने के बाद एसजी से नर्व अंकुरित होकर वीए और अचानक हृदय मृत्यु11,12से जुड़ा होता है , जो एसजी को स्वायत्त मॉडुलन 13,14के लक्ष्य के रूप में बल देता है । दिल के लिए सहानुभूति इनपुट की कमी स्थानीय संवेदनाहारी के परक्यूटेनियस इंजेक्शन के माध्यम से या स्थायी रूप से वीडियो-सहायता प्राप्त थोरेकोस्कोपी15, 16के माध्यम से एसजी को आंशिक रूप से हटाने के माध्यम से अस्थायी रूप से प्राप्त की जा सकती है। कार्डियक सहानुभूति denervation आशाजनक परिणाम14, 16, 17के साथ चिकित्सा-रिफ्रैक्टरी वीए के साथ रोगियों के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है । हमने इन रोगियों के लगाए गए एसजी से सीखा है कि न्यूरोनल और न्यूरोकेमिकल रीमॉडलिंग, न्यूरो-सूजन और ग्लियल एक्टिवेशन सहानुभूति रीमॉडलिंग की पहचान हैं जो स्वायत्त शिथिलता18, 19में योगदान या बढ़ सकते हैं। फिर भी, इन न्यूरॉन्स में अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रक्रियाएं आज तक अस्पष्ट रहती हैं, उदाहरण के लिए, न्यूरोनल ट्रांसफेशन की भूमिका कोलिनेर्गिक फेनोटाइप20, 21में। प्रयोगात्मक अध्ययन वीए के इलाज के लिए उपन्यास दृष्टिकोण पेश करते हैं, उदाहरण के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स22के माध्यम से सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि में कमी, लेकिन एसजी के गहन लक्षण वर्णन में अभी भी कई हृदय विकृति की कमी है जो वीए के साथ हाथ में जाती हैं। माउस मॉडल इन विकृतियों की नकल उतारने से न्यूरोनल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है जो संभवतःअतालता 12,23की शुरुआत से पहले होता है । इन्हें दिल और तंत्रिका तंत्र के स्वायत्त लक्षण वर्णन के लिए आगे रूपात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण द्वारा पूरा किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम वीए की समझ में सुधार करने के लिए मुरीन एसजी को विच्छेदन और विशेषता देने के तरीकों का एक बुनियादी प्रदर्शनों की सूची प्रदान करते हैं।

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Protocol

पशुओं से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को हैम्बर्ग राज्य की पशु देखभाल और उपयोग समिति (ORG870, 959) और उत्तरी राइन-वेस्टफेलियन स्टेट एजेंसी फॉर नेचर, पर्यावरण और उपभोक्ता संरक्षण (LANUV, 07/11) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुरूप (2011)। अध्ययन पुरुष और महिला (आयु वर्ग के 10-24 सप्ताह) C57BL/6 चूहों (स्टॉक नंबर 000664, जैक्सन प्रयोगशालाओं) और चूहों होमोजिगस (डीबी/डीबी) या विषम (डीबी/हेट; नियंत्रण) का उपयोग करके किया गया मधुमेह सहज उत्परिवर्तन (Leprdb;के लिए; बीकेएस। CG-Dock7m+/+ Leprdb/J, स्टॉक नंबर 000642, जैक्सन प्रयोगशालाओं) । लेखकों ६० सप्ताह तक आयु वर्ग के चूहों के लिए विविधताओं के बिना हाथ में प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है ।

1. मुरीन स्टेलेट गैंगलिया का स्थान और विच्छेदन

नोट: भले ही विवरण और चित्र ज्यादातर बड़ी प्रजातियों में उपलब्ध हैं, कुछ प्रकाशनों पहले चूहों24 और चूहों25 में एसजी के स्थान का वर्णन किया है शारीरिक तरीकों और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लाइनों का उपयोग कर, क्रमशः ।

  1. बर्फ-ठंड (3-4 डिग्री सेल्सियस) हेपरिनाइज्ड (20 यूनिट/एमएल, टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें) फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) की 50 एमएल तैयार करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर एसजी का विच्छेदन करें।
  2. संस्थागत और स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार 3%-5% आइसोफ्लुनान के साँस लेने से माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। पेडल निकासी पलटा के नुकसान से पर्याप्त संज्ञाहरण सत्यापित करें। चूहों को काटना या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का प्रदर्शन करना।
    नोट: गलत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के परिणामस्वरूप रीढ़ की हड्डी टूट सकती है और छाती वाले जहाजों की क्षति हो सकती है जिससे रक्तस्राव होता है जो सहानुभूति श्रृंखला की तैयारी या विच्छेद में बाधा डालता है, ताकि एसजी उनकी सही स्थिति में न हो। इसलिए, अनुभवी कर्मियों को ग्रीवा अव्यवस्था या गहरी बेहोशी में जानवरों को काटना महत्वपूर्ण है।
  3. इथेनॉल के साथ त्वचा स्प्रे और मेयो कैंची और संकीर्ण पैटर्न संदंश का उपयोग कर पूर्वकाल एक्सिलरी लाइनों के साथ दो चीरों के साथ छाती खोलें। डायाफ्राम काटें और रिबकेज के सामने हटा दें।
  4. लंदन संदंश का उपयोग कर डायाफ्राम के ठीक ऊपर महाधमनी और वेना कावा मनोरंजक और स्ट्रैबिसमस कैंची के साथ नीचे रीढ़ की हड्डी के करीब सभी जहाजों और संयोजी ऊतक काटने के द्वारा दिल फेफड़ों के पैकेज को हटा दें ।
  5. प्लास्टिक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके प्लास्टिक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके छाती को अच्छी तरह से फ्लश करें जब तक कि रक्त के सभी निशान हटा नहीं दिए जाते।
  6. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप तैयारी दूरबीन के तहत धड़ रखें और बाहरी प्रकाश स्रोतों के साथ छाती में अच्छी रोशनी सुनिश्चित करें।
  7. पहली पसली और लॉन्गस कोली मांसपेशियों का पता लगाएं।
    नोट: एसजी द्विपक्षीय स्थित हैं, पहली पसली और रीढ़ के बीच शाखा में रीढ़ के समानांतर, लोंगस कोली मांसपेशियों के लिए एक नाली पार्श्व में24। एसजी का सपाट पक्ष लॉन्गस कोली मांसपेशियों के निकट स्थित है। तैयारी के आधार पर, सहानुभूति श्रृंखला के कुछ हिस्से पहले से ही रीढ़ के समानांतर सफेद, तिरछे फाइबर के रूप में दिखाई दे सकते हैं। इनका पता एसजी के साथ लगाया जा सकता है।
  8. धीरे-धीरे डुमोंट #5/45 संदंश की नोक का उपयोग करने के लिए लोंगस कोली मांसपेशी के लिए संयोजी ऊतक पार्श्व का पर्दाफाश ।
  9. 180 डिग्री तक संदंश को घुमाएं और एसजी को पकड़ने के लिए फ्लैट साइड का उपयोग करें और इसे न्यूनतम दबाव के साथ बाहर निकालें।
  10. दूसरे एसजी के साथ दोहराएं।
  11. दोनों एसजी को ठंडे पीबीएस से भरे पकवान (6 सेमी व्यास) में रखें और उचित आवर्धन के साथ निरीक्षण करें। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त जहाजों, वसा ऊतकों और बड़ी नसों को हटा दें।
    नोट: स्वायत्त गंगलिया एक कनेक्टिव ऊतक कैप्सूल से घिरे हुए हैं जिसमें कोलेजन फाइबर और फाइब्रोब्लास्ट26,27शामिल हैं। इन कैप्सूलों की पारगम्यता प्रजातियों, विभिन्न प्रकार के गैंगलिया26 और आयु28के बीच भिन्न होती है। ड्यूमोंट #5/45 संदंश का उपयोग करके जितना संभव हो उतना संयोजी ऊतक निकालें और यदि आवश्यक हो, तो वसंत कैंची।
  12. प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर, इस प्रोटोकॉल के सेक्शन 2, 3 या 5 के साथ आगे बढ़ें।

2. होल माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल

नोट: यह प्रोटोकॉल कार्डियक होल माउंट स्टेनिंग4,29से अनुकूलित है । 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में हर एक एसजी के लिए इनक्यूबेशन कदम ों का प्रदर्शन करें और पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए समाधान के 200 माइक्रोन (अन्य सभी समाधानों के लिए) 100 माइक्रोन (एंटीबॉडी युक्त समाधानों के लिए) का उपयोग करें। नियमित रूप से कवरेज की जांच करें और दूरबीन के साथ एसजी के सही विसर्जन। 200 माइक्रोल टिप के शीर्ष पर अतिरिक्त 10 माइक्रोन टिप के साथ 200 माइक्रोल पिपेट के साथ तरल पदार्थ को मैन्युअल रूप से निकालें। इससे पिपेट टिप में एसजी की आकांक्षा पर रोक लगेगी। बैक्टीरियल ग्रोथ को रोकने के लिए ताजा तैयार समाधान और बाँझ तरल पदार्थ का उपयोग करें।

  1. 4% मेथनॉल-फ्री पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)/पीएफबीएस में आरटी में 2 घंटे के लिए हिस्ट्रोलॉजी के लिए एसजी फिक्स करें ।
  2. जितनी जल्दी हो सके एसजी प्रक्रिया है, लेकिन वे इस बिंदु पर 0.02% (w/v) सोडियम अजीमाइड के साथ पीबीएस में 4-6 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने और पृष्ठभूमि अनुपात 30 के संकेत में सुधार के लिए सूडान ब्लैक स्टॉक समाधान (1% सूडान ब्लैक डब्ल्यू/वी100%इथेनॉल में) तैयार करें। आरटी में एक चुंबकीय उभारक पर 2-3 घंटे के लिए भंग करें।
    नोट: अधिकतम 6-8 सप्ताह के लिए स्टॉक समाधान का उपयोग करें, तलछट दिखाई देने पर पहले त्यागें।
  4. मलबे को हटाने और 0.25% सूडान काले रंग की अंतिम एकाग्रता के लिए 70% इथेनॉल में स्टॉक को कमजोर करने के लिए पूरी गति (13,000 x g)पर स्टॉक समाधान को अपकेंद्री करके सूडान ब्लैक वर्किंग समाधान तैयार करें।
  5. एंटीबॉडी पारमेबिलाइजेशन31में सुधार करने के लिए डेंट ब्लीच के साथ एसजी का इलाज करें । 4:1:1 के अनुपात में मेथनॉल (MeOH), हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान 30% (w/w) एच2ओ और डाइमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को मिलाकर डेंट ब्लीच को ताजा तैयार करें। एसजी प्रति 200 μL जोड़ें और आरटी में 1 घंटे के लिए एक कक्षीय शेखर पर थाली जगह है।
  6. एक कक्षीय शेखर पर 10 मिनट प्रत्येक के लिए इनक्यूबेटिंग द्वारा रिहाइड्रेशन के लिए एक उतरते MeOH श्रृंखला प्रदर्शन: १००% MeOH, ७५% MeOH/PBS, ५०% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS ।
  7. आरटी में पीबीएस/1% ट्राइटन-एक्स-१०० में प्रत्येक में ६० मिनट के लिए दो बार एसजी इनक्यूबेटिंग करके परमीलाइजेशन करें ।
  8. एसजी से पारमेबिलाइजेशन समाधान निकालें और सूडान ब्लैक वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें। एक कक्षीय शेखर पर आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  9. इस बीच, पीबीएस ए 15 एमएल पोत में 5% रिसेप्टर ग्रेड गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.1% ट्राइटन-एक्स-100 जोड़कर अवरुद्ध समाधान तैयार करें और इसे लगभग 5-10 मिनट के लिए रोलर शेकर पर भंग करें। मलबे को हटाने के लिए एक पूर्व-प्लीटेड पेपर फिल्टर के माध्यम से डिकेंट।
  10. प्लेट को झुकाकर और सीधे पक्ष से ध्यान से पिपटिंग करके सूडान काले को बहुत सावधानी से निकालें।
    नोट: सूडान ब्लैक में एसजी को देखना संभव नहीं है । एक मजबूत प्रकाश स्रोत का उपयोग करें और धीरे-धीरे काम करें। पर इस कदम से, एसजी काले दाग रहे हैं, दृश्यता बढ़ाने । यदि इस बिंदु पर एसजी के आसपास कोई अतिरिक्त संयोजी ऊतक देखा जाता है, तो इसे ड्यूमोंट #5/45 संदंश और स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके हटा दें ।
  11. पीबीएस/0.1% ट्राइटन-एक्स-100 (पीबीएस-टी) के 200 माइक्रोल जोड़ें और एक कक्षीय शेखर पर आरटी में 5 मिनट के लिए धोएं।
  12. पीबीएस-टी को पिपेट से हटाएं और 2 बार दोहराएं।
  13. पीबीएस निकालें; एक कक्षीय शेखर पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान और इनक्यूबेट के 200 μL जोड़ें।
  14. अगले दिन, अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़कर समाधान तैयार करें। स्थापित प्रोटोकॉल से एंटीबॉडी सांद्रता को अनुकूलित करें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में एक एसजी शामिल करें (यदि उपलब्ध हो, तो एंटीजन-प्रीबसोर्बेड एंटीबॉडी या आईजीजी के साथ इनक्यूबेटेड, या बफर को अवरुद्ध करना)।
  15. एक कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 36-48 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन प्रदर्शन करें। सेल आकार माप और सहानुभूति न्यूरॉन्स के धुंधला के लिए, टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करें (एंटीबॉडी सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इस बिंदु पर वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक गीले कक्ष में 96-अच्छी प्लेट रखें (उदाहरण के लिए, प्लास्टिक बॉक्स डीडीएच2ओ-गीला पेपर तौलिए के साथ लाइन में खड़ा है)।
  16. एंटीबॉडी समाधान को ध्यान से निकालें और पीबीएस-टी के 200 माइक्रोल जोड़ें। थाली को 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर रखें।
  17. पीबीएस-टी निकालें और वाशिंग स्टेप को 5 अतिरिक्त बार दोहराएं।
  18. उपयोग से पहले पूर्ण गति (13,000 x ग्राम)पर 1 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट एलेक्सा-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी वर्किंग समाधान तैयार करें। अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी 1:500 के अनुसार उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें और एसजी में जोड़ें। यदि परमाणु धुंधला है तो बिस्बेंजिमाइड एच33342 ट्राइहाइड्रोक्लोराइड (होचस्ट धुंधला) का 1 μg/mL जोड़ें। एक कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  19. एंटीबॉडी समाधान को ध्यान से निकालें और पीबीएस-टी के 200 माइक्रोल जोड़ें। थाली को 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर रखें।
  20. पीबीएस-टी निकालें और वाशिंग स्टेप को 5 अतिरिक्त बार दोहराएं। अंतिम चरण के लिए, ट्राइटन के बिना पीबीएस का उपयोग करें।
  21. एम्बेडिंग के लिए, एक ग्लास स्लाइड पर फ्लोरोसेंट माउंटिंग मीडियम (सामग्री की टेबलदेखें) के 50-100 माइक्रोन फैलाएं और तैयारी दूरबीन के तहत रखें। 96-अच्छी प्लेट से एसजी लेने के लिए ड्यूमोंट #5/45 संदंश का उपयोग करें और एक फिल्टर पेपर (जैसे, Whatman सुखाने पैड) पर एक छोर सूई द्वारा अतिरिक्त तरल को हटा दें और इसे ड्रॉप पर रखें।
  22. उचित आवर्धन के साथ स्थिति को सही करने के लिए ड्यूमोंट #5/45 संदंश का उपयोग करें।
  23. धीरे-धीरे एसजी के बगल में एक ग्लास कवरलिप (20 मिमी x 20 मिमी) रखें और धीरे-धीरे उतरें।
    नोट: बहुत अधिक बढ़ते माध्यम का उपयोग करने से एसजी या नसों की टैंगलिंग की गति में परिणाम होगा। यदि ऐसा होता है, तो कवरस्लिप को जल्दी से हटा दें और चरण 2.9-2.21 दोहराएं।
  24. स्लाइड्स में बता दें कि रात भर अंधेरे में सूख जाता है आरटी। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4-6 हफ्ते तक दाग वाले नमूने का स्टोरेज संभव है।

3. सीटू संकरण में पूरे माउंट

नोट: एसजी के सीटू-संकरण में पूरे माउंट को कोर्टी32 के अंग और सीटू प्रोटोकॉल में वाणिज्यिक आरएनए फ्लोरेसेंस (सामग्री की तालिकादेखें) से अनुकूलित किया गया है। आपूर्तिकर्ता से ब्याज और बफ़र्स और समाधान के जीन के लिए जांच प्राप्त करें। सभी इनक्यूबेशन कदम आरटी पर किए जाते हैं, यदि अन्यथा उल्लेख नहीं किया जाता है। बाँझ पीबीएस का उपयोग करें। यदि एक अच्छी तरह से कई एसजी धुंधला करने में रुचि रखते हैं, बफ़र्स और समाधान के कम से कम 150 माइक्रोन का उपयोग करें।

  1. 1.1-1.13 चरणों में वर्णित एसजी का विच्छेदन करें।
  2. एक कक्षीय शेखर पर रखा एक ९६ अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में 4% MeOH मुक्त पीएफए/PBS के २०० μL में 1 घंटे के लिए एसजी फिक्सेट ।
  3. एक कक्षीय शेखर पर ०.१% ट्वीन-20/पीबीएस में 30 मिनट प्रत्येक के लिए एसजी तीन बार धोएं ।
  4. 50% MeOH/PBS में बाद के इनक्यूबेशन द्वारा MeOH/PBS श्रृंखला में निर्जलित एसजी, 70% MeOH/PBS, और 100% MeOH के लिए 10 मिनट के लिए प्रत्येक एक कक्षीय शेखर पर।
  5. रात भर 100% MeOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर एसजी स्टोर करें।
  6. अगले दिन इनक्यूबेटर को 40 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। तापमान को थर्मामीटर से चेक करें।
  7. रिवर्स MeOH/PBS श्रृंखला में रीहाइड्रेट एसजी (१००% MeOH, ७०% MeOH/PBS, ५०% MeOH/PBS) 10 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  8. पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए एसजी को तीन बार धोएं।
  9. इस बीच, 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा जांच को प्री-वार्मिंग शुरू करें, इसके बाद 10 मिनट तक ठंडा किया जाए।
  10. 15 मिनट के लिए प्रोटीज III के 200 माइक्रोन में इनक्यूबेट एसजी।
  11. वैकल्पिक: इस प्रोटोकॉल के वर्ग 2.3, 2.4 और 2.8 के अनुसार ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए सूडान काले उपचार का प्रदर्शन करें यदि बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने की योजना बनाई गई है।
  12. एक कक्षीय शेखर पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन-20/पीबीएस 3x के 200 माइक्रोन में एसजी धोएं।
  13. वैकल्पिक: यदि कई जांच के साथ सह धुंधला वांछित है, पतला चैनल-2 (50x) और चैनल-3 जांच (50x) चैनल-1 जांच (1x) में ।
  14. ब्याज के जीन के लिए जांच के 100 माइक्रोन के साथ एसजी को कवर करें और मामूली आंदोलन के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। सभी इनक्यूबेशन चरणों के लिए 96-कुएं की प्लेट को गीले कक्ष में 40 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: एक एसजी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करें, एक जीवाणु जीन के खिलाफ जांच का उपयोग करके (उदाहरण के लिए, डाइहिड्रो-डिपिकोलिनेट रिडक्टेज, डीएपीबी)बाद के चरणों में प्रवर्धन रिएजेंट्स के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी की जांच करने के लिए।
  15. एक कक्षीय शेखर पर प्रत्येक 15 मिनट के लिए आपूर्ति की वाशिंग बफर 3x में एसजी धोएं ।
  16. पूर्व गर्म Amp1-3, एचआरपी-C1, और एचआरपी-ब्लॉकर आरटी के लिए । यदि चैनल-2 और/या चैनल-2 जांच के साथ सह-धुंधला वांछित है, तो पूर्व-गर्म एचआरपी-सी 2 और एचआरपी-सी 3 ।
  17. एक कक्षीय शेखर पर 4% पीएफए/पीएफबीएस में आरटी में 10 मिनट के लिए एसजी को फिर से ठीक करें ।
  18. आरटी में एक कक्षीय शेखर पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए आपूर्ति की गई वाशिंग बफर 3x के 200 माइक्रोन में एसजी धोएं।
  19. प्रवर्धन के लिए, एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए Amp1 के 100 माइक्रोन के साथ एसजी को इनक्यूबेट करें।
  20. ध्यान से किसी भी तरल को हटा दें और एक कक्षीय शेखर पर आरटी में प्रत्येक मिनट के लिए आपूर्ति की गई वाशिंग बफर 3x के 200 माइक्रोल में एसजी धोएं।
  21. एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए Amp2 के 100 माइक्रोन के साथ 100 माइक्रोन के साथ एसजी।
  22. दोहराएं चरण 3.18।
  23. एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए Amp3 के 100 माइक्रोन के साथ एसजी।
  24. दोहराएं चरण 3.18।
  25. एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आपूर्ति की गई मल्टीप्लेक्स FL v2 HRP-C1 के 100 माइक्रोल के साथ इनक्यूबेट एसजी।
  26. दोहराएं चरण 3.18।
  27. एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए आपूर्ति टीएसए-बफर और इनक्यूबेट एसजी के 200 माइक्रोल में ओपल-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 1:1,000 तैयार करें। इनक्यूबेशन के दौरान और इस कदम से प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  28. दोहराएं चरण 3.18।
  29. आपूर्ति की गई मल्टीप्लेक्स FL v2 HRP-अवरोधक के 100 माइक्रोल में एक कक्षीय शेखर पर 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट एसजी।
  30. दोहराएं चरण 3.18।
  31. वैकल्पिक: चैनल-2 जांच के साथ सह-धुंधला करने के लिए, आपूर्ति किए गए मल्टीप्लेक्स FL v2 HRP-C2 के साथ 3.25-3.30 कदम दोहराएं।
  32. वैकल्पिक: चैनल-3 जांच के साथ सह-धुंधला करने के लिए, आपूर्ति किए गए मल्टीप्लेक्स FL v2 HRP-C3 के साथ 3.25-3.30 कदम दोहराएं।
  33. बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला होने के मामले में, इस प्रोटोकॉल के चरण 2.13-2.25 करें।
  34. एक कक्षीय शेखर पर 30 मिनट के लिए 1% बीएसए/पीबीएस में इनक्यूबेट ।
  35. 1% बीएसए/पीबीएस में बिस्बेंजिमाइड H33342 trihydrochloride (Hoechst धुंधला) के 1 μg/mL में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट एसजी अगर परमाणु धुंधला वांछित है और/या एलेक्सा-युग्मित गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA, 1:500) एक ऑर्बिटल शेखर पर जोड़ें ।
  36. दोहराएं चरण 3.18।
  37. कदम 2.19-2.22 में वर्णित एम्बेड करें।

4. इमेजिंग और मुरीन स्टेलेट गैंगलिया का विश्लेषण

  1. स्थानीय इमेजिंग सुविधा में एम्बेडेड एसजी की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करें।
  2. यदि सेल आकार माप की आवश्यकता है, तो 200x आवर्धन पर टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए छवि एसजी दाग और हर एसजी से 4-6 यादृच्छिक छवियां लें।
  3. सेल आकार का अनुमान लगाने के लिए इमेजजे33 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, पेन टेबल के साथ, सामग्री की तालिकादेखें)। फ्री हैंड सेलेक्शनका उपयोग करें, प्रत्येक सेल को सर्कल करें और विश्लेषण | पर क्लिक करें सेल क्षेत्र प्राप्त करने का उपाय। एसजी के भीतर अच्छी तरह से स्थित केवल बरकरार, पूरी तरह से दिखाई देने वाली कोशिकाओं को शामिल करने के लिए सावधान रहें।
  4. इस विधि का उपयोग करना, एसजी प्रति लगभग 100 कोशिकाओं का माप करें।
  5. यदि आप विभिन्न चूहों से एसजी की तुलना करना चाहते हैं तो एक अंधे अन्वेषक चरण 4.2-4.3 प्रदर्शन करें। 34समूहों के बीच आकार के अंतर की कल्पना करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में आवृत्ति वितरण का उपयोग करें ।

5. मुरीन स्टेलेट गैंगलिया के आणविक विश्लेषण

नोट: अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर नियंत्रण शामिल करें। यह विभिन्न जीनोटाइप और रोग पृष्ठभूमि के साथ एसजी हो सकता है और/या अन्य स्वायत्त गैंगलिया, जैसे सहानुभूति बेहतर ग्रीवा गैंगलियन (गर्दन क्षेत्र में स्थित, ज़िगलर एट अल35)या पैरासिम्पेटिक गैंगलिया (जैसे इंट्राकार्डियाक गैंगलिया, जुजेन एट अलदेखें)में विस्तृत विवरण देखें।

  1. प्रति पशु फिनोल/ग्वानिडीन थियोसाइनेट समाधान (जैसे, Qiazol) के 500 μL के साथ एक 2 एमएल ट्यूब तैयार करें और तरल नाइट्रोजन शॉक-फ्रॉस्टिंग के लिए तैयार करें या आरएनए की सुरक्षा के लिए वाणिज्यिक समाधानों पर विचार करें (वैकल्पिक, सामग्री की तालिकादेखें)36। आरएनए अलगाव के लिए जल्दी से काम करते हैं।
  2. 1.1-1.13 चरणों में वर्णित एसजी का विच्छेदन करें।
  3. तुरंत दोनों एसजी को सीधे एक ट्यूब में फिनॉल/ग्वानिडीन थियोसाइनेट सॉल्यूशन और लिक्विड नाइट्रोजन में शॉक-फ्रॉस्ट ट्यूब के साथ विसर्जित करें ।
  4. आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. टिश्यू लाइसिस के लिए, एसजी के साथ ट्यूबों को तब तक गल जाने दें जब तक कि फिनानिडीन थिओसाइनेट समाधान द्रवित न हो जाए और दो 7 मिमी स्टेनलेस स्टील मोती जोड़ें। सूखी बर्फ और अपकेंद्रित्र पर टिश्यू होमोजेनाइजर (बॉल या मिक्सर मिल, जैसे, टिश्यू लाइजर II) के धातु भागों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब ताकि एसजी ट्यूब के नीचे हो।
  7. टिश्यू लिसर के धातु भागों में ट्यूब डालें और 20 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए lyse करें।
  8. जब तक कोई बरकरार ऊतक का पता नहीं चल जाता तब तक 5 बार चरण 5.6 और 5.7 दोहराएं।
  9. तरल को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित आरएनए आइसोलेशन किट (जैसे, miRNeasy मिनी किट) के साथ आरएनए अलगाव करें।
  11. आरएनएएस-मुक्त पानी के 20 माइक्रोन में एल्यूट आरएनए और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता को मापते हैं।
    नोट: जीनोमिक डीएनए के साथ शुद्ध आरएनए के प्रदूषण को बाहर करने के लिए, हम जीनोमिक प्राइमर के साथ एक पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया और टेम्पलेट के रूप में आरएनए के 1 μL प्रदर्शन का प्रस्ताव करते हैं, बजाय माइनस रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस नियंत्रण। इससे काफी मात्रा में आरएनए की बचत होगी। यदि आरएनए दूषित है, तो बाद में मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन के लिए एक्सॉन-ट्रोन बाउंड्री प्राइमर या इंट्रॉन फ्लैंकिंग प्राइमर का उपयोग करें।
  12. सीडीएनए संश्लेषण करने और स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए 250 एनजी एसजी आरएनए का उपयोग करें। यहां, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च क्षमता वाली सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग किया गया था।
  13. सीडीएनए के 2.5 एनजी/μL की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला और स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार उचित जांच के साथ मात्रात्मक वास्तविक समय बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं । यहां, TaqMan परख (सामग्री की तालिकादेखें) प्रतिक्रिया प्रति 10 एनजी सीडीएनए का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था ।
    नोट: झूठे सकारात्मक परिणामों को बाहर करने के लिए हर जीन के लिए नो-टेम्पलेट नियंत्रण करें।
  14. एसजी के विभिन्न समूहों के बीच सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए घर रखने वाले जीन (जैसे, Cdkn1b)पर रुचि के अपने जीन की जीन अभिव्यक्ति को सामान्य करें।

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Representative Results

चित्रा 1 एसजी की पहचान करने और विच्छेदन करने की कल्पना करता है। चित्रा 1A स्थान की एक योजनाबद्ध ड्राइंग दिखाता है, जबकि चित्रा 1B हृदय-फेफड़ों के पैकेज को हटाने के बाद छाती में दृश्य प्रस्तुत करता है। एसजी और रिब पिंजरे से बाएं और दाएं लोंगस कोली मांसपेशियों का मध्यीकरण अभिविन्यास के लिए महत्वपूर्ण स्थल हैं। विच्छेदन मांसपेशियों और पहली पसली के बीच बिंदीदार रेखाओं के साथ किया जाता है। एसजी और सहानुभूति श्रृंखला सफेद संरचनाओं(चित्रा 1C)के रूप में दिखाई देते हैं । चित्रा 1D बाएं लोंगस कोली मांसपेशी और पहली पसली के बीच क्षेत्र का आवर्धन दिखाता है, जहां बाएं एसजी स्थित है। एसजी की आकृति विज्ञान व्यक्तियों के बीच अलग है। इसमें अक्सर अवर सर्वाइकल का संलयन होता है और पहला तीसरा वक्ष गैंगलिया24. कुछ किस्म है कि प्रयोगकर्ता murine एसजी में उंमीद कर सकते है चित्रा 1E,एफ,जहां पांच पुरुष C57Bl6 जंगली प्रकार चूहों के बाएं और दाएं एसजी फोटो खिंचवाने में चित्रित किया गया है ।

सकल शारीरिक अवलोकन का मूल्यांकन, साथ ही एसजी इनरवेटिंग दिल में कोशिकाओं के सेलुलर और उपकोशिकीय विश्लेषण प्रोटीन और आरएनए स्तर पर पूरे माउंट तकनीकों द्वारा किया जा सकता है। एसजी का अवलोकन चित्र 2में प्रस्तुत किया गया है । Myocardial सहानुभूति फाइबर एसजी में सेल निकायों से उत्पन्न होते हैं। ये टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ धुंधला करके कल्पना कर रहे हैं। TH-एक्सप्रेसिंग न्यूरोनल सोमाता कोलीन एसिटिलट्रांसफेरेज (ChAT) के लिए सकारात्मक धुंधला तंत्रिका फाइबर से घिरा हुआ है। ये सबसे अधिक संभावना प्रेसिनैप्टिक फाइबर37,38हैं . टीएच और सीएचएटी सह-लेबलिंग से एक अनुकरणीय आवर्धन चित्र 2 एमें प्रस्तुत किया गया है । न्यूरोनल सेल निकायों के आसपास की ग्लियल कोशिकाओं को S100B के लिए धुंधला करके कल्पना की जा सकती है। यह तंत्रिका मार्कर PGP9.5 के साथ संयोजन में चित्रा 2B में चित्रित किया गया है। चित्रा 2C-F एक उपकोशिकीय स्तर पर एसजी का अध्ययन करने के लिए अनुकरणीय विश्लेषण दिखाता है, सीटू संकरण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट सह-धुंधला में पूरे माउंट का उपयोग कर रहा है। प्रोटीन TH(चित्रा 2C,लाल) और Tubb3 के mRNA अणुओं(चित्रा 2 डी,सफेद) बड़े न्यूरोनल सेल निकायों में व्यक्त कर रहे हैं, जबकि S100b के mRNA(चित्रा 2E,हरे) भी आसपास ग्लिया कोशिकाओं में पता लगाने योग्य है । मर्ज(चित्रा 2F)में, यह दिखाई देता है कि कुछ न्यूरॉन्स टीएच के लिए नकारात्मक हैं लेकिन टब 3व्यक्त करते हैं, जबकि S100b mRNAs आसपास की कोशिकाओं में भी पता लगाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2जीमें आवर्धन में दर्शाया गया है।

चित्रा 3 मुरीन एसजी का अध्ययन करने के लिए संभावित मात्रात्मक विश्लेषण और नुकसान प्रस्तुत करता है । TH-दाग एसजी(चित्रा 3A)से छवियां सेल आकार माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में मधुमेह के एक माउस मॉडल के लिए अनुकरणीय प्रदर्शन किया गया था । नियंत्रण से न्यूरोनल सोमता (डीबी/हेट) एसजी ३८८.८ ± १२३.८ माइक्रोन2 बनाम थे । डायबिटिक एसजी (डीबी/डीबी) 407.33 ± 139.6 माइक्रोन2 (चित्र 3बी,एन = 2 एसजी, 100 कोशिकाओं प्रति एसजी प्रति जीनोटाइप, पी = 0.348 में, डेटा की तुलना मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। चित्रा 3C एसजी (n = 6-7) के विभिन्न सेल प्रकारों से जीन की अभिव्यक्ति से पता चलता है । एक जानवर से दोनों एसजी की पूलिंग लगभग 24 परख (डुप्लिकेट में 12 जीन) के जीन अभिव्यक्ति माप की अनुमति देता है । हम आम तौर पर Cdkn1b के लिए नमूनों को सामान्य (२५.४ ± ०.९७) के सीटी मूल्यों पर पता चला) के साथ ही न्यूरोनल मार्कर Neun/Rbfox3 (३२.५ ± ०.७) अगर यह अंय सेल प्रकार और विच्छेदन की न्यूरोनल शुद्धता के लिए खाते के लिए आवश्यक है । जीन है कि हम एसजी में आणविक प्रक्रियाओं की विशेषता के लिए उपयोगी पाया सहानुभूति जीन वें (२२.४ ± १.६), चैट,जो कोलिनेर्जिक ट्रांसफर्जेशन (३०.८ ± १.३ के सीटी मूल्यों पर व्यक्त) और Gap43,न्यूरोनल अंकुरण के लिए एक मार्कर (२२.४ ± १.४ के सीटी मूल्यों पर पता लगाने योग्य) का संकेत हो सकता है शामिल हैं । गैर-न्यूरोनल सेल प्रकार में व्यक्त किए गए जीन में S100b (ग्लियल कोशिकाओं के लिए, 27.3 ± 1.2), की-67 (कोशिकाओं को प्रसारित करने के लिए, 33.0 ± 1.6) और सीडी 45 (प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए, 30.2 ± 1.1)।

एसजी कनेक्टिव टिश्यू26के कैप्सूल से घिरा हुआ है, जिसे हेमैटॉक्सीलिन और ई में ईओसिन स्टेनिंग के माध्यम से कल्पना की जातीहै। कभी-कभी, हमने एंटीबॉडी-आधारित धुंधला में विसंगतियों को देखा जैसा कि चित्र 3एफमें प्रदर्शित किया गया था, कैप्सूल को अधूरा हटाने के कारण सबसे अधिक संभावना है। जबकि ChAT और TH धुंधला केवल एसजी के कुछ भागों में पता लगाने योग्य हैं, DAPI के साथ नाभिक जवाबी दाग भर में पता लगाने योग्य हैं । विलय छवि में बिंदीदार रेखा असफल धुंधला (रेखा के बाएं) से सफल धुंधला (रेखा के दाएं) को अलग करती है।

डेटा मानक विचलन के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। सांख्यिकीय महत्व को <0.05 के पी मूल्य के रूप में परिभाषित किया गया था; सांख्यिकीय विश्लेषण वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया था।

Figure 1
चित्र 1:मुरीन स्टेलेट गैंगलिया का स्थान, विच्छेदन और आकृति विज्ञान। (ए)स्टेलेट गैंगलिया (एसजी) के स्थान का योजनाबद्ध ड्राइंग। (ख)हृदय-फेफड़ों के पैकेज को हटाने के बाद छाती में देखें । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एसजी अधिकांश समय तुरंत दिखाई नहीं देती है। लॉन्गस कोली मांसपेशियां रीढ़ की हड्डी से पार्श्व स्थित होती हैं। एसजी पहली पसली के साथ जंक्शन पर मांसपेशियों से पार्श्व स्थित हैं। गैंगलिया को उजागर करने के लिए मांसपेशियों (बिंदीदार रेखा द्वारा चिह्नित क्षेत्र) में पार्श्व को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें। विच्छेदन के बाद, गंगलिया (बाएं और दाएं, एलएसजी और आरएसजी, क्रमशः) और सहानुभूति श्रृंखला को सफेद, लंबी संरचनाओं के रूप में बनाया जा सकता है। (ग)गंगलिया और शारीरिक स्थलों को दिखाने वाला अनुकरणीय विच्छेदन । एलएसजीका आवर्धन। (ई)एलएसजी और(एफ)आरएसजी जंगली प्रकार से, पुरुष C57Bl6 चूहों (16 सप्ताह) विच्छेदन और आकृति विज्ञान और आकार में विविधताओं को दिखाने के लिए फोटो खिंचवाने थे । स्केल बार 1,000 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:मुरीन स्टेलेट गैंगलिया में विभिन्न सेल प्रकारों का दृश्य पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और सीटू संकरण के माध्यम से। (ए)सहानुभूति मार्कर टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) और कोलिन एसिटिलट्रांसफेरेज (ChAT) के लिए दाग एक मुरीन स्टेलेट गैंगलियन (एसजी) का सकल अवलोकन । आवर्धन टीएच-पॉजिटिव सेल निकायों और ChAT-पॉजिटिव, सबसे अधिक संभावना प्रेसिनैप्टिक, तंत्रिका फाइबर की उपस्थिति को दिखाता है जो न्यूरोनल सोमाता के आसपास हैं। (ख)ग्लियल कोशिकाओं को न्यूरोनल सेल निकायों को एनशेथिंग करना S100B के लिए धुंधला करके कल्पना की जा सकती है, यहां न्यूरोनल मार्कर पीजीपी 9.5 के संयोजन में। (C,D, E,F) एक एसजी से सूक्ष्म छवियों TH (लाल) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन के माध्यम से पूरे माउंट दाग और Tubb3 (डी, सफेद) और S100b (ई, हरे) के लिए सीटू संकरण में । नाभिक DAPI (नीला) के साथ जवाबी दाग रहे हैं । (च)मर्ज से पता चलता है कि सभी न्यूरोनल(Tubb3-पॉजिटिव)कोशिकाएं टीएच पॉजिटिव नहीं हैं । S100b mRNAs न्यूरोनल सोमाटा के भीतर पता लगाया जा सकता है, लेकिन यह भी आसपास की कोशिकाओं, के रूप में(जी)में आवर्धन में एक तीर द्वारा चिह्नित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: संभावित मात्रात्मक विश्लेषण और नुकसान. (A)इमेजेज का उपयोग करके सेल आकार मापन के लिए टायरोसिन-हाइड्रोक्सीलेज (टीएच) दाग वाले एसजी की छवियों का उपयोग किया जा सकता है। (ख)यह मधुमेह के एक माउस मॉडल में किया गया था (एसजी प्रति १०० कोशिकाओं, n = 2 एसजी प्रति जीनोटाइप, डेटा मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग कर तुलना की गई थी) । (ग)एसजी में व्यक्त किए गए अनुकरणीय जीन जो आणविक प्रक्रियाओं की विशेषता के लिए उपयोगी हो सकते हैं । Cdkn1b के साथ ही न्यूरोनल मार्कर Neun/Rbfox3 (अन्य सेल प्रकार की उपस्थिति के लिए खाते के लिए) सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज(टीएच)एक सहानुभूति मार्कर, कोलिन एसिटिलट्रांसफेरेज(चैट)के लिए कोलिनेर्जिक ट्रांस्फरेशन, न्यूरोनल स्प्राउटिंग के लिए गैप43 के रूप में कार्य करता है। गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों में व्यक्त किए गए जीन में S100b (ग्लियल कोशिकाएं), की-67 (कोशिकाओं का प्रसार) और सीडी 45 (प्रतिरक्षा कोशिकाएं) शामिल हैं। (घ)फॉर्मेलिन-फिक्स्ड एसजी का हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन धुंधला एसजी के शीर्ष पर कनेक्टिव टिश्यू और कोशिकाओं की कल्पना करता है ।(ई)बॉक्स्ड क्षेत्र से आवर्धन । (च)कुछ अवसरों पर, हम एंटीबॉडी आधारित धुंधला में विफलता मनाया, सबसे अधिक संभावना कैप्सूल के अधूरे हटाने के कारण । जबकि ChAT (लाल) और TH (हरे) धुंधला केवल एसजी के कुछ भागों में पता लगाने योग्य हैं, DAPI (गहरे नीले) के साथ नाभिक जवाबी रंग भर में पता लगाने योग्य हैं । विलय छवि में बिंदीदार रेखा असफल धुंधला (रेखा के बाएं) से सफल धुंधला (रेखा के दाएं) को अलग करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वीए की शुरुआत से पहले सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं में सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं की समझ उच्च रुचि है, क्योंकि अचानक हृदय की गिरफ्तारी दुनिया भर में मौत का सबसे आम कारण बनी हुई है5। इसलिए, वर्तमान पांडुलिपि में, हम इस नेटवर्क के भीतर एक मुरीन तत्व - मुरीन एसजी की पहचान करने के लिए तरीकों का एक बुनियादी प्रदर्शनों की सूची प्रदान करते हैं - और आरएनए, प्रोटीन और सेलुलर स्तर पर बाद में विश्लेषण करते हैं।

मुरीन एसजी की एक चुनौती इसका आकार और सीमित संख्या में कोशिकाएं39हैं . इस कारण, विभिन्न पशु मॉडल, जैसे चूहे40,कुत्ते22,और सूअर41 का उपयोग एसजी पर अध्ययन के लिए किया जाता है। फिर भी, चूहों में उपलब्ध कार्डियक फेनोटाइप के लिए विभिन्न प्रकार के सुस्थापित रोग मॉडल हैं और इनमें से कुछ को पहले से ही कार्डियक इनरवेशन और अतालता के विभिन्न पहलुओं में चिह्नित किया गया है, जैसे मधुमेह23के लिए मॉडल, मायोकार्डियल इन्फेक्शन42,या मायोकार्डाइटिस43। इसलिए, वीए के प्रकाश में स्वायत्त शिथिलता को और अधिक चित्रित करने के लिए मुरीन एसजी के आगे के अध्ययनों की आवश्यकता होती है। इन्हें मुरीन हृदय के इनरवेशन जैसे कार्यात्मकप्रयोगों 4,23,44 जैसे एसजी23के इन-वीवो उत्तेजना सहित अध्ययन करने के लिए अन्य दृष्टिकोणों द्वारा पूरा किया जा सकता है।

इसके छोटे आकार और वक्ष गुहा24के भीतर इसके स्थान के कारण, वीवो में मुरीन एसजी का हेरफेर चुनौतीपूर्ण है, हालांकि इसे सफलतापूर्वक23किया गया है। इस कारण से, कुछ अध्ययन इसलिए बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो गर्दन में अधिक सुलभ स्थित होते हैं, कैरोटिड विभाजन के पीछे सहानुभूति श्रृंखला में एसजी के ऊपर आंतरिक और बाहरी कैरोटिड धमनियों में24,35। बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया को हटाने के माध्यम से कार्डियक डिनेर्वेशन को मायोकार्डियल सूजन, हाइपरट्रॉफी और कार्डियक डिसफंक्शनकोकम करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया हृदय के विभिन्न क्षेत्रों में, सबसे प्रमुखता से पूर्वकाल पक्ष45। इसके अलावा, हाल ही में एक गहराई से साहित्य की समीक्षा इस निष्कर्ष पर पहुंची कि दिल के सहानुभूतिपूर्ण अंतर्वर्ण पर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया की भूमिका मनुष्यों में अस्पष्ट बनी हुई है46। यह हृदय सहानुभूति अंतर्मन के अध्ययन के लिए एसजी की विशेषता के महत्व पर प्रकाश डाला गया ।

यह ध्यान रखना जरूरी है कि दिल ही नहीं एसजी का एकमात्र लक्ष्य है। अन्य लोगों के अलावा, अग्रेपा48 में फेफड़े47 और पसीने की ग्रंथियां भी एसजी में उत्पन्न होने वाले फाइबर से इनरवेट किए जाते हैं, बाद में सहानुभूतिपूर्ण शरीर विज्ञान के अपवाद हैं क्योंकि वे कोलीन एसीटिलट्रांसफरेज37व्यक्त करते हैं। तीव्र फेफड़ों की चोट49 में भड़काऊ प्रक्रियाओं के संबंध में या गर्म फ्लश और नींद की शिथिलता50के उपचार के संबंध में एसजी की अस्थायी नाकेबंदी का अध्ययन किया जाता है । इसलिए, हाथ में प्रोटोकॉल इन क्षेत्रों में मशीनी सवालों के लिए एक प्रदर्शनों की सूची की पेशकश कर सकते हैं । कार्डियक रोग मॉडल पर ध्यान केंद्रित करते समय, परिणामों की व्याख्या के लिए इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कार्डियक न्यूरॉन्स को गैर-हृदय न्यूरॉन्स51से आकृति विज्ञान या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों से अलग नहीं किया जा सकता है। यह प्रतिगामी ट्रेसिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिससे दिल को प्रोजेक्ट करने वाले न्यूरॉन्स का स्थान एसजी52के क्रैनियो-मध्यीय भागों में स्थित दिखाया गया था।

इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स के अलावा, सहानुभूति गैंगलिया ग्लिया, तथाकथित उपग्रह ग्लियल कोशिकाओं या उपग्रह कोशिकाओं को ग्लियल मार्कर S100B53की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित करने से बना है। जबकि थोड़ा हृदय विकृतियों में इन कोशिकाओं की भूमिका के बारे में जाना जाता है, ग्लियल सक्रियण और ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) की अभिव्यक्ति अतालता18के साथ रोगियों से एसजी में वर्णित किया गया है ।

प्रस्तुत तरीकों के साथ कुछ नुकसान को ध्यान में रखा जाना चाहिए: हमने कुछ अवसरों पर एंटीबॉडी-आधारित धुंधला में विसंगतियों को देखा और परिकल्पना की कि एसजी को शामिल करने वाले कनेक्टिव ऊतक कैप्सूल को अधूरा हटाना गलती पर हो सकता है, क्योंकि उन्हें विभिन्न प्रकार के गैंगलिया26के बीच पारगम्यता में भिन्न होने के लिए वर्णित किया गया है। बारीक संदंश का उपयोग कर कैप्सूल के यांत्रिक हटाने का वर्णन चूहों के बेहतर सर्वाइकल गैंगलियन में पोस्टनेटल दिन 1028 तक किया गया है और वयस्क चूहे एसजी54, 55और चूहों56 के लिए साहित्य में desheathing का उल्लेख किया गया है। एसजी कैप्सूल को हटाने की उम्र28 वर्ष के बीच भिन्न हो सकती है और - आकार के अंतर के कारण - प्रजातियां। हमारे अनुभव में, ताजा विच्छेदन, ठीक संदंश का उपयोग करके जितना संभव हो उतना संयोजी ऊतक को हटाना और हाथ में प्रोटोकॉल में वर्णित पूरी तरह से पारीकरण, सफल धुंधला के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के बारे में, त्वरित काम और कुशल lysis आवश्यक हैं। एक जानवर से दोनों एसजीएस पूलिंग मज़बूती से 12 अलग जीन (जब डुप्लिकेट प्रदर्शन) के विश्लेषण के लिए अनुमति दी ।

हालांकि समारोह और एसजी के सकल शरीर रचना विज्ञान दशकों के लिए अब अध्ययन किया गया है और हर एक कार्डियोमायोसाइट सहानुभूति फाइबर४६द्वारा आंतरिक है, कई खुले सवाल रहते हैं । उदाहरण के लिए, यह स्पष्ट नहीं है, क्यों एसजी के सहानुभूति न्यूरॉन्स इस्कीमिक21 और गैर इस्कीमिक दिल की विफलता में एक कोलिनेर्गिक फेनोटाइप के लिए क्षणिक रूप से स्थानांतरित, पशु मॉडल में और साथ ही रोगियों में20। हाल ही में, हमारे समूह ने कार्डियक तंत्रिका तंत्र29में तंत्रिका अंकुरण पर S100B-सकारात्मक ग्लियल कोशिकाओं की भूमिका का वर्णन किया, जो मुरीन एसजी में भी मौजूद हैं। वीए11, 12से जुड़े चोट के बाद सहानुभूतिपूर्ण तंत्रिका अंकुरण के लिए ये कोशिकाएं प्रासंगिक हैंया नहीं,भविष्य के अध्ययनों में स्पष्ट किए जाने की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण बात, ऑप्टोजेनेटिक्स52 और ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण36 जैसे अभिनव दृष्टिकोण सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की समझ और हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर इसकी भूमिका को गहरा करने के लिए न्यूरोनल ट्रेसिंग जैसे स्थापित तरीकों को पूरक कर सकते हैं।

अंत में, यह प्रदर्शनों की सूची अनुभवहीन अन्वेषक को कार्डियक विकृतियों के मुरीन मॉडल में एसजी का एक बुनियादी लक्षण वर्णन करने की अनुमति देती है। हमें उम्मीद है कि यह उपन्यास विधियों के उपयोग, संयोजन और निर्माण को प्रोत्साहित करेगा। यह सहानुभूति न्यूरॉन्स में अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं की समझ को बढ़ाने में मदद कर सकता है जो वीए की शुरुआत और रखरखाव के लिए जिम्मेदार हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हार्टविग विबेबिल्ट और यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर हैम्बर्ग-एपेंडोर्फ के यूकेई माइक्रोस्कोपी इमेजिंग फैसिलिटी (उमिफ) को माइक्रोस्कोप और समर्थन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस शोध को डीजेडके (जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च) [एफकेजेड 81Z4710141] द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

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References

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चिकित्सा अंक 166 सहानुभूति तंत्रिका तंत्र स्टेलेट गैंगलिया इंट्राकार्डिएक स्वायत्त तंत्रिका तंत्र वेंट्रिकुलर अतालता न्यूरोमॉर्फियोलॉजी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
स्थान, विच्छेदन, और मुरीन स्टेलेट गैंगलियन का विश्लेषण
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Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

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