Summary
心臓自律神経系、特に交感神経の神経系における病態生理学的変化は、心室性不整脈の発症および維持に寄与する。本プロトコルでは、マウスの星状神経節を特徴付け、基礎となる分子および細胞プロセスの理解を深める方法を示す。
Abstract
自律神経系は心臓電気生理学の実質的な原動力である。特にその交感神経枝の役割は、心室性不整脈(VA)の病態生理学における継続的な調査の問題である。星状神経節(SG)のニューロン は、交感神経鎖の両側の星形構造であり 、交感神経系の重要な要素です。SGは、治療難治性VA患者における心交感神経変性による治療のための認識された標的である。SGにおける神経細胞リモデリングおよびグリア活性化はVA患者に記載されているが、不整脈の発症に先立つ可能性のある基礎となる細胞および分子プロセスは十分に理解されておらず、自律神経変調を改善するために解明されるべきである。マウスモデルは交感神経リモデリングを研究することができますが、マウスSGの同定は経験の浅い研究者にとって困難です。したがって、マウスSGの詳細な細胞および分子生物学的研究は、多くの一般的な心疾患に欠けている。ここでは、RNAレベル(遺伝子発現解析のためのRNA単離、その際のハイブリダイゼーション)、タンパク質レベル(免疫蛍光全体実装染色)、および細胞レベル(基本的形態、細胞サイズ測定)での分析のために成体マウスのSGを解剖および研究するための基本的なレパートリーについて説明します。調製技術の課題を克服するための潜在的な解決策と、自己蛍光の消光による染色の改善方法を提示します。これにより、細胞組成およびリモデリングプロセスを決定するために、確立されたマーカーを介して神経細胞とグリア細胞を可視化することができます。ここで示す方法は、VAになりやすいマウスの自律神経機能不全に関するさらなる情報を得るためにSGを特徴付けることを可能にし、心臓の自律神経系の神経およびグリア成分を調査する追加の技術によって補完することができる。
Introduction
心臓自律神経系は、交感神経、副交感神経、感覚成分の緊密に調整された平衡であり、心臓が適切な生理学的応答を有する環境変化に適応することを可能にする1,2。この平衡における障害は、例えば、交感神経活動の増加、心室性不整脈(VA)3、4の維持と同様に発症の重要な促進要因として確立されている。従って、自律的変調は、β遮断薬による交感神経活性の薬理学的減少を通じて達成され、数十年5、6年のVA患者の治療の基礎となっている。しかし、薬理学的およびカテーテルベースの介入にもかかわらず、関連する数の患者はまだ再発VA7に苦しんでいる。
心臓への交感神経入力は、主に星状神経節(SG)の神経細胞体を介して媒介され、交感神経鎖の両側の星形構造は、脳幹から心臓8、9、10に多数の胸腔内神経を介して情報を中継する。傷害後にSGから発芽した神経はVAと突然心死11、12に関連し、自律変調13、14の標的としてSGを強調する。心臓への交感神経入力の減少は、局所麻酔薬の経皮的注入を介して一時的に、またはビデオ支援胸腔鏡15、16を介してSGの部分的除去によって永久に達成することができる。心臓交感神経脱用は、有望な結果を有する治療難治性VA患者のためのオプションを提示する14,16,17.我々は、神経および神経化学的リモデリング、神経炎症およびグリア活性化が自律神経機能障害18、18を寄与または悪化させる可能性のある交感神経リモデリングの特徴であることを、これらの患者の植え付けられたSGから学んだ。それでも、これらのニューロンにおける基礎となる細胞および分子プロセスは、現在まで不明瞭なままであり、例えば、コリン作動性表現型20,21へのニューロントランス分化の役割。実験研究は、VAを治療するための新しいアプローチを提示し、例えば、光遺伝学22を介した交感神経活性の減少であるが、SGの詳細な特徴付けは、VAと手をつないで行く多くの心臓病理に依然として欠けている。これらの病理を模倣するマウスモデルは、潜在的に不整脈12、23の発症に先行する神経リモデリングを研究することを可能にする。これらは、心臓および神経系の自律神経特性解析のための更なる形態学的および機能的分析によって完了することができる。本プロトコルでは、VAの理解を深めるためにマウスSGを解剖し特徴付けできる方法の基本的なレパートリーを提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物に関するすべての手順は、ハンブルク州動物管理使用委員会(ORG870、959)およびノルトライン・ヴェストファーレン州自然環境消費者保護庁(LANUV、07/11)によって承認され、国立衛生研究所の動物のケアと使用ガイド(2011)に準拠しました。研究は、糖尿病自発的突然変異(Lepr db;;)の男性と女性(10-24週齢)C57BL/6マウス(ストック数000664、ジャクソン研究所)およびマウスホモ接合体(db/db)またはヘテロ接合(db/het;コントロール)を用いて行われた。BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb /J、ストック番号000642、ジャクソン研究所)。著者らは、60週まで齢のマウスにバリエーションを持たないプロトコルを手元で使用してきた。
1. ネズミ星状神経節の位置と解剖
注:記述と図面は、主に大きな種で利用可能であるにもかかわらず、いくつかの出版物は、それぞれ解剖学的方法と蛍光レポーターラインを使用して、ラット24 とマウス25 のSGの位置を以前に説明しました。
- 50 mL の氷冷(3-4 °C)ヘパリン化(20単位/mL、 材料表を参照)を準備します。室温(RT)でSGの解剖を行う。
- 機関および地域のガイドラインに従って3%-5%のイオブルランを吸入することによってマウスを深く麻酔する。ペダル離脱反射の損失により、適切な麻酔を確認します。マウスの首を切るか、子宮頸部脱臼を行う。
注意:誤った頸部脱臼は、脊椎の破損および胸部血管の損傷を引き起こし、交感神経鎖の調製または切断を妨げる出血につながるため、SGが正しい位置に置かれていない。したがって、経験豊富な人員が子宮頸部脱臼を行ったり、深い堆積物で動物を切断することが重要です。 - 皮膚にエタノールをスプレーし、マヨハサミと狭いパターン鉗子を使用して前軸線に沿って2つの切開で胸郭を開きます。ダイヤフラムを切り、胸部の前面を取り外します。
- ロンドンの鉗子を使用して横隔膜のすぐ上に大大静脈と大静脈をつかんで、ストラビスムスハサミで下の背骨に近いすべての血管と結合組織を切断することによって、心臓肺パッケージを取り除きます。
- 血液のすべての痕跡が取り除かれるまで、プラスチック製の使い捨てピペットを使用してヘパリン化されたPBSで胸郭を徹底的に洗い流します。
- 胴体を実体顕微鏡下で準備双眼鏡の下に置き、外部光源で胸郭に良好な照明を確保します。
- 最初の肋骨と長いコリの筋肉を見つけます。
注:SGは、第1肋骨と脊椎の間の分岐部の脊椎に対して、長い背筋24に横に溝に両側に両側に配置される。SGの平らな側面は、長いコリの筋肉に隣接して配置されています。準備によっては、交感神経鎖の一部は、脊椎に平行な白い斜めの繊維としてすでに見える場合があります。これらはSGに沿ってトレースすることができます。 - デュモン#5/45鉗子の先端をそっと使用して、結合組織を長いコリ筋に横に露出させる。
- 鉗子を180°回し、平らな側面を使用してSGをつかみ、最小限の圧力でそれを引き出します。
- 2 番目の SG で繰り返します。
- 冷たいPBSで満たされた皿(直径6cm)に両方のSGを入れ、適切な倍率で検査します。必要に応じて、余分な血管、脂肪組織、および大きな神経を除去します。
注:自律神経節は、コラーゲン繊維と線維芽細胞26、27からなる結合組織カプセルに囲まれています。これらのカプセルの透過性は、種によって異なるようです, 異なる種類の神経節26と年齢28.デュモン#5/45鉗子を使用してできるだけ多くの結合組織を取り除き、必要に応じてスプリングハサミを取り除きます。 - 実験の目的に応じて、このプロトコルのセクション 2、3、または 5 に進みます。
2. 全体マウント免疫検査プロトコル
注:このプロトコルは、心臓全体のマウント染色4、29から適応されています。96ウェルプレートの1つのウェル内のすべての単一のSGに対してインキュベーションステップを実行し、100 μL(抗体含有溶液用)~200 μL(他のすべてのソリューション)を使用して、完全なカバレッジを確保します。定期的に双眼鏡でSGのカバレッジと正しい浸漬を確認してください。200 μL チップの上に 10 μL のチップを追加して、200 μL ピペットを使用して手動で液体を取り除きます。これはピペット先端のSGの吸引を防ぐ。細菌の増殖を防ぐために、新しく調製した溶液と滅菌液を使用してください。
- 4%メタノールフリーパラホルムアルデヒド(PFA)/PBSでRTで2時間のSGを修正します。
- SGはできるだけ早く処理しますが、この時点で0.02%(w/v)のアジドナトリウムでPBSの4〜6°Cで2〜4週間保存することができます。
- 自家蛍光の低減と背景比30の信号の改善のためのスーダンブラックストック溶液(1%スーダンブラックw/v100%エタノール中の1/v)を準備する。RTで磁気攪拌機で2〜3時間溶解します。
注:最大6〜8週間のストックソリューションを使用し、堆積物が現れたときに破棄してください。 - 残骸を取り除き、70%のエタノールでストックを0.25%スーダンブラックの最終濃度に希釈するために、フルスピード(13,000 x g)で30分間ストック溶液を遠心してスーダンの黒作業溶液を調製します。
- SGをデントの漂白剤で治療し、抗体透過性31を改善する。メタノール(MeOH)、過酸化水素溶液30%(w/w)をH2Oで、ジメチルスルホキシド(DMSO)を4:1:1の割合で混合して、デントの漂白剤を作り上げます。SGあたり200μLを加え、RTで1時間軌道シェーカーにプレートを置きます。
- 軌道シェーカー上でそれぞれ10分間インキュベートして水分補給用の降順MeOHシリーズを実行します:100%MeOH、75%MeOH/PBS、50%MeOH/PBS、25%MeOH/ PBS。
- SGをそれぞれ60分間2回インキュベートして、RTでPBS/1%トリトンX-100でパーメバライゼーションを行います。
- SGからパーメアビライズ溶液を除去し、スーダンの黒作業ソリューションを追加します。軌道シェーカーのRTで2時間インキュベートする。
- その間、PBSに5%の受容体グレードのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100を15mLの容器に加えてブロッキング溶液を調製し、ローラーシェーカーに約5〜10分間溶解させます。デスキャンは、破片を除去するために、プレプリーツ紙のフィルターを通して。
- プレートを傾け、慎重に直立側からピペットリングすることにより、非常に慎重にスーダンブラックを除去します。
注:スーダンブラックのSGを見ることは不可能です。強い光源を使用し、ゆっくりと動作します。このステップから、SGは黒く染まって視認性を高める。この時点でSGを取り囲む追加の結合組織が見られる場合は、Dumont #5/45鉗子とスプリングハサミを使用して取り外します。 - PBS/0.1% Triton-X-100 (PBS-T) を 200 μL 加え、軌道シェーカーの RT で 5 分間洗浄します。
- ピペットでPBS-Tを吸引して取り出し、2回繰り返します。
- PBS を削除します。200 μLのブロッキング溶液を加え、軌道シェーカーで一晩4°Cでインキュベートします。
- 翌日、ブロッキング溶液に一次抗体を添加して溶液を調製する。確立されたプロトコルから抗体濃度を適応させます。
注:一次抗体のない抗体コントロールとして1つのSGを含める(抗原事前吸収抗体またはIgG、可能な場合、またはブロッキングバッファーでインキュベート)。 - 軌道シェーカー上で4°Cで36-48時間の一次抗体インキュベーションを行います。交感神経の細胞サイズ測定と染色については、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を使用してください(抗体 推奨については、材料表 を参照)。
注:96ウェルプレートを湿ったチャンバー(例えば、ddH2O-wetted ペーパータオルが並ぶプラスチック製の箱)に置き、この時点で蒸発を防ぎます。 - 抗体溶液を慎重に除去し、200 μLのPBS-Tを添加します。プレートを軌道シェーカーの上に30分間置きます。
- PBS-Tを取り除き、洗浄工程を5回繰り返す。
- 使用前に蛍光Alexa標識二次抗体を1分間全速力(13,000 x g)で遠心分離して二次抗体の働き溶液を調製します。一次抗体1:500に従って適切な二次抗体をブロッキング溶液で希釈し、核染色が望ましい場合はビスベンジミドH33342トリ塩酸塩(Hoechst染色)の1μg/mLを加えてSGに加えます。軌道シェーカー上の4°Cで12-24時間インキュベート。
- 抗体溶液を慎重に取り除き、200 μLのPBS-Tを加えます。プレートを軌道シェーカーの上に30分間置きます。
- PBS-Tを取り除き、洗浄工程を5回繰り返す。最後のステップでは、トリトンなしでPBSを使用します。
- 埋め込み用には、50~100μLの蛍光実装媒体( 材料表を参照)をガラススライドに広げ、準備双眼鏡の下に置きます。デュモン#5/45鉗子を使用して、96ウェルプレートからSGを拾い、フィルターペーパー(例えばWhatman乾燥パッド)に一方の端を浸して余分な液体を取り除き、ドロップに置きます。
- デュモン#5/45鉗子を使用して、適切な倍率で位置を修正します。
- SGの横にガラスカバースリップ(20mm x 20mm)をそっと置き、ゆっくりと下降します。
注:あまりにも多くの取り付け媒体を使用すると、SGの動きや神経の絡み合いが発生します。その場合は、カバースリップを素早く取り外し、手順2.9~2.21を繰り返します。 - スライドをRTで一晩暗闇の中で乾燥させましょう。染色された標本の貯蔵は4°Cで少なくとも4〜6週間可能である。
3. その場合の全体マウント
注:SGのインシチュハイブリダイゼーションにおける全マウントは、コルチ32 の器官およびその中での市販のRNA蛍光をそのプロトコルで適応させた( 材料表を参照)。対象となる遺伝子のプローブと、サプライヤーからバッファーとソリューションを入手します。すべてのインキュベーションステップは、他に記載されていない場合は、RTで行われます。滅菌PBSを使用してください。複数のSGを1つの井戸で染色することに興味がある場合は、少なくとも150 μLのバッファーとソリューションを使用してください。
- ステップ 1.1 から 1.13 で説明されているように SG の解剖を行います。
- 軌道シェーカーに配置された96ウェルプレートの1つの井戸に4%MeOHフリーPFA /PBSの200 μLの1時間のSGを固定する。
- 軌道シェーカーで0.1%Tween-20/PBSでそれぞれ30分間SGを3回洗浄します。
- MeOH/PBSシリーズでは、その後50%MeOH/PBS、70%MeOH/PBS、100%MeOHで軌道シェーカーでそれぞれ10分間脱水します。
- SGを-20°Cで一晩100%MeOHで保管してください。
- 翌日、インキュベーターを40°Cに予温する。 温度計で温度を確認してください。
- 逆MeOH/PBSシリーズ(100%MeOH、70%MeOH/PBS、50%MeOH/PBS)でSGを10分間水分補給します。
- PBSでSGを5分間3回洗います。
- その間、40°Cで10分間インキュベーションしてプローブを事前に温め、続いて10分間冷却します。
- プロテアーゼIIIの200 μLでSGを15分間インキュベートします。
- オプション: その後の免疫蛍光染色が計画されている場合、このプロトコルのセクション2.3、2.4、および2.8に従って自己蛍光を急いでスーダンの黒い治療を行います。
- 軌道シェーカー上でそれぞれ5分間、0.1%Tween-20/PBS 3xの200 μLでSGを洗浄します。
- オプション:複数のプローブでの共染色が望ましい場合は、チャネル-1プローブ(1x)でチャネル-2(50x)およびチャネル3プローブ(50x)を希釈します。
- 関心のある遺伝子のプローブを100 μLでカバーし、わずか撹拌で40°Cで一晩インキュベートします。96ウェルプレートを40°Cの湿ったチャンバーに入れて、すべてのインキュベーションステップにします。
注:陰性対照として1つのSGを含み、細菌遺伝子に対するプローブ(例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクタ ーゼ、Dapb)を用いて、後のステップで増幅試薬の非特異的結合をチェックする。 - SGを供給された洗浄バッファー3xで、それぞれ15分間、軌道シェーカー上で洗浄する。
- 事前暖かいアンプ1-3、HRP-C1、およびHRP遮断器からRTへ。チャネル2および/またはチャネル2プローブとの共同染色が望ましい場合は、事前ウォームHRP-C2およびHRP-C3。
- 軌道シェーカー上の4%PFA /PBSでRTで10分間SGを再固定します。
- RTの軌道シェーカー上で5分間、供給された洗浄バッファー3xの200 μLでSGを洗浄します。
- 増幅のために、軌道シェーカー上の40°Cで35分間、Amp1の100 μLでSGをインキュベートします。
- 液体を慎重に取り除き、200 μLのSGを供給された洗浄バッファー3xで、それぞれRTで軌道シェーカーで5分間洗浄します。
- 軌道シェーカー上の40°Cで35分間、Amp2の100 μLでSGをインキュベートします。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- 軌道シェーカー上の40°Cで20分間、Amp3の100 μLでSGをインキュベートします。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- 100 μL の SG を、オービタル シェーカー上の 40 °C で 20 分間、供給されたマルチプレックス FL v2 HRP-C1 をインキュベートします。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- オパール共役二次抗体を200 μLで1:1000で調製し、軌道シェーカー上で40°Cで35分間SGをインキュベートします。インキュベーション中およびこのステップから光から保護します。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- 100 μL のインキュベート SG は、軌道シェーカー上の 40 °C で 15 分間、マルチプレックス FL v2 HRP ブロッカーを供給しました。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- オプション: チャネル 2 プローブとの共同染色の場合、マルチプレックス FL v2 HRP-C2 を使用してステップ 3.25~3.30 を繰り返します。
- オプション: チャネル 3 プローブとの共同染色の場合、指定されたマルチプレックス FL v2 HRP-C3 を使用してステップ 3.25~3.30 を繰り返します。
- その後の免疫蛍光染色の場合は、このプロトコルのステップ2.13~2.25を実行します。
- 軌道シェーカーで30分間、BSA/PBSを1%インキュベートします。
- ビスベンジミドH33342トリヒドロクロリド(Hoechst染色)の1μg/mLで30分間インキュベートSGを1%BSA/PBSで1%BSA/PBSでインキュベートSGは、核染色が望ましい場合はBSA/PBSで、またはアレクサ結合小麦胚アガグルチニン(WGA、1:500)を軌道シェーカーに加える。
- ステップ 3.18 を繰り返します。
- ステップ 2.19-2.22 の説明に従って埋め込みます。
4. ネズミ星状神経節のイメージングと分析
- 局所画像化設備での埋め込みSGの共焦点顕微鏡を行う。
- 細胞サイズ測定が必要な場合、200倍倍のチロシンヒドロキシラーゼ( 材料表参照)に染色された画像SGは、各SGから4〜6枚のランダム画像を撮影します。
- ImageJ33 ソフトウェアを使用して画像を分析して、セルサイズを推定します (例えば、ペンテーブルを使用して、 材料表を参照してください)。 自由手選択を使用して、各セルを丸で囲み、 分析|セル 領域を取得する測定。SG 内に十分に位置する完全に見えるセルのみを含めるには注意してください。
- この方法を用いて、SG当たり約100個の細胞の測定を行う。
- 異なるマウスのSGを比較する場合は、目が見えない研究者にステップ4.2-4.3を実行してもらいます。統計ソフトウェアで頻度分布を使用して、グループ34間のサイズの差を視覚化します。
5. ネズミ星状神経節の分子解析
注: 実験計画に応じてコントロールを含めます。これは、異なる遺伝子型および疾患の背景および/または他の自律神経節を有するSGであり得る、例えば交感神経性の上頸神経節(首の領域に位置し、Zieglerら.35の詳細な説明を参照)または副交感神経節(例えば、心臓内神経節、Jungenらを参照)。
- 動物1匹あたり500μLのフェノール/グアニジンチオシアネート溶液(例えば、Qiazol)を用いた2mLチューブを調製し、液体窒素をショックフロスティングの準備ができているか、RNAの保護のための市販の溶液を検討する(オプション、 材料表を参照)36。RNAの単離のために迅速に働く。
- ステップ 1.1 から 1.13 で説明されているように SG の解剖を行います。
- すぐに液体窒素にフェノール/グアニジンチオシアネート溶液とショックフロストチューブと一つのチューブに直接両方のSGを浸します。
- さらに処理されるまで-80°Cで保管してください。
- 組織溶解の場合、フェノール/グアニジンチオシアネート溶液が液化されるまでSGでチューブを解凍させ、2つの7mmステンレスビーズを加えます。乾燥氷と遠心分離機の上で組織ホモジナイザー(ボールまたはミキサーミルII)の金属部分を冷却し、遠心分離機を4°Cで冷却します。
- 遠心管は、SGがチューブの底にあるように、4°Cで1分間500 x g でチューブ。
- 20 Hzで1分間、ティッシュライザーの金属部分にチューブを入れ、溶地を入れます。
- 無傷の組織が検出されるまで、ステップ5.6と5.7を5回まで繰り返します。
- 液体を1.5mLの新鮮なチューブに移します。
- メーカーの指示に従ってカラムベースのRNA分離キット(例えば、miRNeasyミニキット)でRNAの単離を行います。
- 20 μLのRNaseフリー水でRNAを溶出し、分光光度計を用いて濃度を測定します。
注:精製したRNAのゲノムDNAによる汚染を排除するために、ゲノムプライマーと1μLのRNAをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応を行い、代わりに逆転写酵素制御を差し引いたものを提案します。これにより、かなりの量のRNAが節約されます。RNAが汚染されている場合は、エキソンイントロン境界プライマーまたはイントロン隣接プライマーを使用して、その後の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行います。 - 250 ng SG RNA を使用して cDNA 合成を行い、確立されたプロトコルを使用します。ここでは、メーカーの指示に従って大容量cDNA逆転写キットを使用しました。
- cDNAの2.5 ng/μLの最終濃度に希釈し、確立されたプロトコルに従って適切なプローブで定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行います。ここで、TaqManアッセイ( 材料表を参照)は、反応あたり10ng cDNAを用いて行った。
注: すべての遺伝子に対してテンプレートなしのコントロールを実行して、誤検知結果を除外します。 - 家のキーピング遺伝子(例えば 、Cdkn1b)に関心のある遺伝子の遺伝子発現を正規化し、SGの異なるグループ間の相対的な遺伝子発現を比較する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1は、SG を識別して解剖する方法を視覚化します。 左右の長角のコリ筋肉はSGとリブケージから内側に入る方向の重要なランドマークです。解剖は、筋肉と最初の肋骨の間の点線に沿って行われる。SGと交感神経鎖は白い構造として見えるようになります(図1C)。図1Dは、左の長いコリ筋と第1肋骨との間の領域の拡大率を示し、左SGが位置する。SGの形態は個人によって異なる。それはしばしば、下頸部と第3胸部神経節24への第1の融合から成る。実験者がマウスSGで期待できるいくつかの種類は、5匹の雄C57Bl6野生型マウスの左右SGが撮影されている図1E,Fに描かれている。
総解剖学的概観の評価、ならびに心臓を内面化するSG内の細胞の細胞および細胞内分析は、タンパク質およびRNAレベルの全体のマウント技術によって行うことができる。SG の概要を図 2に示します。心筋交感神経線維はSG中の細胞体に由来する。これらはチロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する抗体で染色することによって可視化される。TH発現神経ソマタは、コリンアセチルトランスビセラーゼ(ChAT)に陽性染色神経線維に囲まれています。これらは、最も可能性の高いシナプス前繊維37、38です。TH と ChAT の共同ラベル付けの例示的な倍率を図 2Aに示します。神経細胞の細胞体を取り囲むグリア細胞は、S100Bの染色によって可視化することができる。これを神経マーカーPGP9.5と組み合わせて図2Bに示す。図2C-Fは、SGを細胞内レベルで研究するための例示的な分析を示し、その場合の全実装をその場所でハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光共染色に使用した。タンパク質TH(図2C、赤色)およびTubb3のmRNA分子(図2D、白)は大きな神経細胞体で発現し、一方、S100bのmRNA(図2E、緑色)は周囲グリア細胞でも検出可能である。マージ(図2F)では、いくつかのニューロンがTHに対して陰性であるが、Tubb3を発現することは明るく、S100b mRNAは、図2Gの倍率に示すように、周囲の細胞でも検出することができる。
図3は、マウスSGを研究するための潜在的な定量的分析と落とし穴を示し、TH染色SG(図3A)からの画像は、糖尿病のマウスモデルの例示的に行われたように細胞サイズ測定に使用することができる。制御からの神経細胞ソマタ(db/het)SGは、糖尿病SG(db/db)407.33±139.6 μm2で388.8±123.8μm2であった(図3B、n=2SG、100細胞あたりSG1遺伝子型、P= 0.348、データを比較した。図3Cは、SGの異なる細胞型由来の遺伝子の発現を示す(n=6-7)。1匹の動物から両方のSGをプールすることで、約24のアッセイ(重複遺伝子中の12個の遺伝子)の遺伝子発現測定が可能になる。我々は通常、他の細胞タイプおよび解剖のニューロン純度を考慮する必要がある場合、Cdkn1b(Ct値25.4±0.97で検出された)とニューロンマーカーNeun/Rbfox3(32.5±0.7)のサンプルを正規化する。 SGの分子プロセスを特徴付けるのに有用であるとわかった遺伝子には、交感神経遺伝子Th(22.4±1.6)、コリン作動性トランスファクション(Ct値30.8±1.3で発現)を示す可能性のあるChat、ニューロンスプラウトのマーカーであるGap43(Ct値22.4±1.4で検出可能)が含まれる。非神経細胞型で発現される遺伝子には、S100b(グリア細胞の場合、27.3±1.2)、Ki-67(増殖細胞用、33.0±1.6)、Cd45(免疫細胞の場合は30.2±1.1)が含まれる。
SGは、結合組織26のカプセルに囲まれ、図3D、Eのヘマトキシリンおよびエオシン染色を介して可視化される。時折、我々は、カプセルの不完全な除去のために、図3Fに示されるように、抗体ベースの染色における矛盾を観察した。ChATおよびTH染色はSGの一部でのみ検出可能であるが、DAPIで染色された核カウンターは全体を通して検出可能である。マージされた画像の点線は、正常な染色(ラインの右側)と失敗した染色(ラインの左側)を分離します。
データは標準偏差±平均として表示されます。統計的有意性はP値<0.05と定義されました。統計分析は、商用ソフトウェアを使用して行われました。
図1:マウス星状神経節の位置、解剖、形態の図(A)星状神経節(SG)の位置の概略図。(B)心臓肺パッケージの取り外し後の胸郭を見る。ほとんどの場合、SGがすぐには見えないことに注意することが重要です。長い背筋は背骨から横に位置する。SGは最初の肋骨との接合部の筋肉から横に位置する。慎重に筋肉に横線(点線でマークされた領域)を解剖して、神経節を明らかにする。解剖後、神経節(左右、LSGおよびRSG)および交感神経鎖は白く、長い構造として作ることができる。(C) 神経節と解剖学的ランドマークを示す例示的解剖。(D) LSGの拡大率。(E)LSGおよび(F)野生型からのRSG、雄C57Bl6マウス(16週)を解剖し、形態およびサイズの変動を示すために撮影した。スケールバーは1,000 μmを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスステラート神経節の異なる細胞型の可視化(免疫組織化学全体とその後ハイブリダイゼーション)(A)交感マーカーチロシンヒドロキシラーゼ(TH)とコリンアセチルトランスファーゼ(ChAT)に染色されたマウス星状神経節(SG)の総概要。この倍率は、TH陽性細胞体と、神経ソマタを取り巻くChAT陽性、シナプス前の神経線維の存在を示す。(B)神経細胞体を包み込むグリア細胞は、ここでニューロンマーカーPGP9.5と組み合わせてS100Bの染色によって可視化することができる。(C, D, E,F)1つのSGからの顕微鏡画像は、TH(赤)のための免疫体化学とTubb3(D、白)およびS100b(E、緑)のその場合のハイブリダイゼーションの組み合わせを介して全体のマウントを染色した。核はDAPI(青)でカウンターです。(F)結合は、すべてのニューロン(Tubb3-陽性)細胞がTH陽性ではないことを示している。S100b mRNAは、ニューロンソマトン内だけでなく、周囲の細胞の中でも検出することができ、(G)の倍率の矢印でマークされている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 潜在的な定量的分析と落とし穴(A)チロシン-ヒドロキシラーゼ(TH)染色SGからの画像は、ImageJを用いた細胞サイズ測定に使用することができる。(B)これは、糖尿病のマウスモデル(SG当たり100細胞、遺伝子型あたりn=2SG、マン・ホイットニー検定を用いて比較した)で行った。(C) SGで発現する例示的な遺伝子は、分子プロセスの特性化に有用である可能性がある。Cdkn1bと神経マーカー Neun/Rbfox3(他の細胞型の存在を考慮して)は正規化に使用することができます。チロシンヒドロキシラーゼ(Th)は交感神経マーカーとして機能し、コリンアセチルトランスフェクターゼ(Chat)はコリン作動性トランスファノファクション、Gap43はニューロン発芽に対して機能する。非神経細胞型で発現する遺伝子には、S100b(グリア細胞)、Ki-67(増殖細胞)、Cd45(免疫細胞)が含まれる。(D) ホルマリン固定SGのヘマトキシリンおよびエオシン染色は、SGの上に結合組織および細胞を可視化する。(F) いくつかの機会に、我々は、抗体ベースの染色で障害を観察しました, ほとんどの場合、不完全なカプセルの除去に起因する.ChAT(赤)およびTH(緑色)染色はSGの一部の部分でのみ検出可能ですが、DAPI(ダークブルー)で染色された核カウンターは全体を通して検出可能です。マージされた画像の点線は、正常な染色(ラインの右側)と失敗した染色(ラインの左側)を分離します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
突然の心停止が世界的に最も一般的な死因であり続けるため、VAの発症に先立つ交感神経系のニューロンおよびグリア細胞における細胞および分子プロセスの理解は高い関心を持つ。そこで、現在の原稿では、このネットワーク内のマウスエレメントであるマウスSGを同定し、RNA、タンパク質、細胞レベルでのその後の分析を行う方法の基本的なレパートリーを提供しています。
マウスSGの1つの課題は、そのサイズと細胞数が限られている39です。このため、ラット40、イヌ22、ブタ41などの異なる動物モデルがSGに関する研究に使用される。それでも、マウスには様々な確立された疾患モデルが利用可能であり、これらのいくつかは、糖尿病23、心筋梗塞42、または心筋炎43のモデルなど、心臓の内発性および不整脈の異なる側面において既に特徴付けられている。従って、マウスSGのさらなる研究は、VAの観点から自律神経機能障害をさらに特徴付けることを保証する。これらは、SG23の生体内刺激を含む機能実験4、23、44などのマウス心臓のインナーブを研究する他のアプローチによって完了することができる。
小さいサイズと胸腔内の位置24に起因し、生体内のマウス SG の操作は困難ですが、正常に行われているが23.このため、いくつかの研究は、したがって、頸部のよりアクセス可能に位置する優れた頸管神経節に焦点を当て、頸動脈分岐の背後にある交感神経鎖の上流を内側および外部の頸動脈24,35にする。上頸神経節の除去による心臓脱用は、心筋梗塞35後に心筋炎症、肥大、および心機能障害を減衰させることが示されている。しかし、上頸神経節は心臓の異なる領域を内面化し、最も顕著に前側45であることに注意することが重要である。さらに、最近の詳細な文献レビューは、心臓の交感神経管内膜の役割がヒト46において不明確のままであるという結論に達した。これは、心臓交感神経の研究のためのSGを特徴付けることの重要性を強調する。
心臓がSGの唯一の標的ではないことを注意することが重要です。とりわけ、前足48の肺47および汗腺もSGに由来する繊維から内インナートされ、後者はコリンアセチルトランスビセナーゼ37を発現する交感神経生理学の例外である。SGの一時的な遮断は、急性肺傷害49における炎症過程に関して、または熱い紅潮および睡眠機能不全50の治療のために研究される。したがって、手元にあるプロトコルは、これらの分野での機械論的な質問のためのレパートリーを提供するかもしれません。心疾患モデルに焦点を当てる場合、心臓ニューロンが非心臓ニューロン51からの形態または電気生理学的特性によって区別できない結果の解釈に留意すべきである。これは逆行トレースによって達成することができ、それによって心臓に突出するニューロンの位置はSG52の頭蓋骨中心部に位置することが示された。
さらに、異なる種類のニューロンの他に、交感神経節は、グリアグリア、いわゆる衛星グリア細胞またはグリアマーカーS100B53の発現によって特徴付けの衛星細胞で構成されることに注意することが重要である。心血管病変におけるこれらの細胞の役割についてはほとんど知られていないが、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)のグリア活性化および発現は、不整脈18の患者からSGに記載されている。
いくつかの落とし穴は、提示された方法に留意する必要があります:我々はいくつかの機会に抗体ベースの染色の矛盾を観察し、SGが異なるタイプの神経膠穴26の間で透過性が異なるように記述されているように、SGが欠陥している可能性のある結合組織カプセルの不完全な除去が間違っている可能性があると仮定した。微細な鉗子を用いたカプセルの機械的除去は、出生後10日目までラットの優れた頚神経節に記載されており、脱皮は成体ラットSG54、55及びマウス56の文献に記載されている。SG カプセルの除去は、年齢の間で異なる可能性があります 28 と – サイズの違いのため – 種.我々の経験では、新鮮な解剖、目の前のプロトコルに記載されている微細な鉗子および徹底的な透過化を使用してできるだけ多くの結合組織の除去は、染色を成功させるための重要な要因である。定量的リアルタイムPCRに関しては、迅速な作業と効率的なリシスが不可欠です。1匹の動物から両方のSGを確実にプールして、最大12種類の遺伝子の分析を確実に可能にしました(重複を行う場合)。
SGの機能と総解剖学は何十年も研究されており、すべての単一の心筋細胞は交感神経線維46によって内面化されているにもかかわらず、多くのオープンな疑問が残っています。例えば、SGの交感神経が、なぜ虚血性21および非虚血性心不全におけるコリン作動性表現型に一過性にトランスファノ分化するのか、動物モデルならびに患者20において不明である。最近、我々のグループは、マウスSGにも存在するS100B陽性グリア細胞の役割を、心臓神経系29における神経発芽に関する説明した。これらの細胞がVA11、12に関連する傷害後に交感神経芽生に関連しているかどうかは、将来の研究で解明される必要がある。重要なことに、光遺伝学52およびトランスクリプトーム分析36のような革新的なアプローチは、交感神経系の理解と心臓電気生理学におけるその役割を深めるために、ニューロントレースなどの確立された方法を補完することができる。
結論として、このレパートリーは、経験の浅い研究者が心臓病理学のマウスモデルにおけるSGの基本的な特徴付けを行うことを可能にする。これが、新しい方法の使い方、組み合わせ、創造を刺激することを期待しています。これは、VAの発症と維持を担当するかもしれない交感神経の根底にある細胞および分子プロセスの理解を高める助けになるかもしれない。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ハートウィグ・ヴィーボルトの優れた技術支援と、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのUKE顕微鏡イメージング施設(Umif)に、顕微鏡とサポートを提供してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)[FKZ 81Z4710141]によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W.
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I.
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
