Summary
La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.
Abstract
Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità di rigenerarsi dopo una lesione, che è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato. A seguito di lesioni, la cellula staminale muscolare viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. In molte condizioni di deperimento muscolare, tra cui la distrofia muscolare e l'invecchiamento, questo processo è compromesso con conseguente incapacità del muscolo di rigenerarsi. Il processo di rigenerazione muscolare nel pesce zebra è altamente conservato con sistemi di mammiferi che forniscono un eccellente sistema per studiare la funzione e la rigenerazione delle cellule staminali muscolari, in condizioni di deperimento muscolare come la distrofia muscolare. Qui, presentiamo un metodo per esaminare la rigenerazione muscolare nei modelli di zebrafish di malattia muscolare. Il primo passo prevede l'utilizzo di una piattaforma di genotipizzazione che permette la determinazione del genotipo delle larve prima di suscitare una lesione. Dopo aver determinato il genotipo, il muscolo viene ferito usando una pugnalata con ago, a seguito della quale viene utilizzata la microscopia a luce polarizzante per determinare l'entità della rigenerazione muscolare. Forniamo quindi una pipeline ad alta produttività che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli zebrafish di malattia muscolare.
Introduction
Il muscolo scheletrico rappresenta il 30-50% della massa corporea umana e non è solo indispensabile per la locomozione, ma funge anche da organo metabolico e di stoccaggio critico1. Nonostante sia postmitotico, il muscolo scheletrico è altamente dinamico e mantiene un'enorme capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ciò è attribuito alla presenza di cellule staminali residenti nei tessuti (chiamate anche cellule satelliti), situate sotto la lamina basale delle miofibre e contrassegnate dai fattori di trascrizione accoppiati box protein 7 (pax7) e / o paired box protein 3 (pax3), tra gli altri2,3. A seguito di lesioni, la cellula satellite viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. La cascata altamente conservata di segnali pro-rigenerativi che regolano l'attivazione delle cellule satelliti e la robusta riparazione muscolare è influenzata in varie condizioni come le miopatie e l'invecchiamento omeostatico4,5.
Uno di questi diversi gruppi di miopatie è la distrofia muscolare, caratterizzata da progressivo deperimento muscolare e degenerazione6. Queste malattie sono la conseguenza di mutazioni genetiche in proteine chiave, tra cui distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsabili dell'attaccamento delle fibre muscolari alla matrice extracellulare7,8. Dato che le proteine implicate nella distrofia muscolare svolgono un ruolo così centrale nel mantenimento della struttura muscolare, per molti anni si è creduto che un fallimento in questo processo fosse il meccanismo responsabile della patogenesi della malattia9. Tuttavia, studi recenti hanno identificato difetti nella regolazione delle cellule staminali muscolari e conseguente compromissione nella rigenerazione muscolare come seconda possibile base per la patologia muscolare osservata nella distrofia muscolare10,11. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per indagare su come una compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e degli elementi di nicchia associati contribuisca alla distrofia muscolare.
Negli ultimi dieci anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un importante modello di vertebrati per la modellazione delle malattie12. Ciò è attribuito al rapido sviluppo esterno dell'embrione di zebrafish, insieme alla sua chiarezza ottica, che consente la visualizzazione diretta della formazione, della crescita e della funzione muscolare. Inoltre, non solo lo sviluppo e la struttura del muscolo sono altamente conservati nel pesce zebra, ma mostrano anche un processo altamente conservato di rigenerazione muscolare13. Di conseguenza, i pesci zebra rappresentano un ottimo sistema per studiare la patobiologia delle malattie muscolari ed esplorare come la rigenerazione muscolare è influenzata in essa. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo che consente lo studio tempestivo della rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli di zebrafish di malattia muscolare. Questa pipeline ad alto rendimento comporta un metodo per genotipizzare gli embrioni vivi14, a seguito del quale viene eseguita una lesione da pugnalata con ago e l'entità della rigenerazione muscolare viene cioè utilizzando la microscopia a luce polarizzante. L'utilizzo di questa tecnica rivelerà quindi la capacità rigenerativa del muscolo nei modelli di zebrafish di malattia muscolare.
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Protocol
La manutenzione del pesce zebra è stata effettuata secondo le procedure operative standard approvate dal Comitato etico degli animali dell'Università di Monash con licenza di colonia riproduttiva ERM14481.
1. Determinazione del genotipo degli embrioni vivi utilizzando una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni.
- Anestetizzare 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni di zebrafish aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) in terreno embrionale (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4 in acqua). Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
- Preparare il chip di estrazione del DNA a 24 camere staccando il film protettivo trasparente dalla superficie superiore del chip (Figura 1A).
- Tagliare la punta di una punta filtrante da 20 μL per allargare l'apertura. Usando questo, scegli un singolo embrione in un volume di 13 μL di terreno embrionale e caricalo nella prima camera del chip. Ripeti questo processo fino a quando gli embrioni sono stati dispensati in ogni camera.
NOTA: Questa fase deve essere eseguita in un'area con correnti d'aria minime, poiché un elevato flusso d'aria può causare un'eccessiva evaporazione del fluido con conseguente riduzione della sensibilità alla genotipizzazione e della sopravvivenza degli embrioni. - Una volta che il numero desiderato di embrioni è stato caricato sul chip di estrazione del DNA, caricalo sulla piattaforma di genotipizzazione degli embrioni di zebrafish. Questo si ottiene meglio posizionandosi prima in un lato, seguito dal resto.
NOTA: evitare di aggiungere troppa pressione sulla piattaforma in quanto ciò potrebbe sovraccaricare e danneggiare le molle sottostanti. - Apporre il coperchio della piattaforma magnetica sul chip, che impedirà l'evaporazione dei mezzi embrionali durante il protocollo di estrazione del DNA, e chiudere il coperchio della piattaforma.
- Impostare l'unità base a 2,4 volt, 0,051 A e 0,12 W e avviare il protocollo di estrazione del DNA premendo il pulsante "ON/OFF". La piattaforma dovrebbe iniziare a vibrare, che può essere valutata toccando delicatamente il coperchio. Il protocollo deve essere eseguito per 8 minuti.
NOTA: La vibrazione vigorosa provoca lo spargimento di cellule epidermiche, da cui viene estratto il DNA genomico. - Mentre il programma è in esecuzione, preparare una piastra da 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di terreno embrionale a ciascun pozzetti, che è necessario per separare i singoli embrioni mentre vengono eseguiti i test di genotipizzazione a valle.
- Inoltre, etichettare in modo appropriato 8 tubi a strisce di pozzo, che verranno utilizzati per la raccolta di materiale di DNA da ciascun embrione.
- Al completamento del protocollo di 8 minuti, premere il pulsante ON / OFF per interrompere la vibrazione della piattaforma.
- Aprire il coperchio della piattaforma e rimuovere delicatamente il coperchio magnetico assicurando che venga applicata una pressione minima alla piattaforma.
- Rimuovere con cura il chip di estrazione del DNA dalla piattaforma e posizionarlo su una superficie piana.
- Dalla prima camera, rimuovere 10 μL di terreno embrionale che circonda l'embrione e posizionarlo nel pozzo appropriato del tubo a striscia a 8 pozzi. Il supporto contiene il materiale genetico di quell'embrione, che sarà utilizzato per i test a valle.
NOTA: Evitare di toccare l'embrione con la punta della pipetta durante la raccolta dei media, in quanto ciò potrebbe danneggiare l'embrione. - Usando una pipetta di plastica, aggiungere immediatamente due gocce di terreno embrionale fresco nella stessa camera. Raccogli l'embrione e spostalo nel primo pozzo di una piastra di 24 pozzetti.
- Ripetere i passaggi 1.12 e 1.13 per tutte le camere rimanenti. Al completamento di questo, la piastra a 24 pozzetti contenente embrioni vivi può essere spostata in un'incubatrice a 28 °C.
- Eseguire appropriati test di genotipizzazione a valle per determinare il genotipo degli embrioni.
NOTA: Il DNA ottenuto dalla piattaforma di genotipizzazione dell'embrione può essere amplificato con successo mediante PCR e può essere utilizzato per analisi successive tra cui sequenziamento, elettroforesi su gel o analisi di fusione ad alta risoluzione14. Per genotipizzare il ceppo lama2 descritto nei risultati rappresentativi, sono stati utilizzati PCR, digestione di restrizione ed elettroforesi su gel. Dato che la concentrazione di DNA ottenuto da ciascun embrione è bassa, si suggerisce di utilizzare la maggior parte, se non tutto, del materiale genetico ottenuto per il test a valle. - Una volta identificato il genotipo di ciascuna larva, trasferirle in piastre di Petri da 90 mm, collocando ogni genotipo in un piatto diverso. Riempire il piatto con 25 ml di terreno embrionale e conservarli nell'incubatrice a 28 °C.
2. Esecuzione di lesioni muscolari utilizzando una pugnalata con ago
- Una volta che le larve sono 4 dpf, anestetizzarle aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) nel mezzo embrionale. Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
NOTA: Per evitare pregiudizi, l'identità del genotipo deve essere accecata allo sperimentatore che esegue le pugnalate e le analisi a valle. - Durante questo periodo, preparare 24 piastre di pozzetti riempiendo ogni pozzetti con 1 mL di mezzo embrionale fresco e impostare lo stereomicroscopio con uno sfondo nero e una luce ad alta potenza, per facilitare la visualizzazione dei bordi somiti.
- Usando una pipetta di plastica, trasferire una larva anestetizzata in una nuova capsula di Petri.
- Rimuovere con cura il mezzo embrionale in eccesso con una pipetta e, al microscopio di dissezione, orientare il pesce in modo tale che la testa sia a sinistra, la coda a destra, la regione dorsale verso l'alto e la regione ventrale verso il basso (Figura 1B).
- Lavorando sotto un microscopio di dissezione, utilizzare un ago calibro 30 per eseguire una pugnalata rapida ma precisa nel muscolo epaxiale situato sopra il miosetto orizzontale. Per garantire la coerenza in posizione anteriore-posteriore, mirare a 1-2 somiti situati sopra il poro anale (Figura 1B).
NOTA: Evitare di pugnalare il tubo neurale e notochord e lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione del pesce durante il processo. - Usando una pipetta di plastica, versare una goccia di mezzo embrionale sul pesce zebra pugnalato e trasferirlo con cura in un pozzettino della piastra a 24 pozzetti.
- Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6. fino a quando tutti i pesci sono stati pugnalati.
NOTA: Diverse larve possono essere pugnalate insieme a seconda della velocità di lavorazione e della competenza dello sperimentatore, purché il pesce non si asciughi durante il processo. - Una volta che tutte le larve sono state pugnalate, posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice a 28 °C fino a quando non viene eseguita l'imaging successivo.
3. Imaging della lesione muscolare e recupero
- A 1 giorno dopo l'infortunio (1 dpi), anestetizzare le larve pugnalate aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) nel mezzo embrionale. Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
NOTA: a 0 dpi, il sito della ferita contiene una grande quantità di detriti cellulari, il che rende difficile quantificare l'entità della lesione muscolare (Figura supplementare 1A-B). Ci vogliono circa 18-20 ore perché questi detriti vengano eliminati dal sito della ferita, e come tale è più affidabile immaginare le larve a 1 dpi, piuttosto che a 0 dpi, per determinare l'entità della lesione provocata. - Posizionare un piatto a base di fondo di vetro pulito e vuoto sul palco del microscopio polarizzatore e impostare lo sfondo utilizzando il software integrato.
NOTA: non utilizzare piastre di Petri di plastica per l'immagine della birifrangenza, in quanto non trasmettono in modo appropriato la luce rifratta. A seconda del microscopio polarizzato utilizzato, potrebbero essere necessarie impostazioni aggiuntive secondo le linee guida del produttore. - Dopo aver impostato lo sfondo, rimuovere il piatto a base di fondo di vetro dallo stadio del microscopio e utilizzando una pipetta di vetro, trasferire il pesce anestetizzato e pugnalato sul piatto a base di fondo di vetro.
- Rimuovere con attenzione l'eccesso di terreno embrionale usando una pipetta e orientare il pesce come da 2,5 - la testa è a sinistra, la coda a destra, la regione dorsale verso l'alto e la regione ventrale verso il basso.
NOTA: Assicurarsi che le larve siano montate nel modo più piatto possibile, poiché il montaggio irregolare si traduce in diverse intensità di birifrangenza tra diversi somiti. - Posizionare il piatto a base di fondo di vetro con le larve anestetizzate sullo stadio del microscopio e immaginare il muscolo usando la luce polarizzata (Figure 1C e 1D).
NOTA: A seconda del tipo di microscopio/lente polarizzata utilizzata, l'orientamento del pesce sul suo asse anteriore-posteriore può influenzare la birifrangenza complessiva15. Assicurarsi di includere almeno 5 somiti su entrambi i lati del sito della lesione durante l'imaging. - Usando una pipetta di plastica, versare una goccia di mezzo embrionale per reidratare il pesce e posizionare il pesce in un pozzo di un piatto di 24 pozzetti riempito con mezzo embrionale.
NOTA: è importante eseguire l'imaging il più rapidamente possibile per evitare che il pesce si secchi. - Ripetere i passaggi 3.3. al 3.6. fino a quando tutti i pesci non sono stati ripresi.
- Quando tutte le immagini sono state acquisite, salvarle in formato .tiff per le analisi successive.
- Rimettere il pesce nell'incubatrice a 28 °C fino a eseguire l'imaging successivo a 3 dpi (7 dpf).
- Quando i pesci sono 3 dpi, immagina il pesce come da 3,3 a 3,8.
- Una volta che tutti i pesci sono stati ripresi, eutanasalizzarli aggiungendo tricaina metanosolfonato a una concentrazione finale dello 0,2% (v / v) nel mezzo embrionale. Attendere almeno 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano sottoposti a eutanasia, evidente dalla perdita della capacità di nuoto, dal pompaggio delle coperture branchiali e dalla mancanza di una risposta di volo dopo il tocco.
4. Quantificazione della rigenerazione muscolare
- Aprire un'immagine da 1 dpi su un software di analisi di imaging come il software Image J disponibile gratuitamente.
- Utilizzando lo strumento poligono, disegnare attorno al sito della ferita e misurare l'area e l'intensità media di birifrangenza di questa regione (Figure 1C e 1D). Copiare questi valori nelle celle D3 ed E3 nel modello fornito (Tabella supplementare 1).
- Disegna due regioni aggiuntive, ciascuna delle quali copre 1-2 somiti illesi, e misura l'area e le intensità medie di birifrangenza di ciascuna di queste regioni (Figure 1C e 1D). Copiare questi valori nelle celle D4-D5 ed E4-E5 nel modello fornito (Tabella supplementare 1).
NOTA: Mentre è preferibile selezionare gli stessi somiti illesi nelle immagini da 1 dpi e 3 dpi, il distacco sporadico delle fibre muscolari e la successiva riduzione della birifrangenza nei mutanti possono renderlo impossibile. Pertanto, nel caso in cui gli stessi somiti non possano essere selezionati a 1 dpi e 3 dpi a causa della riduzione dell'integrità muscolare nei mutanti, selezionare due aree diverse ma non interessate in ciascuno dei timepoint. - Calcolare la birifrangenza normalizzata per ciascuna regione dividendo l'intensità media di birifrangenza di quella regione per l'area - visualizzata nella colonna F del modello fornito (Tabella supplementare 1).
- Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per tutte le immagini da 1 dpi e 3 dpi.
NOTA: quando si utilizza il modello fornito (Tabella supplementare 1), i valori di area di 1 dpi e di intensità di birifrangenza media devono essere inseriti rispettivamente nelle colonne D ed E e i valori di area di 3 dpi e di intensità media di birifrangenza devono essere inseriti rispettivamente nelle colonne J e K. - Per ogni punto temporale, calcolare la birifrangenza media normalizzata delle due regioni illese. Questo valore fornisce un punto di riferimento del muscolo non leso.
NOTA: nel modello fornito (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato nelle colonne G e M, rispettivamente per le immagini da 1 dpi e 3 dpi. - Successivamente, determinare l'entità della lesione muscolare a 1 dpi, dividendo la birifrangenza normalizzata della regione della lesione per la birifrangenza media normalizzata delle regioni non lesionate (calcolata in 4.6).
NOTA: utilizzando la procedura di pugnalata dell'ago sopra dettagliata, le larve wildtype mostrano in genere una birifrangenza normalizzata del 48,5 ± del 14,3% nel sito della ferita a 1 dpi, indicando che la birifrangenza si è ridotta di circa il 50% rispetto ai somiti non lesi. Quando si utilizza il modello (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato in percentuale nella colonna H. - Per determinare l'estensione della rigenerazione muscolare, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione nell'immagine a 3 dpi, per l'intensità media normalizzata delle regioni non ferite in questa fase.
NOTA: a 3 dpi, le larve wildtype mostrano tipicamente una birifrangenza normalizzata di 60 ± 15,3% nel sito della ferita. Dato che la birifrangenza normalizzata all'interno del sito della ferita a 1 dpi è stata del 48,5± 14,3% (fase 4,7), l'aumento della birifrangenza a 3 dpi a 60 ± il 15,3% indica un recupero di circa l'11,5%. Quando si utilizza il modello (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato in percentuale nella colonna N. - Mantenendo separati i pesci all'interno di ciascun genotipo, eseguire un t-test accoppiato confrontando la birifrangenza normalizzata del sito della ferita a 3 dpi (passo 4.8) con quella di 1 dpi (passo 4.7). Ciò rivelerà la traiettoria di rigenerazione muscolare mostrata da ciascun pesce in ciascun genotipo ed evidenzierà se l'estensione della rigenerazione muscolare mostrata da ciascun genotipo è significativamente cambiata.
- Infine, calcola l'indice rigenerativo dividendo il valore ottenuto nel passaggio 4.8, che è l'estensione della rigenerazione muscolare a 3 dpi, per il valore ottenuto nel passaggio 4.7, che è l'entità della lesione muscolare a 1 dpi. Un indice rigenerativo di 1 indica che la lesione a 1 dpi è paragonabile a 3 dpi e che la rigenerazione muscolare non si è verificata; un valore superiore a 1 indica che a 3 dpi si è formato un nuovo muscolo nel sito della ferita evidenziando che il muscolo si è rigenerato; e un indice rigenerativo inferiore a 1 evidenzia che la ferita a 3 dpi è peggiore di 1 dpi e che la rigenerazione muscolare è compromessa. Un t-test o un ANOVA uninozionale può essere eseguito per confrontare statisticamente l'entità della rigenerazione muscolare tra i diversi genotipi. Quando si utilizza il modello fornito (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato nella colonna O.
NOTA: Si raccomanda di eseguire l'intero esperimento in triplice copia, con pesci di ogni esperimento ottenuti da diversi genitori biologici e ogni esperimento eseguito in giorni diversi, per evitare qualsiasi pregiudizio.
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Representative Results
La capacità di quantificare la birifrangenza del muscolo scheletrico fornisce un metodo non invasivo ma altamente riproducibile per esaminare e confrontare i livelli di danno muscolare ed esaminare la rigenerazione muscolare in vivo. La birifrangenza deriva dalla diffrazione della luce polarizzata attraverso l'array pseudo-cristallino dei sarcomeri muscolari15e, a seguito di lesioni o danni al muscolo, è evidente una riduzione della birifrangenza. Allo stesso modo, l'attivazione e la differenziazione delle cellule staminali provoca la formazione di nuove fibre muscolari all'interno del sito della lesione, aumentando successivamente l'intensità della birifrangenza all'interno di questa regione. Utilizzando questo sistema, abbiamo esaminato la rigenerazione muscolare in un modello di zebrafish di distrofia muscolare congenita di tipo 1A (MDC1A), causata da una carenza di Lama216. È stata raccolta una frizione di embrioni da un incrocio tra due lama2+/- zebrafish e, a 3 dpf, gli embrioni sono stati trasferiti in un chip di estrazione del DNA (Figura 1A) e successivamente genotipizzati utilizzando una tecnologia di genotipizzazione degli embrioni. Dopo aver identificato il genotipo, le larve di lama2-/-, che modellano MDC1A16e lama2+/+ fratelli sono state ferite usando una pugnalata con ago come da Figura 1Be sono state riprese su un microscopio polarizzatore a 1 dpi e 3 dpi, e le intensità di birifrangenza sono state quantificate. Mentre la lesione muscolare si traduce in una riduzione dell'intensità di birifrangenza a 1 dpi (Figura 1Ci e Di), la rigenerazione riuscita del muscolo si traduce in un aumento della birifrangenza nella stessa regione (Figura 1Cii e Dii). È anche interessante notare che mentre le larve di lama2+/+ mostrano un'intensità di birifrangenza uniforme (Figura 1C), a causa del normale pattern muscolare, l'intensità di birifrangenza nel muscolo di lama2-/- era irregolare e altamente sporadica (Figura 1D), attribuita alla ridotta integrità muscolare.
Usando questo approccio, riveliamo che entrambe le larve wildtype (lama2+/+; Figura 2A), e larve carenti di lama2 (lama2-/-; Figura 2B), mostrano un aumento significativo dell'intensità di birifrangenza nel sito della ferita a 3 dpi rispetto a 1 dpi (Figura 2C), indicando che il muscolo si è rigenerato. Per confrontare il potenziale rigenerativo delle larve in ciascun genotipo, è stato determinato l'indice rigenerativo e riveliamo che le larve di lama2-/- hanno mostrato un notevole aumento della rigenerazione muscolare rispetto alle larve di lama2+/+ (Figura 2D; media in lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; media in lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Per convalidare ulteriormente la migliore rigenerazione nelle larve di lama2-/-, abbiamo colorato il muscolo con un anticorpo contro la F-Actina ( Figurasupplementare 1B-D). Mentre questi risultati confermano che lama2-/- si rigenera effettivamente, evidente dalla presenza di fibre muscolari differenziate all'interno del sito della ferita, l'incapacità di esaminare lo stesso pesce a 1 dpi e 3 dpi limita la capacità di quantificare e confrontare la risposta rigenerativa tra lama2+/+ e lama2-/- pesce. Sebbene la base meccanicistica per questa migliore capacità di rigenerazione nelle larve di lama2-/- rimanga sfuggente, riteniamo che la perdita di lama2 aumenti il numero di cellule staminali attivate, che successivamente si traduce in una migliore rigenerazione muscolare. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per determinarlo. Collettivamente, questi risultati evidenziano la capacità della tecnica descritta di identificare i cambiamenti nella rigenerazione muscolare nei modelli di malattia muscolare del pesce zebra.
Figura 1: Panoramica del protocollo di genotipizzazione e rigenerazione muscolare. (A) Immagine di un chip di estrazione del DNA contenente 24, 3 larve di zebrafish dpf. (B) Schema dell'orientamento in cui le larve 4 dpf devono essere posizionate per eseguire la pugnalata dell'ago, con la testa a sinistra, la coda a destra, la regione dorsale verso l'alto e la regione ventrale verso il basso. La pugnalata dell'ago deve essere eseguita utilizzando un ago calibro 30, mirato a 1-2 somiti di muscolo epaxiale. Creato con BioRender.com. (C-D) Immagini di birifrangenza in larve di lama2+/+ e lama2-/- a 1 dpi e 3 dpi. Le regioni mostrate in bianco e rosso riflettono le aree utilizzate per quantificare rispettivamente la birifrangenza nel sito della ferita e i somiti non lesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione della rigenerazione muscolare in larve di zebrafish carenti di lama2. Immagini di birifrangenza nelle larve di lama2+/+ (A) e lama2-/- (B) a 1 dpi e 3 dpi. La ferita a 3 dpi in entrambe le larve lama2+/+ e lama2-/- è piena di nuovi muscoli. (C) Grafico della birifrangenza normalizzata di ciascuna larva a 1 dpi e 3 dpi. La birifrangenza normalizzata nel sito della ferita nelle larve di lama2+/+ e lama2-/- è significativamente aumentata a 3dpi, come determinato utilizzando un t-test accoppiato. (D) Indice rigenerativo in lama2+/+e lama2-/- con quest'ultimo che mostra una maggiore rigenerazione muscolare, come determinato utilizzando un t-test. Le barre di errore rappresentano SEM con larve di tre esperimenti indipendenti (lama2+/+n=28 e lama2-/- n=16). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Esame della rigenerazione muscolare in larve carenti di lama2. Immagini di birifrangenza nelle larve di lama2+/+ (Ai) e lama2-/- (Aii) a 0 dpi che dimostrano la presenza di detriti cellulari all'interno del sito della ferita. Immagini confocali a proiezione massima del miotomo larvale colorato per F-actina a 0 dpi (B), 1 dpi (C) e 3 dpi (D). A 3 dpi, il sito della ferita delle larve lama2+/+ e lama2-/- è caratterizzato dalla comparsa di fibre muscolari marcate con F-actina. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Modello per la quantificazione della rigenerazione muscolare. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato, la cui funzione è alterata in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, ostacolando successivamente il processo di rigenerazione muscolare. Qui, descriviamo un protocollo ad alto rendimento per esaminare la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish vivi di malattia muscolare. Il primo passo della pipeline utilizza una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni14, che è un metodo intuitivo e accurato per determinare il genotipo delle larve vive, prima di eseguire il test di rigenerazione a valle. Un vantaggio diretto di questo è che consente la selezione di genotipi che sono solo di interesse e / o un numero comparabile di pesci all'interno di ciascun gruppo di genotipi, riducendo quindi significativamente il numero di pesci che devono essere elaborati attraverso il resto del protocollo. Tuttavia, è interessante notare che la quantità di DNA genomico ottenuta dal dispositivo di genotipizzazione dell'embrione è relativamente bassa, il che può compromettere i test di genotipizzazione a valle. È quindi importante che tutti i test di genotipizzazione siano testati e ottimizzati prima di utilizzarli per l'esperimento principale. Inoltre, la fonte del DNA è principalmente epidermica e, come tale, il sistema di genotipizzazione dell'embrione non può essere utilizzato con successo per genotipizzare le larve che mostrano mutazioni specifiche del tessuto.
La seconda parte del protocollo dimostra l'uso di una lesione da ago, che è una tecnica economica e ad alto rendimento che non solo si traduce in una dimensione della lesione altamente riproducibile, ma è anche sufficiente per innescare l'attivazione delle cellule staminali muscolari con conseguente rigenerazione muscolare. Un approccio alternativo per indurre lesioni muscolari scheletriche nel pesce zebra è quello di utilizzare l'ablazione cellulare mediata dal laser13,17,18. Mentre questo fornisce la capacità di concentrarsi su specifici piani x, y e z e successivamente colpire singole cellule muscolari, la dimensione estremamente piccola indotta dalla ferita limita un'accurata quantificazione della rigenerazione muscolare, specialmente nei modelli di malattie muscolari in cui l'integrità del muscolo è già compromessa. Pertanto, favoriamo l'uso di lesioni da pugnalata con ago quando si esamina la rigenerazione muscolare nei modelli di malattia muscolare del pesce zebra.
Per quantificare con precisione l'entità della rigenerazione muscolare, approfittiamo della natura birifrangente del muscolo scheletrico, che può essere facilmente ripreso utilizzando un microscopio polarizzatore standard. Ci sono due punti critici che devono essere considerati quando si utilizza questo approccio. In primo luogo, a seconda del tipo di microscopio e / o lente polarizzata utilizzata, l'orientamento del pesce nel suo asse anteriore-posteriore può influenzare l'intensità complessiva della birifrangenza15e questo deve essere considerato durante l'imaging. Infine, sebbene la rigenerazione muscolare non sia completamente completa di 3 dpi, l'entità del recupero è sufficiente per consentire la distinzione delle capacità di rigenerazione in diversi ceppi13 (Figura 1). Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che utilizzando il protocollo che abbiamo delineato, le larve wildtype si rigenerano completamente dopo 14 dpi19e quindi, per determinare se uno sforzo non può rigenerarsi o se la rigenerazione muscolare è ritardata, potrebbe essere necessario esaminare le intensità di birifrangenza oltre i 3 dpi.
Va notato che nei pesci teleostei, la crescita muscolare avviene per tutta la vita dell'animale20e, come tale, è molto importante normalizzare le intensità di birifrangenza del sito della ferita, con quella dei somiti non lesi all'interno dello stesso pesce. Questo passaggio fornisce un controllo interno e rimuove i pregiudizi nelle analisi dovuti a differenze nella quantità di muscoli nei diversi punti temporali o differenze nei parametri di imaging durante le diverse sessioni. Questa fase di normalizzazione è anche indispensabile per quantificare con precisione la rigenerazione muscolare in modelli di malattia muscolare, che possono intrinsecamente avere ridotto le miofibrille e / o mostrare un'integrità muscolare compromessa, riducendo successivamente le intensità complessive di birifrangenza. Inoltre, mentre questo protocollo può rivelare efficacemente cambiamenti nella capacità rigenerativa del muscolo, è possibile che siano il risultato di effetti indiretti sulla funzione delle cellule staminali. La rigenerazione muscolare è un processo complesso che coinvolge segnali provenienti da più tipi di cellule tra cui cellule muscolari, macrofagi, progenitori fibro-adepogenici e cellule interstiziali. È possibile che l'alterata capacità del muscolo di rigenerarsi sia forse spiegata da cambiamenti nella biologia di uno qualsiasi di questi altri tipi di cellule che successivamente influenzano la funzione delle cellule staminali muscolari e il processo rigenerativo. Pertanto, mentre questo protocollo può identificare alterazioni nella rigenerazione muscolare in modelli di malattia muscolare, è necessario eseguire analisi cellulari e molecolari a valle per identificare i meccanismi responsabili dei cambiamenti osservati.
In conclusione, la capacità rigenerativa del muscolo in varie malattie muscolari non è completamente compresa e l'emergere di nuove tecniche per esaminare la rigenerazione muscolare in vivo fornisce una piattaforma per affrontare tali domande. Il metodo può essere utilizzato come base per l'esplorazione di segnali cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Alex Fulcher e Monash Micro Imaging per l'assistenza con la manutenzione e la configurazione del microscopio. L'Australian Regenerative Medicine Institute è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del progetto della Muscular Dystrophy Association (USA) a P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
