Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner

Published: May 21, 2021 doi: 10.3791/62075
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

Summary

En flerkolonnsplattaadapter gör det möjligt att koppla kromatografikolonner till flerbrunnsuppsamlingsplattor för parallell affinitet eller jonutbytesrening som ger en ekonomisk proteinreningsmetod med hög genomströmning. Det kan användas under gravitation eller vakuum som ger milligram mängder protein via prisvärd instrumentering.

Abstract

Proteinrening är absolut nödvändigt för studier av proteinstruktur och funktion och används vanligtvis i kombination med biofysiska tekniker. Det är också en nyckelkomponent i utvecklingen av nya terapier. Den föränderliga eran av funktionell proteomik driver efterfrågan på proteinrening med hög genomströmning och förbättrade tekniker för att underlätta detta. det var hypotetiskt att en multi-column plate adapter (MCPA) kan gränssnitt flera kromatografi kolumner av olika hartser med multi-well plattor för parallell rening. Denna metod erbjuder en ekonomisk och mångsidig metod för proteinrening som kan användas under gravitation eller vakuum, som konkurrerar med hastigheten hos ett automatiserat system. MCPA kan användas för att återställa milligram utbyten av protein med en prisvärd och tidseffektiv metod för efterföljande karakterisering och analys. MCPA har använts för hög genomströmnings affinitets rening av SH3 domäner. Jonutbyte har också demonstrerats via MCPA för att rena proteinet efter Ni-NTA affinitetskromatografi, vilket indikerar hur detta system kan anpassas till andra reningstyper. På grund av installationen med flera kolumner kan individuell anpassning av parametrar göras i samma rening, som inte kan uppnås med de aktuella plåtbaserade metoderna.

Introduction

Protein rening tekniker för att uppnå milligram mängder renade proteiner är absolut nödvändigt för deras karakterisering och analys, särskilt för biofysiska metoder såsom NMR. Proteinrening är också centralt inom andra studieområden såsom läkemedelsupptäcktsprocesser och proteinproteininteraktionsstudier; Att uppnå sådana mängder rent protein kan dock bli en flaskhals för dessa tekniker1,2,3. Den huvudsakliga metoden för proteinrening är kromatografi, som innehåller en mängd olika metoder som förlitar sig på de enskilda egenskaperna hos proteiner och deras taggar. Vid affinitetskromatografi har proteiner ett extra protein- eller peptidmotiv som fungerar som en tagg som har en affinitet för ett visst substrat på kromatografihartset4. Den vanligaste affinitetsmetoden är immobiliserad metall affinitetskromatografi (IMAC) med hjälp av his-taggade proteiner, medan en annan populär metod är jonutbyte kromatografi som separerar proteiner baserat på deras laddning. För högsta renhet används ofta en kombination av affinitetskromatografi och jonutbyte tillsammans, vilket vanligtvis kräver dyr labbutrustning för hög genomströmning.

Den föränderliga eran av funktionell proteomik driver efterfrågan på hög genomströmningstekniker för rening av inte ovanliga proteiner för specifik analys utan ett stort antal proteiner samtidigt för omfattande analys och genom breda studier5. Immobiliserad metall affinitetskromatografi (IMAC) är en av de mest använda metoderna för hög genomströmning protein rening6,7 men dess automatiserade system är kostsamma och oöverkomliga för mindre laboratorier8. De mer prisvärda plåtbaserade alternativ som för närvarande finns tillgängliga använder tillgänglig laboratoriebaserad utrustning, till exempel ett vakuum. Även om dessa metoder är framgångsrika för att förbättra reningshastigheten, kan det bara uppnå hög genomströmningsrening i mindre skala, vilket bara ger protein i mikrogramområdet. Dessa begränsningar innebär att de färdigförpackade 96 brunnsfilterplattorna (t.ex. från GE Healthcare som nu ägs av Cytiva) inte kan användas före biofysiska tekniker9. Gravitationkromatografi är den mest kostnadseffektiva reningsmetoden; Att ställa in flera kolumner är dock obekvämt och kan vara benägen att fel för flera proteiner.

En multikolonn plattadapter (MCPA) har utvecklats och visat sig framgångsrikt och bekvämt köra parallell affinitet kromatografi kolumner på en gång för att rena His-tagged jäst SH3 domäner10. MCPA erbjuder en kostnadseffektiv reningsmetod med hög genomströmning som inte är beroende av dyr instrumentering. Dess flexibla design kan effektivt rena milligram protein genom flera affinitetskromatografikolonner under gravitation eller vakuumgrenrör. Dessutom kan hartstyp, volym och andra parametrar justeras för varje enskild kolumn för snabbare optimering. Denna studie visar att jon utbyte kromatografi av MCPA kan användas tillsammans med affinitet kromatografi av MCPA för att förbättra reningen av Abp1 SH3 domänen. Dessutom kan upp till 24 olika proteiner separeras parallellt med dessa metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Denaturering Ni-NTA kromatografi

  1. Förbereda buffertar
    Obs: Se tabell 1 för information om alla buffertar.
    1. Gör upp 500 ml 0,5 M NaOH, se till att tillsätta Milli-Q-vattnet först och tillsätt sedan NaOH långsamt medan bägaren är på en omrörare. Filtrera med ett filter på 0,22 μm.
    2. Förbered 100 ml nickelsulfat på 0,1 M nickel och filtrera med ett filter på 0,22 μm.
    3. Förbered 50 ml 2 M imidazol och filtrera med ett filter på 0,22 μm.
    4. Bered och 0,22 μm filter 1,5 L denatureringsbuffert vid pH 8,0 bestående av 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-bas (Tris (hydroxymethyl)metylamin), 13,7 mM NaH2PO4,86,3 mM Na2HPO4 och 6 M guanidinhydroklorid.
    5. Bered och 0,22 μm filter 500 ml lysbuffertlösning på 10 mM imidazol upplöst i denatureringsbuffert (se 1.1.4) med 2 M imidazollager.
    6. Bered och 0,22 μm filter 500 ml tvättbuffertlösning på 10 mM imidazol upplöst i denatureringsbuffert (se 1.1.4) med 2 M imidazollager.
    7. Förbered och 0,22 μm filter 500 ml 100 mM EDTA-buffert, justera pH till 8 med 1 M NaOH.
    8. Förbered och 0,22 μm filter 500 ml elueringsbuffert som består av 7 ml 99% glacial ättiksyra till 6 M guanidinhydroklorid.
      OBS: Om du använder inbyggda buffertar, anpassa dig enligt tabell 1.
  2. Lysceller (denatureringsmetod)
    1. Tillsätt 2 ml lysbuffert till varje 1 g skördade E. coli-cellpellets som innehåller det överutpngivna hismärkta proteinet. Virvel i flera minuter tills cellerna är upphängda igen. Lämna proverna på en vipp i 30 minuter vid 4 °C.
    2. Centrifugera lyser pellets vid 18 000 x g i 30 minuter. Håll 50 μL åt sidan i -20 °C frys för att senare analysera på en SDS-PAGE gel.
    3. Häll försiktigt av supernatanterna och se till att pelleten inte störs. Lysates ska vara en klar, ljusgul färg. Om lysates är grumliga, centrifugprov igen; överväga ultraljudsbehandling om det är tillgängligt för att bryta ner nukleinsyra.
    4. Filtrera supernatanerna genom en tom kolumn (utan harts men med filter) och samla i ett öppet uppsamlingsfack. Överför sedan till ett rör för användning i steg 1.3.
      OBS: Om du använder de ursprungliga buffertarna, behandla proverna till 3 cykler av frysning/upptining vid -80 °C efter steg 1.2.1, för att lysa celler.
  3. Förbereda installation av vakuumrening och jämviktskolonner
    OBS: Se Figur 1 för en uppsättning MCPA med 24 kolumner.
    1. Bestäm hur många kolumner som behövs samt önskad hartstyp och volym. Som en tumregel för 100 ml autoinduktionskultur (~ 2 g pellet) som uttrycker his-taggade SH3-domäner med T7-baserade plasmider, använd 0,6 ml Ni-NTA-harts per kolumn för att ge cirka 3 mg protein från ca 6 ml lysat.
    2. Sätt in önskat antal 12 ml kolonner (utan harts men med filter) i en förmonterad MCPA (långdroppplatta med punkterad tätningsmatta). Kolonnerna ska passa tätt i hålen på tätningsmattan som har punkterats.
    3. Om mindre än 24 kolumner används stänger du tomma hål med en tom stängd kolumn.
    4. Ta en öppen uppsamlingsplatta och lägg denna platta i botten av vakuumgrenröret och stäng med toppen av grenröret.
    5. Placera den monterade MCPA:n med pelare ovanpå vakuumgrenröret.
    6. Fäst slangarna från ett vakuumpumpsystem på inloppet/munstycket längst ner på vakuumgrenröret.
    7. Se till att Ni-NTA-pärlorna är i en 50% lösning med 20% etanol. Innan du gör något med pärlorna skaka/blanda försiktigt pärlan/etanollösningen för att återanvända jämnt. Sedan, med en 5 ml pipett, pipett 1,2 ml av 50% lösningen i kolumnerna. Medan pipetting se till att pärlorna förblir helt blandade.
    8. Efter pipetting i alla 24 kolonner, slå på vakuumpumpen och kör 20% etanol genom kolonnen och in i uppsamlingsplattan nedan.
    9. Stäng av pumpen när all etanol på 20 % har gått igenom alla kolonner (Ni-NTA-harts tål kort torkning om vakuumet fortfarande appliceras efter att bufferten har passerat genom kolonnen). Kassera det som finns i den öppna uppsamlingsplattan i en avfallslåda.
      VARNING: Alla avfallsprodukter från Ni-NTA-pärlorna är farliga när du hanterar pärlor eller kasserar avfallet, bär handskar, skyddsglasögon och annan personlig skyddsutrustning. Kassera dessutom allt nickelsulfatavfall i en separat behållare för individuellt bortskaffande senare.
      OBS: Om harts är nytt eller nyligen regenererat kan resten av dessa steg ignoreras och gå vidare till nästa avsnitt.
    10. Tillsätt 3 hartsvolymer (1,8 ml) 100 mM EDTA-buffert med en 20 ml spruta eller en repeaterspruta med en 50 ml spruta. Slå sedan på vakuumpumpen för att låta EDTA-bufferten skölja igenom och stänga av pumpen när den har spolats igenom.
      OBS: Denna tvätt bör ta bort den nickelblå färgen men om så inte är fallet upprepa sedan detta steg tills alla kolumner har förlorat sin blå färg. Stäng av pumpen och häll innehållet i den öppna uppsamlingsplattan i avfallslådan.
    11. Tillsätt 3 hartsvolymer (1,8 ml) 0,5 M NaOH-buffert i varje kolumn innan du slår på pumpen och kör detta genom varje kolumn. Tom uppsamlingsplatta.
    12. Tillsätt 4 hartsvolymer (2,4 ml) av 100 mM nickelsulfat i varje kolonn. Slå på vakuumpumpen och kör den genom kolonnen igen.
    13. Tillsätt 10 hartsvolymer (~6000 μL) Milli-Q-vatten och kör detta genom kolonnerna. Stäng av pumpen och häll av innehållet i uppsamlingsplattan i avfallslådan.
    14. Tvätta kolonnerna två gånger med 4 hartsvolymer (2,4 ml) på 10 mM imidazol i tvättbuffert (denaturering eller infödd) varje gång för att avlägsna eventuellt överskott av nickel och jämvikt. Tom uppsamlingsplatta.
      OBS: Om några kolumner går betydligt långsammare, lossa kolonnen och kontrollera att luft kan skjutas genom MCPA med en stor spruta. Om detta är avblockerat använder du en annan kolumn med ett nytt filter.
    15. Om flera olika prover/proteiner ska renas på MCPA ska du byta ut den öppna uppsamlingsplattan mot en uppsamlingsplatta på 48 x (5 ml/brunn). Men när man bara kör samma proteinprover på varje kolumn är det bra att fortsätta med en öppen uppsamlingsplatta.
  4. Lastning, tvättning och eluering
    1. Med vakuum av, ladda lysates i kolumner (mängden lysat varierar, vanligtvis från 1 till 12 ml eller mer och kan krävas för att ladda i flera partier). Använd en tunn plastomrörare för att försiktigt blanda pärlor och lysat i kolonnen för att maximera bindningen.
    2. När du försiktigt har blandat varje kolonn i några minuter slår du på vakuumpumpen och kör lysen genom pelarna. Om flera proteinprover körs, använd en 48 brunnsuppsamlingsplatta och se till att byta ut uppsamlingsplattan mot ytterligare 48 brunnsplatta efter att 4 ml har gått igenom eftersom brunnarna i dessa plattor bara kan rymma 4 ml lösning. Fortsätt att köra lysat tills alla lysater har körts genom en kolumn. Frys uppsamlingsplattor som innehåller genomströmningen.
      OBS: Kolumner kan bli "blockerade" vilket gör att lysatet strömmar genom kolumnen mycket långsammare än det borde. Detta är lätt att upptäcka eftersom de närliggande kolumnerna kommer att flöda med normal hastighet. Om detta inträffar rekommenderas att lysat/hartsblandningen överförs till en kolumn som innehåller ett nytt filter.
    3. Byt ut uppsamlingsplattan mot en tom öppen uppsamlingsplatta och tillsätt sedan 9 hartsvolymer (5,4 ml) på 10 mM imidazoltvättbuffert till varje kolonn och slå på vakuumet och kör tvätten igenom. Upprepa detta 4-5 gånger. För att undvika spill, töm regelbundet avfallsplattan.
      1. Byt sedan ut uppsamlingsplattan mot en ren lämplig platta (öppen platta för bara ett protein och 96 brunn om det finns flera proteiner, vilket säkerställer att A1 är i det övre vänstra hörnet).
    4. Med hjälp av en repeaterspruta med en 12,5 ml spruta, pipett ~1 hartsvolym (0,75 ml) denaturerings elueringsbuffert i varje kolumn.
    5. För att undvika proteinskumning, slå på vakuumpumpen vid den lägsta inställningen. Lyft försiktigt MCPA för att kontrollera att inget finns kvar att droppa in i uppsamlingsplattan.
      OBS: Ett alternativ till eluering med vakuumet eller gravitationen är att trycka in en 10 ml sprutkolv i toppen av kolonnen för att försiktigt trycka elueringsbufferten genom kolonnen. Gör detta för varje kolumn, var försiktig när du tar bort sprutkolven för att inte störa pärlorna längst ner i kolonnen. När elueringsbufferten har tryckts igenom, ta försiktigt bort sprutkolven från den sista kolumnen den användes i och slå kort på vakuumpumpen för att ta bort de sista dropparna från kolonnerna.
      1. Om en 96-brunns uppsamlingsplatta har använts, kontrollera sedan uppsamlingsplattan för att säkerställa att det som strömmar från varje kolonn genom den långa droppplattan bara strömmar in i en brunn och ingenting eluerar in i närliggande brunnar på uppsamlingsplattan.
    6. För nästa eluering upprepa ovanstående 2 steg och samla i en färsk multi-well (olika prover) eller öppen uppsamlingsplatta (samma prover).
    7. Valfritt steg, ta en 50 μL alikvot av varje eluering för renhets- och koncentrationsanalys.
    8. Tillsätt 2 ml 20 % etanol till varje kolonn och kör igenom detta med vakuumpumpen. Tillsätt sedan ytterligare 2 ml 20% etanol till kolonnerna och använd en färsk tunn plastomrörare för att blanda ihop 20% etanol och pärlor innan du överför till ett 50 ml-rör för förvaring vid 4 °C. Rengör pelarna och kontrollera att vatten strömmar fritt genom varje kolumn och rengör sedan allt och lägg undan för senare användning.
      Vissa kolumner kommer så småningom att få sina filter blockerade och kommer att köras för långsamt, dessa kolumner bör bytas ut eller filter rengöras. Som sådan rekommenderas att regelbundet testa filter genom att ta bort harts och fylla kolonnen med vatten för att se om det strömmar igenom snabbt. Filter kan rengöras genom att lämna en stängd kolumn fylld med denaturerande elueringsbuffert och skakningar över natten.

2. Jonbyte - En enda proteinrening

  1. Förbereda buffertarna
    OBS: Se tabell 1 för information om alla buffertar
    1. Förbered en 2 L låg saltbuffert: 10 mM Tris pH 8,1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Filterlösning med ett filter på 0,22 μm.
    2. Förbered en 0,5 L hög saltbuffert: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. Mät 116,9 g NaCl och gör upp till 0,5 L med 10 mM Tris pH 8.1 ovanifrån. Filterlösning med ett filter på 0,22 μm.
  2. Gör saltkoncentrationsserier: 0-1 M NaCl.
    OBS: Saltkoncentrationerna kan justeras för varje protein.
    1. Inställning 24 x 50 ml märkta centrifuger i ett rack
    2. Använd buffertarna ovan och förbered 24 x 14 ml NaCl-utspädningar från 0-1000 μM. Börja med att lägga till de nödvändiga volymerna på 4 M NaCl 10 mM Tris. Detta kan göras genom steg om 25 mM eller 50 mM beroende på protein.
    3. Lägg sedan till de nödvändiga volymerna på 10 mM Tris till varje rör. Vänd varje rör flera gånger för att blanda.
  3. Förbereda prover
    1. Erhåll de prover som ska renas genom jonbyte. Alternativt kan du ta en 50 μL alikvot för analys senare.
      OBS: Proverna ska alltid hållas kalla. dessa kan vara lysates, eller kanske post Ni-NTA. Prover från Ni-NTA i denatureringsbuffertar kräver dialysering eller buffertutbyte i 10 mM Tris-buffert. Prover från Ni-NTA i inhemska buffertar kan spädas ut med 10 mM Tris-buffert för att minska saltkoncentrationen så att proteinet kan binda till IEX-harts.
    2. Spinnprover på 18 000 x g i 10 minuter.
    3. Häll försiktigt av supernaten i en vägningsbåt. Undvik att störa pelleten.
    4. Ta försiktigt upp supernatanten i en 20 ml spruta och fäst ett filter på 0,22 μm.
    5. Mata långsamt ut supernaten genom filtret i ett friskt 50 ml-rör.
    6. Om utspädning krävs, späd supernatant med 10 mM Tris-buffert ovan (I detta experiment späddes supernatanten 1 av 2). Förvaras vid 4 °C under tiden.
  4. Förbereda installationen av vakuumrening och jämvikt
    OBS: I det här protokollet används endast en kolumn för IEX-rening av ett prov. För flera reningar, se nästa avsnitt.
    1. Bestäm önskad hartstyp och volym. Som tumregel för upp till 20 mg delvis rena SH3-domäner använder du 0,4 ml Q-sepharose snabbflödesharts per kolumn (se steg 2.4.8).
    2. Sätt in 24 öppna tomma kolumner (tomma utan filter längst ner) i en förmonterad MCPA. Kolonnerna ska passa tätt i hålen på tätningsmattan som har punkterats.
    3. Placera en 10 ml sprutkolv i varje tom kolonn utom den första positionen, där reningen startar.
    4. Tryck botten av en öppen kolonn (med filter) genom en 5 ml sprutkolvgummipackning (som har genomborrats) för att bilda en gummiring i slutet av kolonnen. Denna gummiring säkerställer en bra tätning när denna kolumn sätts in i varje tom kolumn ovan. För tillfället infogar du den här kolumnen i den första tomma kolumnen på MCPA.
    5. Ta en öppen uppsamlingsplatta och lägg denna platta i botten av vakuumgrenröret och stäng med toppen av grenröret.
    6. Placera den monterade MCPA (med pelare) ovanpå vakuumgrenröret.
    7. Fäst slangen från ett vakuumpumpsystem på inloppet/munstycket längst ner i vakuumet.
    8. Skär en blå pipettspets ~ 2 cm från botten och använd för att ta upp 800 μL Q-sepharose pärlor (eller någon annan jonbytarharts), se till att 50/50 pärla-etanollösning blandas för att undvika skiktning. Pipett 800 μL i den enda öppna kolonnen (med filter) i första läget och när pärlorna sätter sig längst ner på pelarna slås dammsugaren på tillräckligt för att köra igenom 20% etanol.
    9. Tvätta kolonnen som innehåller sepharose pärlor med 2 x 2 ml 10 mM Tris. Stäng av dammsugaren precis innan Tris-bufferten rinner igenom för att förhindra att hartset torkar ut. Run off kan kasseras.
      OBS: Om harts har använts tidigare, regenerera genom att tvätta i 5 hartsvolymer på 4 M NaCl och sedan 5 hartsvolymer på 10 mM Tris före steg 2.4.9.
  5. Lastning, tvättning och eluering
    1. Överför allt prov som ska renas (se avsnitt 3) till Q-sepharose-kolonnen i första läget, använd en liten plastslinga för att röra om provet och pärlor i cirka ~ 2 minuter innan du slår på vakuumpumpen.
      OBS: Vid överskott av supernatant (>12 ml), se upp för att fylla över kolonnen. Låt provet gå igenom och lägg sedan till mer, blanda innan du låter gå igenom igen.
    2. Lagra/frys igenom genomströmningen för analys senare.
    3. Placera en annan öppen uppsamlingsplatta i vakuumgrenröret och tvätta sedan varje sepharose kolonn med 2 x 2 ml 10 mM Tris och förvara.
    4. Sätt i en 96 brunnsuppsamlingsplatta och se till att A1 är i det övre vänstra hörnet.
    5. För att samla den första elueringsfraktionen, ta bort sprutkolven från nästa kolumn längs, flytta Q-sepharose-kolumnen till detta läge och sätt sprutkolven i föregående läge. Därefter pipett 1 ml av den första saltkoncentrationen i Q-sepharose-kolonnen. Slå på pumpen och samla upp elueringen. Stäng av pumpen precis som vätskan ledningar nära pärlor för att undvika att torka ut pärlor.
    6. För att samla nästa elueringsfraktion, ta bort sprutkolven från nästa kolumn längs, flytta Q-sepharose-kolonnen till detta läge och sätt sprutkolven i föregående läge.
    7. Tillsätt 1 ml av nästa saltkoncentration i kolonnen och upprepa processen tills alla koncentrationer har använts och 24 eluer har samlats in i 24 separata brunnar. Kontrollera att ingen vätska har kommit in i några närliggande brunnar.
    8. Tvätta kolonnen med 2 ml 4 M NaCl 10 mM Tris. Låt det här gå igenom.
    9. Tvätta med 2 ml 20% etanol. Låt etanolen gå tills den är precis ovanför pärlor och tätningskolonn för förvaring.
    10. Förvara 96 brunnsuppsamlingsplatta och analysera med UV-spektroskopi och SDS PAGE.

3. Jonutbyte - Samtidig rening av 24 olika proteiner

OBS: Se steg 2.1-2.3 för detaljer om hur du gör buffertar, en serie saltkoncentrationer och beredning av prover

  1. Förbereda reningsinställningarna
    OBS: Hur reningssystemet är uppställt beror i hög grad på hur många proteiner som renas och hur många saltförhållanden som kommer att användas. För att rena 12 prover upp till maximalt 24 prover samtidigt krävs en uppsamlingsplatta för varje saltkoncentration som används för att eluera. För mindre än 12 prover är det möjligt att flytta kromatografikolonnerna några positioner inom samma MCPA innan du byter uppsamlingsplattor. I det här fallet finns det inget behov av att placera kolumnerna i tomma kolumner och de kan fästas direkt på MCPA-tätningsmattan. Protokollet nedan gäller 24 samtidiga jonutbytesreningar.
    1. Placera den monterade MCPA direkt fastsatt på 24 tomma kolonner med filter ovanpå vakuumgrenröret som innehåller en öppen uppsamlingsplatta och förbered och tvätta 24 jonbyteskolonner som i en enda reningsmetod ovan. För denna rening är det bekvämt att använda en Eppendorf repeater eller spruta för att snabbt pipett i kolumner.
  2. Lastning, tvättning och eluering
    1. Placera en 48-brunns uppsamlingsplatta i botten av vakuumgrenröret innan du monterar MCPA (med de tvättade reningspelarna monterade). Se till att A1 är i det övre vänstra hörnet.
    2. Pipett varje proteinprov (upp till 5 ml åt gången) i motsvarande kolumn. Rör om varje kolonn med en tunn plastslinga (en slinga för varje kolonn för att undvika förorening) i cirka 2 minuter. Slå sedan på vakuumpumpen och låt supernaten flöda igenom.
      OBS: Vid överskott av supernatant, se upp för att fylla över kolumnerna. Låt exemplet gå igenom kolumnen och lägg sedan till mer, blanda innan du låter körningen gå igenom igen.
    3. Förvara/frys 48-brunnsuppsamlingsplattan för senare analys eftersom den innehåller genomströmningen för varje protein.
    4. Placera ytterligare en 48-brunns uppsamlingsplatta i vakuumgrenröret och tvätta sedan varje sepharose-kolonn med 2 x 2 ml 10 mM Tris.
    5. Sätt in den första 96-brunnsuppsamlingsplattan i grenröret, se till att A1 är i det övre vänstra hörnet och sedan pipettera 1 ml av den första saltkoncentrationen i varje kolonn och slå sedan på vakuumpumpen för att köra detta genom pelarna. Ta bort uppsamlingsplattan, täck med parafilm och förvara den vid 4 °C för analys.
    6. Upprepa steg för varje på varandra följande saltkoncentration som används för att eluera. Se till att en ny uppsamlingsplatta används för varje eluering och att varje uppsamlingsplatta är märkt och förvarad.
    7. Tvätta varje kolonn med 2 ml 10 mM Tris, 4 M NaCl.
    8. Tvätta varje kolonn med 2 ml 20% etanol. Låt etanolen gå tills den är precis ovanför pärlor och tätningskolonner för lagring.
    9. Förvara 96 brunnsplattor och analysera med UV-spektroskopi och SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett exempel har MCPA framgångsrikt renat 14 AbpSH3-mutanter under denatureringsförhållanden via Ni-NTA (Figur 2A). En liten förorening ~ 25 kDa kan ses, men proteinet är fortfarande till stor del rent. Detta främmande ämne tros vara YodA, ett vanligt co-purified protein som finns i E. coli11. Figur 2B visar reningen av 11 olika SH3-domäner under inhemska förhållanden. Det lilla föroreningar som ses under denatureringsförhållanden avlägsnas under inhemska förhållanden. Detta visar att MCPA kan användas för jämförelse av reningar som består av inhemska buffertar eller denatureringsbuffertar enligt tabell 1. 

Representativa uppgifter för rening av ett lysat via IEX MCPA visas i figur 3. Detta tyder på att AbpSH3 kan separeras från majoriteten av föroreningarna eftersom det eluerar senare mellan 425 mM till 700 mM. Koncentrationen av salt som behövs för att eluera proteinet från kolonnen avser styrkan av elektrostatisk interaktion mellan proteinet och hartset. Majoriteten av bakterieproteiner har låga pIs; emellertid proteinet av intresserar är mycket negativt och verkar för att ha en lägre pI. Goda utbyten av betydligt rent AbpSH3 protein återfanns med några olika högre molekylvikt föroreningar AbpSH3 ses som band på ~ 5 kDa. IEX via MCPA kan därför användas som första steg i ett reningsprotokoll eftersom det kan isolera tillräckliga mängder protein från de nuvarande föroreningarna i ett lysat.

Ytterligare rening med hjälp av MCPA har framgångsrikt visats på fraktioner som framkallats från en Ni-NTA MCPA-körning(figur 4). Märkbart nog har två huvudtoppar lösts med maxima vid 400 och 700 mM salt, vilket kan motsvara att separera en N-terminal trunkerad version av detta protein. Genom ytterligare DSF-dataanalys visade det sig att topp 1 var något mindre stabil och hade en något lägre Tm i förhållande till topp 2. I jämförelse med lysatets IEX-körning är fraktionerna överlag mycket renare och visar fördelen med att köra ett Ni-NTA-steg före IEX. Även om det finns liten förorening med proteiner med högre molekylvikt, är fraktionerna fortfarande till stor del rena och har gett bra biofysiska data med hjälp av NMR och termiska / kemiska denatureringsanalyser.

Figure 1
Figur 1: En framifrån av MCPA-instrumentet. A)Framifrån av MCPA-instrumentet med 24 kolumner bifogade. Kolonnerna är jämnt fördelade i 96 brunnstätningsmattan för att styra elutionerna till en 96, 48 eller öppen uppsamlingsplatta. B) Överst på tätningsmattan. (C) Nederkant på samma tätningsmatta. ( D )McPA:sfrämre vy med pelare och sprutkolv fästa. Denna siffra har ändrats från Dominguez et al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Ett exempel på en 1 x 24-kolumnkonfiguration, rening av olika SH3-mutanter under denaturering och inhemska förhållanden. A)Denaturering av olika AbpSH3-mutanter. En liten förorening kan upptäckas av ~ 25 kDa över varje körfält. B)Inhemskrening av 11 olika sh3-domäner av jäst. Föroreningarna har avlägsnats från varje körfält och syns inte längre på gel. Denna siffra har ändrats Dominguez et al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:Rening av lysat med IEX via MCPA. A)Absorbansavläsningar av alla eluer från jonutbytet (IEX) mättes med en LVis-platta (BMG). Avläsningarna ritas mot motsvarande NaCl-koncentration av elueringen. Toppen med den högsta proteinkoncentrationen ses vid 700 mM NaCl. B)SDS-PAGE-analys av IEX salt elutioner som presenteras i (A). Molekylviktsmarkören visas till vänster om gelén. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Rening av VJM2 Pool (efter Ni-NTA) med hjälp av IEX via MCPA-system.

A)Absorbansavläsningar av de insamlade elutionerna från jonutbytet (IEX) mättes med hjälp av en NanoDrop. Avläsningarna ritas mot motsvarande NaCl-koncentration av elueringen. B)SDS-PAGE-analys av IEX salt elutioner som presenteras i (A). Molekylviktsmarkören visas till vänster om gelén. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Denaturering av buffertsammansättning Ursprungsbaserad buffertkomposition
Lysis buffert 10 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 6 M GuHCl, 10 mM imidazol, pH 8,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0
Tvätta buffert 10 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 6 M GuHCl, 20 mM imidazole, pH 8,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0
Elutionsbuffert 10 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 0,2 M ättiksyra, pH 3,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0
Buffertkomposition
Högt salt 5 mM Trissyra, 5 mM Tris bas, pH 8,1, 4 M NaCl
Lågt salt 5 mM Trissyra, 5 mM Tris-bas, pH 8,1

Tabell 1: Sammansättning av buffertar, Ni-NTA-denaturering och inhemska reningar och jonutbyte av låga och höga saltbuffertar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden är robust och enkel att använda för relativt oerfarna proteinbiokemister, men det finns några överväganden att tänka på.

Varning för överfyllning av uppsamlingsplattor

Själva uppsamlingsplattan på 48 brunnar rymmer bara 5 ml per brunn medan varje 96-brunn endast rymmer 2 ml. Detta måste hållas i åtanke när du lägger till buffert och kör prov genom kolumnen eftersom det finns risk för överfyllning av brunnarna. I synnerhet måste försiktighet vidtas när de större proverna överförs till kromatografikolonnen för rening. I de fall där det finns överskott av supernatant, dela i delar, tillräckligt för att fylla kolumnen, som bör tillåtas att springa igenom innan du lägger till nästa del för att förhindra överfyllning och förlust av prov. Efter varje tillsats av supernatant bör kolonnen blandas med en liten plastslinga, för att öka sannolikheten för proteinbindning till pärlorna innan pumpen slås på. För att hålla reda på plattans orientering och därmed innehållet i brunnarna, se till att det märkta hörnet "A1" alltid är i det övre vänstra hörnet av plattan innan reningen påbörjas.

Eluering Protein

Vid eluering i IEX- och affinitetssteget används vakuumet på den lägsta inställningen för att dra elueringsbufferten genom kolonnen. Detta påskyndar flödeshastigheten jämfört med gravitationen, även om proteinkoncentrationen är hög kan det leda till att proteinlösningen skummar och potentiellt tandnedersätts. Om så är fallet är ett alternativ att använda en sprutkolv ovanpå den öppna kolumnen för att trycka bufferten genom kolumnen. I detta fall ska sprutkolven försiktigt (inte kraftfullt) tryckas ner i kolonnen för att trycka vätskan igenom och in i uppsamlingsplattan under. Var försiktig när du tar bort uppsamlingsplattan för att säkerställa att eventuella elueringsdroppar som finns kvar på MCPA inte spiller ut i närliggande brunnar, vilket orsakar förorening.

Underhåll av harts och kolonner

Ett kritiskt steg i det här protokollet är regenereringen av Ni-hartserna och kolumnerna. Kolumner bör återskapas i början eller slutet av reningsprotokollet. Om regenerering sker i slutet ska hartset förvaras i 20 % etanol vid 4 °C. Kromatografikolonnfiltren kan bli "blockerade" vilket gör att provet flödar genom kolumnen i mycket långsammare takt än det borde. Om så är fallet måste kolonner bytas ut eller filter tas bort och rengöras genom att blötlägga i denatureringsbuffert över natten och skölja med vatten.

Som framgår av steg 3 kan mångfalden av MCPA-instrumentet utnyttjas för rening av flera proteiner lika effektivt som ett enda prov. Jonutbytesprotokollet kan skräddarsys för att passa experimentets behov och anpassas till antalet olika prover och antalet saltkoncentrationer som används. Om till exempel mindre än 12 prover renas samtidigt, skulle det innebära en kombination av att flytta kolonnerna efter varje eluering inom samma platta och/eller byta uppsamlingsplattor mot varje eluering. Om till exempel endast 4 proteiner renades parallellt kan kolonnerna flyttas över en uppsamlingsplatta för att samla eluer av upp till 4 saltkoncentrationer innan plattor ändras. MCPA kan rening med olika hartser - affinitet och jonutbyte har redan diskuterats men hydrofobisk interaktion kromatografi är också möjligt och det finns ytterligare potential för immunoaffinitet kromatografi12. Även om denna metod har fokuserat på flera småskaliga reningar, kan MCPA användas för bara en enda stor kromatografikolonn för rening från flera liter bakteriekultur, utan behov av en provpump eller ett dyrt FPLC.

Att använda MCPA för utbyte av hög genomströmning som diskuterats skulle kräva flera, upp till 24, separata uppsamlingsplattor. Detta kan vara opraktiskt och kräva mycket utrymme på en vanlig laboratoriebänk och ökad risk för mänskliga misstag. Dessutom kan det vara utmanande att mäta proteinabsorbansen av eluer från 24 olika prover. I denna situation skulle en flerkanalspipett vara fördelaktig och göra överföringen av flera prover snabbare och enklare. För små volymer, överväg att använda en LVis-platta (BMG) som innehåller 16 mikrodroppar eftersom det möjliggör mätning av koncentrationerna direkt, utan att behöva använda några andra reagenser som Bradford-analysreagenset.

Medan användningen av en vakuumpump möjliggör en 3x snabbare reninghastighet än vad som uppnås med baragravitation 10, utan att äventyra hartsets integritet, skapar det några andra problem. För att bibehålla vakuumens styrka under reningen krävs till exempel att alla kolonner blockeras med en 10 ml sprutkolv som måste tas ut innan kolonnen sätts in med harts. Att ta ut kolven en efter en är också en process i rätt tid och vakuummotståndet kan göra dem svåra att ta bort från kolonnen.

Detaljer om en multipla protein IEX rening med mcpa ges i protokollet. Denna metod med högre dataflöde är tidseffektiv och kontrollerbar, alla parametrar för varje rening kan manipuleras av användaren. Men i de flesta proteinbiokemiska laboratorier, inklusive industrin, är snabb protein flytande kromatografi den föredragna metoden för proteinrening, vilket är överlägset när det gäller genomströmning, reproducerbarhet och metodöverföring och robusthet. Dessa system som Protein Maker by Protein Biosolutions och AKTA FPLC biomolecule reningssystem kan lindra rening flaskhalsproblem med stor framgång. Trots att dessa system ger överlägsna resultat är separationen vi ser med MCPA-systemet fortfarande tillräckligt bra för att få protein med hög renhet. Intressant nog använder vårt labb också AKTA start FPLC för att utföra jonutbytekromatografi och även om upplösningen kan vara högre med en linjär gradient som kan med denna maskin, är det betydligt mer tidskrävande att köra flera prover och det är mycket mer utmanande att träna oerfarna studenter på detta system.

Det finns andra betydligt billigare plåtbaserade reningsalternativ. Ge Healthcare life sciences (numera Cytiva) och Sigma Aldrich säljer till exempel färdigförpackade 96 brunnsfilterplattor och patroner med specifika reningssnår. Dessa filterplattor erbjuder småskalig rening med hög genomströmning men renar endast i mikrogramutbytesområdet. Dessutom använder QIAvac 24 Plus från QIAGEN spinnkolonner under vakuum, men det är inte praktiskt för att samla in flöde genom eller tvättar.

McPA:s flexibla utformning möjliggör parallell proteinrening, även om manuella kolonner och plattor med MCPA-metoden potentiellt ökar de mänskliga felen jämfört med vanliga FPLC-system. Att manuellt ladda proverna på kolumner är dock mer tillförlitligt för oerfarna användare än att ladda prover på kolumner med vanliga FPLCs, där misstag lättare kan göras eftersom det innebär att byta ventiler och pumpar som kräver mer omfattande utbildning. Det är uppenbart att helautomatiska system för proteinrening är bättre lämpade än MCPA för reningsgrupper inom industri och akademiska laboratorier som rutinmässigt arbetar med rening. Men för små laboratorier som inte har råd med dyr utrustning och underhåll och vill undvika omfattande utbildning eller bara ibland arbeta med proteinrening erbjuder MCPA ett effektivt alternativt system som fortfarande får god separation och är billigt och enkelt att inrätta.

MCPA består av enkel och billig instrumentering som gör det möjligt att gränssnitt flera kolumner för samtidig parallell rening för att producera milligram mängder proteiner. Dessutom tillåter denna teknik modularitet hos de enskilda kolumnerna som ökar dataflödet. Detta är unikt för denna metod och kan inte uppnås med nuvarande plåtbaserade reningssatser.

Proteinrening kommer att förbli avgörande i studien och karakteriseringen av proteiner och utvecklingen av terapier. Biofysiska tekniker som NMR och proteinkristallografi förlitar sig på milligram mängder rent protein, därför behöver de nuvarande uttrycks- och reningssystemen vidareutvecklas för att förbättra kostnaden och tiden för att uppnådenna 2,13,14. Som diskuterats har automatiserade reningssystem många fördelar jämfört med oautomatiska metoder, men de är fortfarande för kostsamma för mindre laboratorier som kräver dyr instrumentering och utbildning. MCPA är betydligt billigare med en startkostnad på $ 4510. Dessutom behöver denna MCPA inte omfattande utbildning eller kontinuerligt underhåll och om några problem uppstår kan dessa enkelt lösas. Frätande buffertar som denatureringsbuffertarna som används för Ni-NTA kan korrodera reningssystem om de inte rengörs ordentligt. McPA:s flexibla utformning möjliggör dock snabb rengöring, reparation och byte av fack vid behov. Sammanfattningsvis kommer MCPA att underlätta effektiv proteinrening med högre genomströmning för mindre laboratorier tills mer prisvärda automatiserade system har inrättats10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av en Institutional Development Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20GM103451 och ett internt forskningsanslag från University of Liverpool.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL/ well collection plate Agilent technologies 201240-100
5 mL/ well collection plate Agilent technologies 201238-100
12 mL chromatography columns Bio-Rad 7311550
96 well long drip plate Agilent technologies 200919-100 Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat Agilent technologies 201158-100 Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin Takara Bio 635660
HiTrap Q HP anion exchange column GE Healthcare (Cytiva) 17115301
Lvis plate reader BMG LABTECH Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs Cole-Parmer EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit Sigma-Aldrich 575650-U
Reservoir collection plate Agilent technologies 201244-100
The Repeater Plus Eppendorf 2226020 With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum INTEGRA 158 320 The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

Tags

Biokemi Nummer 171 Hög genomströmningsrening Affinitetskromatografi Jonutbytekromatografi MCPA ekonomisk proteinrening SH3-domän
Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kineavy, F. B., Davies, A. A.,… More

Kineavy, F. B., Davies, A. A., Mitchell, M. R., Lay, D., Dominguez, M. J., Stollar, E. J. An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter. J. Vis. Exp. (171), e62075, doi:10.3791/62075 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter