Summary
Beskrevet her er en etableret metode til at bestemme omfanget af HIV-1-begrænsning af det cellulære hæmmende protein SAMHD1. Humane myeloide afstamning U937-celler transduceres med en SAMHD1-ekspressionsvektor, der co-udtrykker YFP, differentieret og derefter udfordret med HIV-RFP. Begrænsningsniveauet bestemmes ved flowcytometrianalyse.
Abstract
Sterilt α-motiv / histidin-aspartat domæneholdigt protein 1 (SAMHD1) hæmmer replikation af HIV-1 i hvilende myeloide celler. U937-celler anvendes i vid udstrækning som et praktisk cellesystem til analyse af SAMHD1-aktivitet på grund af et lavt niveau af SAMHD1 RNA-ekspression, hvilket fører til uopdageligt endogent proteinekspression. Baseret på lignende assays udviklet i Stooe-laboratoriet for at karakterisere andre retrovirale begrænsningsfaktorer udviklede Bishop-laboratoriet et tofarvet begrænsningsassay til analyse af SAMHD1 i U937-celler. Murine Leukæmi Viruslignende partikler, der udtrykker SAMHD1, sammen med YFP udtrykt fra en IRES, bruges til at transducere U937-celler. Celler behandles derefter med phorbolmyristacentacetat for at inducere differentiering til en hvilende fænotype. Efter differentiering er celler inficeret med HIV-1-viruslignende partikler, der udtrykker en fluorescerende reporter. Efter 48 timer høstes celler og analyseres ved flowcytometri. Andelen af HIV-inficerede celler i den SAMHD1-ekspressive population sammenlignes med andelen i interne kontrolceller, der mangler SAMHD1. Denne sammenligning afslører et begrænsningsforhold. SAMHD1-ekspression fører til en femdobling af hiv-infektion, svarende til et restriktionsforhold på 0,2. Vores nylige substitution af RFP med den oprindelige GFP som reportergen for HIV-infektion har lettet flowcytometrianalyse.
Dette assay er med succes blevet brugt til at karakterisere effekten af aminosyresubstitutioner på SAMHD1-begrænsning ved at transducere med vira, der koder for ændrede SAMHD1-proteiner, afledt af stedstyret mutagenese af ekspressionsvektoren. For eksempel viser de katalytiske stedsubstitutioner HD206-7AA en begrænsningsfænotype på 1, hvilket indikerer et tab af begrænsningsaktivitet. Ligeledes kan modtageligheden af forskellige testervirus bestemmes. Analysen kan tilpasses yderligere til at inkorporere effekten af differentieringsstatus, metabolisk status og SAMHD1-modifikatorer for bedre at forstå forholdet mellem SAMHD1, cellemetabolisk tilstand og viral begrænsning.
Introduction
Sterilt α-motiv / histidin-aspartat domæneholdigt protein 1 (SAMHD1) hindrer replikation af human immundefektvirus type 1 (HIV-1) i hvilende celler af myeloid-slægten. SAMHD1 blokerer replikation gennem sin enzymatiske aktivitet som en dNTP-triphosphohydrolase, hvilket resulterer i nedsatte niveauer af intracellulære dNTP'er. Som følge heraf kan HIV-1 ikke udføre processen med omvendt transkription effektivt. Der er gjort store fremskridt i de få år, der er gået siden denne første observation, især med hensyn til specifikke domæners og aminosyrers bidrag til SAMHD1's antivirale aktivitet. Disse indsigter er foretaget ved hjælp af biokemiske assays samt cellesystemer, der efterligner det fysiologisk relevante hvilende myeloide miljø. U937-celler1 anvendes i vid udstrækning som et praktisk myeloidt cellesystem til analyse af SAMHD1-aktivitet. Dette skyldes mangel på endogen SAMHD1-ekspression, der menes at skyldes lave RNA-niveauer sammenlignet med SAMHD1-ekspressive celler (et område med igangværende forskning). Her beskriver protokollen den forbigående transduktion af U937-celler med viruslignende partikler, der co-udtrykker SAMHD1 og en gul fluorescerende protein (YFP) reporter for at undersøge mekanismen for SAMHD1-begrænsning af HIV-1. Sådanne forbigående tofarvede flowcytometriassays til undersøgelse af retrovirale begrænsninger blev først udviklet i Stoye-laboratoriet2 og er siden blevet tilpasset til at undersøge andre begrænsningsfaktorer, herunder trepartsmotivet (TRIM) proteiner3. Inspireret af disse analyser udviklede Bishop-laboratoriet et tofarvet assay til at analysere SAMHD1-begrænsning i U937-celler.
Arbejdsgangen for eksperimentet er vist i figur 1. Murine Leukæmi Virus (MLV)-lignende partikler indeholdende en bi-cistronisk meddelelse, der koder for SAMHD1 sammen med YFP udtrykt fra en IRES, bruges til at transducere U937-celler. Celler behandles derefter med phorbolmyristacetat (PMA) for at inducere differentiering til en hvilende fænotype. Celler inficeres derefter med HIV-1-viruslignende partikler, der udtrykker rødt fluorescerende protein (RFP). Efter 48 timer høstes cellerne og analyseres ved tofarvet flowcytometri. Dette assay bruges også med YFP og grønt fluorescerende protein (GFP), hvilket kræver mindre standardfilterkombinationer til flowcytometrianalyse. Brug af HIV-RFP giver mulighed for mere ligetil kompensation, og analysen er således lettere tilgængelig for mindre erfarne flowcytometribrugere og opnåelig med de fleste cytometre.
Under analysen sammenlignes andelen af HIV-inficerede celler mellem SAMHD1-ekspressive celler og dem, der mangler SAMHD1 inden for samme brønd af celler. Dette giver en intern kontrol i brønd/ flowcytometrirør, hvilket er en nøglefunktion. Sammenligningen af infektionsniveauer i transducerede og utransducerede celler afslører et begrænsningsforhold. Et forhold på 1,0 indikerer, at den transducerede faktor ikke har nogen effekt på infektiviteten. Wild type SAMHD1-ekspression fører til en femdobling af HIV-infektion i dette assay, svarende til et restriktionsforhold på 0,2. Selvom denne effekt er beskeden i forhold til mere klassiske begrænsningsfaktorer som TRIM5, er effekten ikke desto mindre reproducerbar og tillader klassificering af modificerede SAMHD1-ekspressorer i dem, der begrænser på en tilsvarende måde til vildtypeproteinet, dem, der ikke begrænser, og dem med en mellemliggende fænotype.
Dette assay er blevet brugt med succes til at karakterisere SAMHD1-domæne- og aminosyremutanters restriktionsfænotyper ved at transducere med vira, der koder for mutante SAMHD1-sekvenser. For eksempel undlader de katalytiske stedsubstitutioner HD206-7AA at begrænse i dette assay. Ligeledes kan modtageligheden af forskellige testervirus bestemmes. For eksempel er HIV-1 reverse transkriptasemutanter mere modtagelige for SAMHD1-medieret begrænsning (f.eks. 151V4). Denne protokol skitserer detaljerne i viruslignende partikelproduktion (VLP), transduktion af U937 med SAMHD1-ekspressionsvektorer, infektion med HIV, der bærer en fluorescerende reporter og den efterfølgende analyse ved flowcytometri. Denne artikel diskuterer, hvilke data man kan forvente, og hvordan man undgår suboptimale resultater. Endelig skitseres alternative anvendelser til analysen ud over at undersøge forskellige SAMHD1-varianter for at forstå samspillet mellem SAMHD1, dNTP-niveauer og virusinfektion mere grundigt. I betragtning af SAMHD1's rolle i centrum for cellemetabolisme, med yderligere forbindelser til kræft, er dette fortsat et område af intens interesse.
Protocol
Denne protokol indeholder ingen undersøgelser, der involverer dyr eller menneskelige deltagere udført af nogen af forfatterne. Alle trin i denne protokol blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og adfærdskodekserne i de institutioner, hvor de blev udført.
1. Transfektion af 293T-celler til VLP-produktion (både SAMHD1-ekspressionsvektorer og tester HIV-partikler)
BEMÆRK: De væsentligste bidragydere til en vellykket produktion af viruspartikler er producentens 293T-cellers sundhed, sammenløb ved transfektion og høsttidspunkt. Laboratorier vil typisk have deres foretrukne transfektionsreagenser og protokol til retroviral partikelproduktion. Følgende protokol giver infektiøse partikler af god kvalitet, men tilsvarende protokoller ville også være egnede til denne anvendelse. For at opretholde 293T-celler af god kvalitet skal du passere mindst tre gange om ugen for at opretholde en konstant vækstrate. Celler skal sås i logfasen af vækst for effektiv transfektion.
- Dag 1: Frø det krævede antal 10 cm skåle med en 1/4 split fra en næsten sammenflydende skål med 293T celler for at give omkring 60% sammenløb den følgende dag (ca. 5 x 105 celler / ml). Det kan være nødvendigt at så flere tætheder for at opnå en passende tæthed til transfektion den følgende dag, når man arbejder med en ny cellebestand.
- Dag 2 (morgen): Kontroller for ca. 60% sammenløb ved mikroskopi og udskift forsigtigt medier på celler med 10 ml frisk Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Dag 2 (eftermiddag, mindst 4 timer efter medieskift): Transfect til VLP-produktion.
- DNA-fortyndingsblandingen indeholder 3 μg hver af gag-pol expressorplasmid, Long-terminal repeat (LTR)-drevet reporterplasmid og vesikulær stomatitisvirus G-protein (VSV-G) expressorplasmid (i alt 9 μg, se NOTE) i 600 μL serumfri DMEM. Hvirvel og centrifuge kort (15 s, >500 x g).
- Der tilsættes 20 μL transfektionsreagens (se materialetabel), hvirvel (centrifugeres ikke) og inkuberes ved 20 °C i 15-20 min. Tilsæt transfektionsblandingen dråbevis til pladen, hvirvl forsigtigt for at blande og vend tilbage til inkubatoren.
BEMÆRK: Til MLV VLP, der udtrykker SAMHD1, skal du bruge KB4 5,6 (gag-pol expressorplasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-drevet reporterplasmid) og pczVSV-G7. Til HIV-RFP VLP skal du bruge p8.91 8,9 (gag-pol expressor plasmid), SCRPSY10 (LTR-drevet reporterplasmid) og pczVSV-G. Alternativer diskuteres i materialefortegnelsen. Plasmidforhold skal muligvis optimeres til forskellige plasmid-/transfektionssystemer.
- Dag 3 (sen morgen): Fjern mediet forsigtigt fra cellerne ved pipettering, vask med 5 ml frisk DMEM, og udskift med 5 ml frisk DMEM.
- Dag 4 (morgen): Høst virussen ved at samle supernatanten fra cellerne og udskift med 5 ml frisk DMEM. Før den VLP-holdige supernatant gennem et 0,45 nm filter, aliquot og overfør til -70 °C til opbevaring. Sørg for, at aliquoterne er af en størrelse, der er egnet til planlagte eksperimenter (250 μL som et forslag), da gentagne fryse-optøningscyklusser vil resultere i tab af viral titer.
- Dag 5 (morgen): Høst virussen som i 1,5, men kassér pladerne efter opsamling af supernatanten.
2. Titering af ny VLP inden brug
- Dag 1: Frø 293T ved 2 x 105 celler pr. brønd af en 24-brønds plade - 4 brønde pr. virus, der skal titreres, inklusive en virus med kendt infektivitet for hver rygrad. Optimer såtætheden for en given cellebestand.
- Dag 2: Overhold pladen for at kontrollere sammenløbet (ideelt ~ 70%). Optø den virusholdige-supernatant fra trin 1.5 og 1.6. Tilsæt 0, 10, 25 eller 100 μL til hvert hul.
- Dag 4 (morgen): Høst cellerne til analyse ved flowcytometri.
- Fjern mediet ved omhyggelig pipettering eller aspiration. Cellerne vaskes forsigtigt med 250 μL fosfatbufferet saltvand (PBS). Fjern cellerne fra pladen ved at pipettere op og ned med 250 μL PBS, og overfør dem til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 250 μL 4% paraformaldehyd (idet den endelige koncentration tages til 2%).
FORSIGTIG: Paraformaldehyd er giftigt. Det bør ikke blandes med klorbaserede desinfektionsmidler. - Pellets cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter, kassér supernatanten og suspender cellepelleten i 200 μL PBS eller alternativ flowcytometribuffer. Analyser for RFP eller YFP efter behov ved flowcytometri. Normaliser infektiviteten af en given virusbestand mod værdier for en bestand af kendt infektivitet.
BEMÆRK: VLP kan også normaliseres ved p24 enzymbundet immunosorbentassay (ELISA); Dette er dog ikke nødvendigvis en god indikator for VLP-infektivitet, især hvor VLP-bestande fremstilles i forskellige transfektioner. Offentliggjorte median vævskultur infektiøs dosis eller multiplicitet af infektion (TCID50 / MOI) metoder11 kan også give relativ kvantificering, selv om disse ikke er veletablerede for MLV. Relativ fluorescens giver et omkostningseffektivt alternativ til kommercielle revers transkriptase ELISA-metoder.
- Fjern mediet ved omhyggelig pipettering eller aspiration. Cellerne vaskes forsigtigt med 250 μL fosfatbufferet saltvand (PBS). Fjern cellerne fra pladen ved at pipettere op og ned med 250 μL PBS, og overfør dem til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 250 μL 4% paraformaldehyd (idet den endelige koncentration tages til 2%).
3. Transduktion af U937 med VLP, der udtrykker SAMHD1 og YFP
BEMÆRK: Trin 3-6 udgør begrænsningseksperimentet. Dage er nummereret for at lette planlægningen.
- Dag 1 (eftermiddag): Optø VLP til transduktion inklusive MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (positiv kontrol), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (negativ kontrol) og variant MLV-SAMHD1-YFP (eksperimentelle prøver). Fortynd den normaliserede VLP til et slutvolumen på 500 μL med Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) i et mikrofugerør, tilsæt 0,5 μL polybren (10 mg / ml), og bland ved at svirpe.
- Hvis VLP ikke kan titreres på forhånd, skal du bruge 100 μL i første omgang. Brug et maksimalt 1: 1-forhold mellem VLP og RPMI for at begrænse VLP-induceret toksicitet. Målet er ca. 30 % transduktion.
- Aliquot 5 x 105 U937 celler i et sterilt mikrofugerør for hver transduktionstilstand. Pellet ved centrifugering ved 500 x g i 5 min., og fjern supernatanten (inkluder to yderligere rør som utransducerede kontroller for flowcytometri). Resuspender cellepelleten i 500 μL fortyndet VLP (eller RPMI til utransducerede kontroller) og overføres til en brønd af en 24-brøndsplade.
- Spinoculate i en bordpladecentrifuge ved 800 x g i 90 minutter ved 20 °C. Tilsæt 1 ml 37 ° C RPMI til brønden og lad det komme sig i en 37 ° C inkubator i 3 dage.
4. Differentiering af transduceret U937
- Dag 4 (morgen): Suspender cellerne igen ved forsigtigt at pipettere og overføre 350 μL til hver af 4 brønde i en 12-brønds plade. Der tilsættes 700 μL 37 °C RPMI indeholdende 150 nM PMA til hver brønd, hvilket giver en endelig koncentration på 100 nM, og der tillades differentiering i 3 dage.
BEMÆRK: PMA købes som pulver og skal resuspenderes til 1 mM i DMSO og opbevares i mørke. En arbejdsbestand på 100 μM skal fremstilles ved at fortynde 1/10 fra 1 mM-stammen med DMSO.
5. Infektion af differentieret, SAMHD1-ekspressiv U937 med HIV-RFP
- Dag 7: Overhold cellerne ved mikroskopi. Sørg for, at cellerne er klæbende. Aspirer medierne fra alle brønde, tilføj 1 ml RPMI til brønd 1 af hvert sæt på 4, hvilket giver mulighed for utransduceret, uinficeret kontrol samt enkeltfarvekontroller. Tilføj 0,5 ml RPMI indeholdende ca. 10 μL HIV-1-RFP (ca. 10 ng p24 som vejledning) til alle de andre brønde. Mål for ca. 50% infektion.
- Dag 8 (morgen): Tilføj 0,5 ml RPMI til hver af de inficerede brønde.
6. Analyse af flowcytometri
BEMÆRK: Det er god praksis at inkludere en levende død plet i flowcytometrirørledninger. Men hvis U937-cellerne er af god kvalitet, kan dette trin udelades uden negative konsekvenser for downstream-analyse. Skånsom pipettering af trypsiniserede celler bør let resultere i en enkelt cellesuspension.
- Dag 10 (morgen): Aspirer medierne fra brøndene og vask en gang med PBS. Tilsæt 300 μL celledissociationsenzym (eller trypsin) i 5-10 min. Tilsæt yderligere 300 μL PBS, suspender grundigt og sørg for, at alle cellerne er kommet ud af pladen, og overfør til flowcytometrirør.
- Tilsæt 300 μL 4% paraformaldehyd (idet den endelige koncentration bringes til 2%). Pellets cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter, kassér supernatanten og suspender cellepelleten i 200 μL PBS eller alternativ flowcytometribuffer. Analyser ved flowcytometri.
BEMÆRK: Nedenstående trin er for en Fortessa-analysator, men tilsvarende analyse kan opnås ved hjælp af enhver analysator, der er i stand til at læse RFP og YFP-fluorescens. Kontakt lokal flowcytometri support eller anden erfaren forsker, før du opretter en flowcytometrianalyse. Når mange prøver skal screenes på samme tid, kan en prøveudtager med høj kapacitet være passende. I dette tilfælde anbefales et større celleantal og volumen.
7. Flowcytometrianalyse
- Tænd cytometeret 10 min før det er nødvendigt, og tænd for computeren. Kontroller, at affaldet er tomt, og at kappetanken er fuld.
- Log ind på maskinen, og åbn analysesoftwaren.
- Flyt armen til siden, tag vandrøret af, indstil strømningshastigheden til Høj , og tryk på Prime. Vent på, at lyset slukkes, og gentag tre gange mere.
- Sæt vandet på igen og løb højt i 3 minutter, og skift derefter til Lav , og tryk på Standby , indtil du fortsætter til anskaffelse.
- I mellemtiden opsættes eksperimentet i softwaren:
- Vælg Eksperiment/Nyt eksperiment (navn i henhold til lokal vejledning). I inspektøren skal du slette de ikke-krævede fluorkromer og efterlade Blue Laser 530/30 og Yellow Laser 610/20 eller de anbefalede laser- og filterkombinationer til YFP og RFP til maskinen.
- Højreklik på eksperimentet, og vælg Cytometerindstillinger / Applikationsindstillinger / Opret regneark. Opret et Forward Scatter-Area (FSC-A)/Side Scatter Area (FSC-A) dot blot og YFP-histogram, RFP-histogram og GFP/YFP-prikplet i regnearket ved at klikke på det tilsvarende ikon og ændre akserne ved at klikke på akseetiketten.
- Højreklik igen på Eksperiment og tilføj ny prøve. Omdøb efter behov. Åbn prøven ved at klikke på plustegnet for at afsløre et nyt rør.
- Åbn anskaffelsesdashboardet fra Vis, indlæs det ikke-inficerede, ikke-transducerede kontrolelement, og tryk på Indhent. Juster FSC- og SSC-spændinger i instrumentbrættet for at placere celler i nederste venstre kvadrant (ingen celler på akserne). Port omkring denne befolkning P1. Højreklik på andre plots og vælg vis P1 for at fjerne snavs fra efterfølgende analyse.
- Indlæs enkeltfarvekontrollen til YFP (kun wild-type SAMHD1), og erhverv. Juster YFP-spændingen i instrumentbrættet, så de mest fluorescerende celler er inden for detektorens rækkevidde (ikke på kanten af aksen). Gentag for RFP-kontrol med en enkelt farve.
- Kør automatisk kompensation ved hjælp af de ikke-transducerede, uinficerede og enkeltfarvede kontroller.
- Vælg Eksperiment > Kompensationsopsætning > Opret kompensationskontrolelementer i menuen for at skifte til et normalt regneark. Vælg ufarvet normalt regneark, tryk på Kør og hent for den ikke-farvede kontrol.
- Tegn en port rundt om de intakte celler (P1) og optag. Fjern røret, og sæt maskinen på standby. Højreklik på P1, klik på Anvend på alle kompensationskontroller.
- Skift til det normale RFP-regneark, og tryk på Kør. Optag den enkeltfarvede RFP-kontrol, og sæt maskinen på standby. Softwaren skal automatisk vælge den positive befolkning.
- Gentag for YFP-enkeltfarvekontrol. Vælg Eksperiment > kompensationsopsætning > beregne kompensation > sammenkæde og gemme.
- Skifte til det globale regneark. Anskaf cellerne transduceret med vildtype SAMHD1, inficeret med HIV-RFP, og kontroller, at fire forskellige populationer kan ses i hjørnerne af kvadranterne, der er justeret lodret og vandret for henholdsvis YFP og RFP. Fjern røret, og tryk på Standby.
- Genindlæs den uoverførte, uinficerede prøve, tryk på Kør og Optag 30.000 hændelser med P1 som stopport. Gentag for de resterende prøver (herunder andre kontroller). Omdøb eksemplerne, mens du kører, eller post hoc. Når de er eksporteret, kan filer ikke omdøbes.
- Eksporter dataene som .fcs-filer, og rengør fluidikken i henhold til lokale instruktioner.
8. Dataanalyse
BEMÆRK: De følgende trin svarer til analyse i FlowJo v10; Tilsvarende trin kan dog let udføres i anden analysesoftware.
- Åbn softwaren, og træk alle .fcs-filer ind i instrumentbrættet. Vælg kompensationskontrolelementerne, og træk dem til undermappen kompensation. Åbn filen for det uoverførte, uinficerede rør ved at dobbeltklikke, hvilket vil åbne FSC-A / SSC-A-plottet.
- Vælg polygonværktøjet og porten på den intakte cellepopulation, undtagen snavs i nederste venstre hjørne. Navngiv denne celle. Træk denne port til hele populationen af rør i bjælken Alle prøver . Rul gennem hver enkelt prøve ved hjælp af de vandrette pileknapper for at sikre, at gating er passende for hvert rør.
- Dobbeltklik på cellepopulationen for den uoverførte, uinficerede prøve, og juster akserne til FSC-højde (H) vs FSC-område (A). Vælg den enkelte store population ved hjælp af en rektangulær port for at udelukke dubletter. Softwaren foreslår automatisk at navngive denne enkeltceller.
- Træk denne port til alle cellepopulationerne , og kontroller igen, at gatingen er passende for alle prøver. Vælg enkeltcellepopulationen for den uinficerede, uoverførte prøve, skift akserne til kompenseret blå laser (y , YFP) versus kompenseret gul laser (x, RFP). Tryk på T på aksen, og vælg Bieksponentiel skala for x og y.
- Vælg kvadrantgitterværktøjet , og klik øverst til højre på den negative cellepopulation. Anvend denne foreløbige gating på alle enkeltcellepopulationer ved at trække ind på linjen Alle prøver . Hvis kvadrantportene ikke adskiller populationerne på tilfredsstillende vis, kan det være nødvendigt at gate individuelle kvadranter ved hjælp af polygonværktøjet, som i figur 2.
- Rul til den vilde SAMHD1-prøve (kun YFP), og kontroller, at gating mellem den ikke-transducerede (YFP-negative) og YFP-positive er korrekt. Det kan hjælpe at skifte til konturvisning for at skelne negativt fra svage YFP-celler. Hvis YFP +ve-cellerne øverst er spredt bredt, skal du justere den øverste lodrette port til højre.
- Rul gennem alle prøver, og kontroller gating med hensyn til YFP-positivitet. Brug den bedste opdeling mellem YFP-negativ og positiv, der gælder for alle prøver.
BEMÆRK: Kompensationen vil være beregnet ud fra wild-type SAMHD1 YFP-ekspressionsniveauet. Hvis infektionsniveauerne er meget forskellige mellem forskellige SAMHD1-YFP-transducerede celler, skal kompensationen muligvis justeres. Det foretrækkes derfor, at YFP VLP normaliseres inden brug. - Rul til det uoverførte, HIV-RFP-inficerede rør, og kontroller, om gating mellem uinficeret RFP-negativ og inficeret RFP-positiv er korrekt. Juster efter behov ved hjælp af konturvisningen, hvis det er nødvendigt, og rul gennem de resterende prøver for at kontrollere, at gating er gyldig for alle prøver.
- Hver prøve kræver dobbelt negativer (Q4: nederst til venstre, utransduceret, uinficeret), YFP-positiv (Q1: øverst til venstre, SAMHD1-udtryk, uinficeret), RFP-positiv (Q3: nederst til højre, utransduceret, HIV-inficeret) og dobbelt positiv (Q2: øverst til højre, SAMHD1 udtrykker HIV-inficeret). Åbn tabeleditoren ved at klikke på ikonet og træk de fire kvadrantporte ind i instrumentbrættet. Vælg Excel Export og klik på Opret tabel. Gem det genererede regneark i henhold til lokale filnavngivningskonventioner.
- For at eksportere repræsentationer af plots og gating-strategier skal du klikke på ikonet Layout Editor . Vælg hver population, og træk ind i editoren med de akser, mærkning og afstand, der kræves.
- Hvis du vil oprette et layout med de samme plots vist for alle eksempler, skal du markere én kolonne og trykke på Batch. Tryk på Skaler til Bredde og derefter Undgå sideskift. Gem i det krævede filformat.
- I det eksporterede regneark beregnes begrænsningsforholdet ved at generere kolonner med procentvis RFP af YFP-ves (RFP + ve / (dobbelt negativer + RFP + ve)) og procent RFP af YFP + ves (dobbelt positive / (dobbelt positive + YFP + ve)) og derefter en sidste kolonne på (% RFP af YFP + ve / % RFP af YFP-ve), se figur 1. Gennemsnit replikeringsdataene for hver SAMHD1-konstruktion, og beregn, om begrænsningsværdier for testede SAMHD1-varianter er væsentligt forskellige fra vildtype og / eller 206-7AA ved hjælp af passende dataanalysesoftware.
Representative Results
Resultaterne af analysen ovenfor bør give et restriktionsforhold på 0,25 eller lavere for vildtypen SAMHD1-positiv kontrol og 1,0 for den negative kontrol. Hvis disse to kvalitetskontroller er gyldige, skal du overveje den statistiske signifikans af resultaterne. SAMHD1-varianter, der ikke viser nogen signifikant forskel fra vildtype, bærer derfor substitutioner, som ikke påvirker SAMHD1-begrænsningen i denne sammenhæng. De, der adskiller sig væsentligt fra vildtype, viser nedsat begrænsning. Hvis disse ikke er væsentligt forskellige fra den negative kontrol, mangler de evnen til at begrænse i denne sammenhæng (figur 4 venstre paneler).
Hvis vildtypen SAMHD1-begrænsningsværdien er større end 0,3, kan resultaterne for testvirus være vejledende, men kan ikke stole på. Ineffektiv begrænsning af vildtypeprotein kan skyldes, at U937-celler bruges for tidligt efter rekonstitution (inden for 2 uger), eller når de er for gamle (>2-3 måneder). Disse parametre skal muligvis bestemmes empirisk for en given cellestamme. Jo lavere passagen er, jo mere pålideligt differentierer cellerne sig typisk og giver derfor det rette miljø for SAMHD1-begrænsning. Uhensigtsmæssigt infektionsniveau med enten SAMHD1-YFP eller HIV-RFP kan også resultere i vanskeligheder med både kompensation og downstream-bestemmelse af begrænsningsforhold. Et eksempel er illustreret i højre panel i figur 4.
Hvis den negative kontrol afviger fra 1,0 (uden for intervallet 0,9-1,2), kan dette indikere et problem med analysen, enten andelen af inficerede celler, gating-strategi eller cellernes sundhed påvirker analysen. Se NOTER ovenfor.
Figur 1: Skematisk skitserende protokol. VLP, viruslignende partikler, PMA, phorbol myristateacetat. Nummererede faser svarer til trin i protokollen. Figur produceret ved hjælp af BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk over retrovirale plasmider . (A) Emballagevektorer (B) Overførselsvektorer (C) VSV-G konvolutekspressor. Nøglekodning og lovgivningsmæssige elementer vises. For detaljer henvises til materialetabellen. CMV IE: cytomegalovirus øjeblikkelig-tidlig promotor, BGH: kvægvæksthormon, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: sammensat CMV-HIV-1 LTR-promotor, Psi: HIV-1 emballagesignal, cPPT / CTS: central polypurinkanal / central termineringssekvens, SV40: simian vakuolerende virus 40. Figur produceret ved hjælp af BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gatingstrategi for flowcytometrianalyse. (A) Kompensationskontroller: venstre panel viser FSC-A/SSC-A-gating på celler i takt for den utransducerede, uinficerede kontrol. Centrale og højre paneler viser skærmbilleder af enkeltfarvekompensationskontroller for YFP (midt) og RFP (højre) med ukompenserede data i sort og kompenseret i blåt. (B) Tilsvarende kompensationsmatrix og parceller til kompensationskontrol ovenfor. (C) Gating-strategi. Affald elimineres gennem analyse af alle celler af FSC-A / SSC-A (venstre panel). Dubletter er udelukket ved gating på FSC højde versus areal (centralt panel). Højre panel viser et eksempel på HIV-1-begrænsning ved vildtype SAMHD1. Akser viser kompenseret blå og gul laserfluorescens svarende til henholdsvis YFP (SAMHD1) og RFP (HIV) -positive celler. Kvadrantporte tegnes gennem sammenligning af negative og enkeltfarvede kontroller for RFP og YFP. Tal angiver procentdel af forældrepopulationen. Kompensationsværdier for YFP med GFP vil være meget højere, men mulige at diskriminere ved hjælp af passende filtersæt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forventede resultater: ideelle versus suboptimale data. (A) Repræsentative YFP/RFP-plots for optimale (venstre) og suboptimale (højre) data. Tal angiver procentdel af forældrepopulationen. I højre panel er hiv-infektionen for lav, hvilket skaber vanskeligheder med kompensation og gating. Restriktionsgraden er højere end forventet på 0,5. (B) Områder med begrænsningsforhold for varianter af SAMHD1 med hensyn til vildtype (WT, rød) eller negativ kontrol (HD206-7AA, sort) genereret ved hjælp af statistisk software. Hvert punkt repræsenterer en replikatværdi. Middel- og standardafvigelse vises. Parrede t-tests mellem hver gruppe var signifikante i alle tilfælde, hvor de blev vist. Til venstre: Ideelle data - WT viser den forventede begrænsning på ca. 0,2, negativ viser 1,0. Varianten R372D (grå) er væsentligt forskellig fra WT, men ikke signifikant fra den negative kontrol og har dermed mistet evnen til at begrænse. Til højre: Suboptimale data. Her opfører det negative sig som forventet, men i alle seks replikater viser WT kun en restriktionsgrad på 0,5 på grund af lav infektionsrate. Den lave varians inden for grupperne betyder, at R143H viser en mellemliggende fænotype, der er statistisk forskellig fra WT og negativ, mens G209S ikke begrænser; Dette bør dog gentages med friske celler, da den positive kontrol ikke har givet det forventede begrænsningsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Som diskuteret i noterne ovenfor er de kritiske aspekter af protokollen centreret omkring fastholdelse af den korrekte cellefænotype til VLP-produktion og for at skabe det passende miljø til overholdelse af SAMHD1-begrænsning. For det første er den nøjagtige analyse af begrænsning ved tofarvet flowcytometri afhængig af at opnå passende proportioner af transducerede og inficerede celler, så der er nok celler i hvert område af plottet til analyse. Som sådan bør forskeren sigte mod en MOI på mindre end 1 (se protokollen). Transduktions- og infektionsrater, der enten er for høje eller for lave, fører til problemer med analyse på grund af mangel på uinficerede eller dobbelt inficerede celler. Ligeledes er en lignende transduktionshastighed for SAMHD1-vektorer, der skal sammenlignes, nøglen til at tillade, at den samme kompensationsmatrix og gating anvendes på hele eksperimentet, hvilket øger tilliden til den efterfølgende analyse.
For det andet er alderen på de anvendte U937-celler en nøglefaktor for, om de differentierer sig med succes. Vellykket differentiering kan overvåges gennem observation af overholdelse, en reduceret forsuring af medierne over tid efter differentiering og tilstrækkelig begrænsning af vildtypepositiv kontrol i analysen. Differentiering på op til 5 dage har været en succes.
En af de vigtigste fordele ved dette assay er dets fleksibilitet. En række modificerede versioner af SAMHD1 (domæner, aminosyrer, artssekvenser) kan testes via simpel stedstyret mutagenese af vektoren eller kloning. Ligeledes kan varianter af testervirus udforskes. Analysen er tidligere blevet brugt til at demonstrere, at HIV-1 reverse transkriptasemutanter med nedsat kapacitet til at binde dNTP er mere følsomme over for SAMHD1-begrænsning. Det samme princip kan bruges til at teste begrænsningen af andre vira af SAMHD1. Desuden kan varierende differentieringsbetingelser eller kunstig manipulation af intracellulære dNTP-koncentrationer bruges til yderligere at undersøge interaktionen mellem intracellulære tilstande og SAMHD1-aktivitet, et område med aktiv forskning i Bishop-laboratoriet. Samhd1's interaktion med forskellige nukleosid reverse transkriptasehæmmere er også blevet beskrevet, og effekten af SAMHD1 vist ved anvendelse af dette assay modificeret til brug i primære celler12,13,14,15.
Tilpasning af protokollen til brug i primære celler overvinder den begrænsning, der er forbundet med at undersøge metaboliske fænotyper i transformerede celler. Det eksisterende format giver imidlertid mulighed for en praktisk og mindre teknisk udfordrende protokol til analyse med høj kapacitet, især ved brug af et flowcytometer med en prøveudtager med høj kapacitet. Ved tilpasning af protokollen bør de internt utransducerede cellers modtagelighed for tilskuereffekter (f.eks. immunsignalering) overvejes.
Som med mange aspekter af cellebiologi er det vigtigt, at sådanne assays bruges som en del af en holistisk tilgang til forståelse af et givet fænomen. Den parallelle anvendelse af biokemiske assays til SAMHD1-aktivitet16, kvantificering af intracellulære dNTP-puljer og observation af SAMHD1-mutante fænotyper hos mennesker, ex vivo og i dyremodeller (udføres af laboratorier rundt om i verden, nogle beskrevet i dette nummer) er nøglen til den udviklende forståelse af dette komplekse protein.
Disclosures
Med henblik på Open Access har forfatterne anvendt en CC BY offentlig copyright-licens til enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der stammer fra denne indsendelse. De synspunkter, der udtrykkes, er forfatterens (e) og ikke nødvendigvis NIHR's eller Department of Health and Social Care.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Francis Crick Institute, som modtager sin kernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001042 og FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 og FC001162) og Wellcome Trust (FC001042 og FC001162) og af en Wellcome Trust Investigator Award til JPS (108012 / Z / 15 / Z). Arbejdet ved University of Cambridge blev medfinansieret af NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) og UK Medical Research Council (MR/S009752/1). Sidstnævnte britisk finansierede pris er en del af EDCTP2-programmet, der støttes af Den Europæiske Union.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
