Summary
בלוטות הרוק הוצעו כאתר יעד לרקמות לטיפול גנטי, במיוחד בתחום החיסון על ידי העברת גנים. אנו מדגימים אספקת גנים במודל פרימטים לא אנושיים המשתמש בעירוי פרוטידים מדרדר.
Abstract
בלוטות הרוק הן יעד רקמות אטרקטיבי לטיפול גנטי עם תוצאות מבטיחות כבר מוביל לניסויים בבני אדם. הם מסוגלים מטבעם להפריש חלבונים למחזור הדם והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם לאתרי רקמות מעולים פוטנציאליים לייצור הורמונים חלופיים או חיסון על ידי העברת גנים. שיטות מוצעות להעברת גנים כוללות הזרקה עורית ועירוי מדרדר דרך צינורות רוק. אנו מדגימים כיצד לבצע עירוי בלוטת הרוק מדרדר (RSGI) בפרימטים שאינם אנושיים. אנו מתארים את ציוני הדרך האנטומיים החשובים כולל זיהוי של הפפילה הפרוטידית, שיטה אטארומטית של שינון ואיטום צינור סטנסן תוך שימוש בכלים דנטליים בסיסיים, צינורות פוליאתילן ו cyanoacrylate, ואת השיעור המתאים של עירוי. אמנם זוהי שיטת המסירה הפחות טראומטית, אך השיטה עדיין מוגבלת על ידי הנפח המסוגלת להימסר (<0.5 מ"ל) והפוטנציאל לטראומה לצינור ובבלוטות. אנו מדגימים באמצעות פלואורוסקופיה כי אינפוזאט יכול להיות מועבר באופן מלא לתוך הבלוטה, ולהדגים עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה את transduction של וקטור טיפוסי ביטוי של הגן נמסר.
Introduction
בעוד בלוטות הרוק ידועים בייצור האקסוקריני שלהם של רוק, חוקרים מזה זמן רב זיהו את יכולתם להפריש חלבונים ישירות למחזור הדם 1 , מהשהופךאותם למטרה פוטנציאלית לטיפול גנטי לניהול מערכתי, כגון הורמונים חלופיים או ייצור נוגדנים. למעשה, בלוטות הרוק מציעות מספר יתרונות על פני מטרות רקמות אחרות, כגון היכולת הטבועה לייצר חלבונים להפרשה (חסר שרירי רכוש), אנקפסולציה כבדה שיכולה להגביל דיפוזיה וקטורית, ורקמות מובחנות היטב המספקות יציבות לווקטורים שאינם משתלבים. יתר על כן, במקרה של אירוע לוואי חמור, בלוטות הרוק אינן קריטיות לחיים וניתן להסירן בניתוח. אמנם לא אינטואיטיבי מיד, בלוטות פרוטידים נגישים גם מהפה דרך צינור ההפרשה הראשי שלהם, צינור2של סטנסן .
בהתחשב ביתרונות של רקמת הרוק לטיפול גנטי, יש עניין גובר לחקור את יעד הרקמה הזה. מחקרים רבים כבר בוצעו במודלים של מכרסמים, כלבים ופרימטים לא אנושיים ולפחות ניסוי קליני אחד בבני אדם נמצא בעיצומו3,4,5. כדי להמשיך לחקור ולפתח את התועלת של יעד רקמות זה למטרות ריפוי גנטי, יותר מחקרים פרימטים שאינם אנושיים יצטרכו להתבצע. מאמר זה מתאר שיטה לגישה לבלוטות הפרוטידים דרך צינור סטנסן כדי לספק גן וקטורי להחלפת מודל הפרימטים הלא אנושי. כדי להדגים באופן ניכר את המסירה של infusate ואת האנטומיה של הצינור כפי שהוא נכנס בלוטה, פלואורוסקופיה באמצעות radiocontrast בוצע. כדי להדגים טרנסולציה מוצלחת של וקטור, נעשה שימוש בגן egfp וקטורי של אדנווירוס 5 (Ad5). Ad5 הוא וקטור מתואר היטב המסוגל לבצע חילוף של רקמת רוק. למרות שזה אימונוגני מדי לשימוש קליני אולטימטיבי, וקטור Ad5 נבחר למחקר הדגמה זה כדי להבטיח טרנסולמה יעילה. הערכת ייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) היא שיטה המתוארת היטב כדי להדגים שעתוק ותרגום מוצלחים של גן וקטורי לאחר התמרה ונעשה כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בקמפוס קלרקסון של בית הספר לרפואה ווייק פורסט ללימודי בעלי חיים. הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) התייעצה משיקולים אתיים ופרטי ההליכים הוגשו לעיון. Wake Forest IACUC אישר את פרוטוקול המחקר שלנו וכל ההליכים נעשו תחת פרוטוקול שאושר על ידי IACUC #A17-147.
1. הכנת מכשיר העירוי
- חותכים את גודל 10 צינור פוליאתילן (PET10) לאורכים של 25 ס"מ באמצעות זוג מספריים.
- סמן PET10 ב 1 ס"מ ו 2 ס"מ מקצה אחד באמצעות סמן שחור.
- מילוי מראש 0.5 מ"ל של פתרון Ad5-EGFP (109 חלקיקים ויראליים / מ"ל) לתוך מזרק 1 מ"ל (שחפת).
- החלק קצה לא מסומן של צינור PET10 מעל מחט 29-31 G מחובר מזרק. בדרך כלל קל יותר לבצע משימה זו תחת הגדלה.
- להחדיר את הפתרון לתוך PET10 עד הצינור מלא לחלוטין (טיפה גלויה בקצה חופשי).
- השתמש PPE סטנדרטי מלא, כולל סקראבס כירורגי, שמלה עם שרוולים ארוכים, כפפות בלתי חדירות, מסכה כירורגית, מגן פנים, מצנפת שיער וכיסויי נעליים.
2. הכנת החיה
הערה: מקוק Cynomolgus שימש להדגמת הווידאו. האנטומיה של פרימטים לא אנושיים ואנושיים אחרים דומה מאוד, והפרוטוקול צריך להיות מתורגם למינים אחרים.
- הזריקו תת עורית 0.05 מ"ג/ק"ג אטרופין 15 דקות לפני ההליך כדי למזער הפרשות רוק ולייעל את ההפצה והשימור של אינפוסאט.
- ספק הרדמה באמצעות מזרקי 5 מ"ל עם קטמין תוך שרירי / midazolam (10-15 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו 0.01-0.05 מ"ג / קילוגרם של midazolam). אשר הרדמה נאותה כאשר החיה מסוממת הופכת מחוסרת הכרה ואינה מסוגלת להגיב לגירויים.
3. ביצוע ההליך
- השתמש במשחזרים אוראליים כדי להכין את הפה הפתוח.
- מניחים את משטח הגומי של קצה אחד של המפסק על החיך הקשה שמאחורי השיניים העליונות בצד הפה מול הבלוטה כי יהיה חדור. מניחים את משטח הגומי של הקצה השני על הכלב התחתון באותו צד כמו המפסק העליון. אפשר בעדינות לפעולת האביב של המפסק להתרחב ולפתוח את הפה.
- זהה את הפפילה הפרוטידית, פתח צינור סטנסן, על הלחי האחורית, בסמוך לטוחנת העליונההשנייה. זה הוא הדמיה הטובה ביותר באמצעות לולאות שיניים להגדלה.
- מרחיבים בעדינות את הפפילה הפרוטידית בנקודה של מרחיב החרוט. עדיף למקם את הנקודה של המפרש למרכז או הפתיחה של הפפילה ולאחר מכן בעדינות לסובב אותו קדימה ואחורה. הנקודה צריכה לאט להיכנס הפפילה ולהרחיב אותו על פני כ 20 - 30 s של סיבוב עדין.
- הכנס את צינורות PET10 לתוך פפילה פרוטידית המוחלפת. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי החזקת הקצה המסומן של צינור PET10 עם פינצטה כ 0.5 ס"מ מן הקצה דיסטלי בעדינות החדרת קצה הצינור לתוך הפפילה המוגברת.
- לקדם בעדינות את הצינור, אשר לעתים קרובות מקל על ידי תנועות סיבוב קטנות כדי לעזור להחליק את הצינור, ואחריו הסתגלות מחדש של פינצטה 0.5 ס"מ קרוב לאחיזה הקודמת. חוזרים על הפעולה עד שסימן 2 ס"מ מגיע לפפילה הפרוטידית.
- החל ציאנואקרילט על הלחי סביב הפפילה והצינור המוחדר ולחכות שהוא יתייבש (לא נרשמה כמות ספציפית, רק מספיק כדי לאטום את הכניסה של פפילה צינור של סטנסן). זה בדרך כלל לוקח פחות מדקה ומסייע לאטום את הפפילה הפרוטידים ולהפחית שפיכה של infusate בחזרה בחלל הפה.
- לדחוף לאט את תוכן המזרק מעל 5 דקות בקצב של 100 μL / min. קצב עירוי איטי זה ממזער את הסיכון לפגיעה בצינור עקב עלייה פתאומית בלחץ תוך-צינורי.
- השאירו PET10 במקום לפחות 5 דקות לאחר עירוי הושלם. שמור את הצינור אטום ולאפשר infusate להישאר בבלוטה פרוטיד.
- הסר PET10 עם אחיזה עדינה. הציאנואקרילט ישתחרר עם הצינור.
- חזור על שלבים 3.2 עד 3.8 בצד הנגדי.
- לשחרר לאט מפסקים אוראלי לאחר שני פרוטידים כבר חדורים ושני צינורות PET10 הוסרו.
הערה: כל ההליך עבור שני הצדדים צריך לקחת פחות מ 30 דקות.
4. טיפול פוסט-פרוצדורלי
- לאחר עירוי הושלם ואת הצינור של סטנסן decannulated, להתבונן בבעלי חיים עד אפקט הרדמה פג (בדרך כלל בין 20-30 דקות לאחר ההליך).
- הצע לבעלי החיים משקאות ולאחר מכן מזון לאחר שהם ערים לחלוטין ולחדש את הטיפול השגרתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך מוצלח, התמרה ותעתיק
איור 1 מציג את הפאפילה הפרוטידית הצמודה לאוחנתהשנייה על הלחי העליונה האחורית. התמונה מציגה גם את המיקום הנכון של סד הפה, קצה גומי אחד על החיך הקשה ואת קצה הגומי השני על הכלב ipsilateral. איור 2 מציג תמונה שצולמה לאחר שינון מוצלח של הפפילה הפרוטידית בסימן 2 ס"מ ב-PET10. איור 3 מציג תמונה פלואורוסקופית ברגע של עירוי רדיו-קונטרסט המדגים הסתעפות של הפתרון דרך צינור סטנסן ולתוך בלוטת הפרוטידים. תמונה פלואורוסקופית זו בוצעה מתוך כוונה בלעדית להדגים את האנטומיה וההפצה של אינפוזאט. פלואורוסקופיה אינה נדרשת בעת ביצוע הליך זה עבור משלוח וקטור. איור 4 מראה EGFP חיסוני באדום על היסטופתולוגיה. הן תאים דביקים והן תאי סינאר הוכתמו באדום, מה שמצביע על התמרה ותעתיק מוצלחים בשני סוגי התאים. לסיכום, ארבע דמויות אלה מדגימים RSGI מתאימה עם הדמיה של האנטומיה ושל התמרה של Ad5 וקטור EGFP.
איור 1:פאפילה פרוטידית. שימו לב לעיגול על הדמות המדגישה את הפפילה הפרוטידית הצמודה לאוחנתהשנייה על הלחי האחורית. שימו לב גם למיקום סד הפה, עם קצה גומי אחד על החיך הקשה והגומייה השנייה על הכלב התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קנוניציה של פאפילה פרוטידית מאת PET10. שימו לב לסימן 2 ס"מ בצינור PET10 הנראה בפפילה הפרוטית (ראש חץ), הממוקמת על הלחי האחורית, בסמוך לטוחנת העליונההשנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונת פלואורוסקופיה המציגה דיפוזיה לבלוטת הפרוטיד. הערה המסתעפת בסוף הצינור של סטנסן (ראש חץ) כשהיא מסתעפת לצינורות קטנים יותר בבלוטת הפרוטיד (מעגל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שקופית פתולוגית של בלוטת הפרוטיד. הערה ביטוי של EGFP (מוכתם באדום) על ידי רקמת פרוטיד דביק / acinar. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול של עירוי מדרדר לתוך בלוטת הפרוטיד דרך צינור סטנסן. המתודולוגיה המתוארת מציעה הדרכה שיכולה לשמש חוקרים החוקרים את התועלת של רקמת הרוק כאתר לטיפול גנטי ויישומים אחרים.
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת ההליך. בראש ובראשונה, יש להשלים בעדינות את כל השלבים הפרוצדורליים. חיבוק חזק של הפה יכול לגרום לתת-חלוקה של הלסת התחתונה. קנון כוחני של פפילה פרוטידית או עירוי מהיר של הפתרון לתוך צינור של סטנסן עלול לגרום דמעות דביקות חריפות או היצרות דביקה כרונית.
שנית, ודא כי הרדמה כבר מנוהל והוא יעיל. ללא הרדמה נאותה, אף אחד מהצעדים לא יכול להתבצע בקלות ואת הסיכון של פציעות בעלי חיים ובני אדם גדל באופן משמעותי. בחרנו בהרדמה תוך שרירית עם קטמין ומידזולם, שהוא משטר סטנדרטי במחקרי פרימטים לא אנושיים6. אנו רואים אטרופין להיות חשוב להפחתת הפרשות הרוק במהלך ההליך, שיפור הנראות של האנטומיה והפחתת שטיפה של infusate לפני עירוי7,8.
צעד שלעתים קרובות מאתגר הוא השיפוע הראשוני והתקדמות של PET10 לתוך הפפילה הפרוטית וצינור סטנסן. סיבוב עדין של PET10 תוך החדרה מקל על שלבים אלה. דחיפה מוגזמת עלולה להוביל לפציעות דביקות.
ההליך מוגבל בעיקר על ידי שבריריות וגודל הרקמה. זה דורש טכניקה עדינה מאוד ושימוש בלולאות מגדלות וכלים קטנים כדי להבטיח cannulation כראוי, התקדמות של צינורות ואספקה של infusate. מגבלה פוטנציאלית נוספת היא נפח של infusate כי בלוטות הפרוטיד מסוגלים להכיל. מחקרים קודמים החדירו נפח מרבי של 0.5 מ"ל לכל בלוטת פרוטיד, בהיקף של 1 מ"ל לכל חיה6,9,10. אמנם זה לא משפיע ישירות על ההליך עצמו, בהתאם לריכוז התרופה infusate, זה עשוי להוכיח מגביל עבור האפקט הפיזיולוגי הרצוי.
RSGI מציעה את האפשרות הפחות טראומטית אם עירוי בלוטת הרוק הוא הרצוי. חלופות כגון זריקות עוריות או מונחות ארה"ב נושאות את הסיכון לפגיעה בעצבי הפנים. יתר על כן, הליכים אלה עלולים להיכשל להשיג הפצה נאותה בלוטה כולה, בעוד RSGI משתמש במערכת הצינור כדי להבטיח הפצה. Fluoroscopy בוצע עם פתרון רדיו-קונטרסט סטנדרטי אך ורק לצורך מאמר זה כדי להוכיח כי RSGI מספק אינפוזיט מלא עם הפצה טובה בכל הבלוטה. זה בוצע בנפרד מן עירוי בפועל של וקטור Ad5. פלואורוסקופיה ו/או הדמיית רנטגן אחרת המבוצעת במהלך RSGI להעברת וקטורים גנטיים לא תהיה מועילה ואינה מומלצת.
כמו תחום טיפולית על ידי העברת גנים ממשיך להתפתח, בלוטות הרוק כמו רקמת היעד כבר צובר פופולריות2,5. Ponzio ואח ' מציעים סקירה נהדרת על היתרונות של בלוטות הרוק כיעדים לחיסון4. כמו אנקפסולציה, רקמת בלוטות לא חיוני אשר הדגמנו נגיש בקלות, בלוטות הפרוטידים מהווים פלטפורמה אידיאלית לטיפול גנטי. RSGI מציעה את הטכניקה הפחות טראומטית להעברת גנים לבלוטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למר קגני ג'נטרי על תמיכתו האודיו-קולית בצילומי ההליך. אנחנו גם רוצים להכיר במרכז הרפואי הפנר VA לתמיכה אקדמית במרדף אחר פרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
