Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ऊतक में प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति की स्थानिक प्रोफाइलिंग: वर्चुअल माइक्रोडिसेक्शन को ठीक करने के लिए एक दृष्टिकोण

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/62651
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Summary

यहां, हम ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बेहतर ढंग से चिह्नित करने और विशिष्ट सेल आबादी की पहचान करने के लिए स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकियों के लिए रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) को ठीक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटिओमिक्स परख के लिए, स्वचालित अनुकूलित प्रोटोकॉल आरओआई चयन का मार्गदर्शन कर सकते हैं, जबकि ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख को 50 μm जितना छोटा ROIs का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है।

Abstract

मल्टीप्लेक्सिंग स्थानिक संदर्भ प्रदान करते हुए एक ही ऊतक पर कई मार्करों के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकियां क्रमशः फोटो-क्लीवर ओलिगो-टैग एंटीबॉडी और जांच का लाभ उठाकर प्रोटीन और आरएनए मल्टीप्लेक्सिंग दोनों की अनुमति देती हैं। अंतर्निहित जीव विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए ऊतक भर में विशिष्ट क्षेत्रों से ओलिगोस को अलग और परिमाणित किया जाता है। यहां, अध्ययन दर्शाता है कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के साथ संयोजन में आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए स्वचालित कस्टम एंटीबॉडी विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इस विशिष्ट विधि ने स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के साथ स्वीकार्य प्रदर्शन नहीं दिखाया। प्रोटोकॉल एक स्वचालित मंच पर मार्कर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 3-प्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट (आईएफ) परख के विकास का वर्णन करता है, जो किसी दिए गए प्रोटीन लक्ष्य से फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने और एंटीबॉडी पूल को चुनने के लिए एंटीबॉडी पूल को बढ़ाने के लिए टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) का उपयोग करता है। विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को गुणवत्ता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से मान्य 3-प्लेक्स परख का उपयोग करके स्वचालित किया गया था। इसके अलावा, स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर टीएसए-आधारित आईएफ परख की इमेजिंग की अनुमति देने के लिए एसवाईटीओ रंगों के लिए डीएपीआई के आदान-प्रदान का मूल्यांकन किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख का उपयोग करके छोटे आरओआई का चयन करने की क्षमता का परीक्षण किया ताकि रुचि के अत्यधिक विशिष्ट क्षेत्रों (जैसे, किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए समृद्ध क्षेत्र) की जांच की जा सके। 50 μm और 300 μm व्यास के ROIs एकत्र किए गए थे, जो क्रमशः लगभग 15 कोशिकाओं और 100 कोशिकाओं से मेल खाती हैं। नमूने पुस्तकालयों में बनाए गए थे और ऊतक के छोटे आरओआई और प्रोफ़ाइल-विशिष्ट क्षेत्रों से संकेतों का पता लगाने की क्षमता की जांच करने के लिए अनुक्रमित किए गए थे। हमने निर्धारित किया कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियां आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए स्वचालित, मानकीकृत प्रोटोकॉल से अत्यधिक लाभान्वित होती हैं। जबकि यह स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के साथ संगत नहीं था, हम परीक्षण और पुष्टि करने में सक्षम थे कि मानक मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ छोटे आरओआई में भी विशिष्ट सेल आबादी का सफलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है।

Introduction

मल्टीप्लेक्सिंग तकनीकों में प्रगति ट्यूमर में मौजूद लक्ष्यों के लिए बेहतर लक्षण वर्णन उपकरण प्रदान करना जारी रखती है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) ट्यूमर कोशिकाओं की एक जटिल प्रणाली है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और स्ट्रोमा में घुसपैठ करती है, जहां स्थानिकजानकारी रुचि के बायोमाकर्स के बीच बातचीत के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है। जियोएमएक्स डिजिटल स्पैटियल प्रोफाइलर (डीएसपी) और 10एक्स विज़ियम जैसी उभरती तकनीकों के साथ, कई लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है और उनके स्थानिक संदर्भ में एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है। ऊतक विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करने वाले इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग इन प्रौद्योगिकियों की स्थानिक प्रोफाइलिंग क्षमताओं में और सुधार कर सकता है।

इस विधि के विकास के लिए हमने जिस स्थानिक ओमिक्स तकनीक पर ध्यान केंद्रित किया है, उसमें स्थानिक प्रोटिओमिक्स और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख शामिल हैं जहां ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स यूवी-संवेदनशील फोटोक्लिवेबल लिंकर के माध्यम से एंटीबॉडी या आरएनए जांच से जुड़े होते हैं। हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स को इन ऑलिगो-संयुग्मित एंटीबॉडी या जांच के साथ लेबल किया जाता है और फिर स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर चित्रित किया जाता है। इसके बाद, रोशनी के लिए विभिन्न आकारों और आकृतियों के आरओआई का चयन किया जाता है, और फोटोक्लीवर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एस्पिरेटेड किया जाता है और 96-वेल प्लेट में एकत्र किया जाता है। फोटोक्लीवर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को या तो नैनोस्ट्रिंग एनकाउंटर सिस्टम या नेक्स्ट जनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) 2,3 (चित्रा 1)4,5) के साथ परिमाणित करने के लिए तैयार किया जाता है।

कोशिका वितरण ऊतकों के भीतर भिन्न होता है, और चयनित मार्करों और विभिन्न आरओआई आकारों का उपयोग करके कोशिकाओं के विशिष्ट स्थानों को चिह्नित करने की क्षमता ऊतक वातावरण को पूरी तरह से समझने और विशिष्ट विशेषताओं की पहचान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहां उल्लिखित स्थानिक ओमिक्स तकनीक में, मानक विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करता है और एक मैनुअल प्रोटोकॉल है। ट्यूमर और स्ट्रोमा के बीच अंतर करने के लिए मानक मार्कर पैनसाइटोकेराटिन (पैनसीके) और सीडी 45 6,7 हैं, लेकिन रुचि की विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करने के लिए अतिरिक्त मार्कर आवश्यक हैं। इसके अलावा, सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग में प्रवर्धन की कमी होती है, जो एंटीबॉडी चयन को प्रचुर मात्रा में मार्करों तक सीमित करती है। इसके अतिरिक्त, मैन्युअल परख स्वचालित वर्कफ़्लो8 की तुलना में अधिक परिवर्तनशीलता के अधीन हैं। इसलिए, आरओआई चयन के लिए एक अनुकूलन योग्य, स्वचालित और प्रवर्धित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल होना वांछनीय है।

यहां, अध्ययन दर्शाता है कि, स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए, टीएसए तकनीक का उपयोग स्वचालित मंच पर विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप अधिक लक्षित और मानकीकृत परख होती है। इसके अलावा, टीएसए आधारित परख कम-व्यक्त मार्करों के उपयोग को सक्षम करते हैं, जिससे विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चुने जा सकने वाले लक्ष्यों की सीमा बढ़ जाती है। पैनसीके, एफएपी और एंटीबॉडी एक्स के लिए एक 3-प्लेक्स परख एक स्वचालित मंच का उपयोग करके विकसित की गई थी जहां क्रमशः ट्यूमर और स्ट्रोमा के बीच अंतर करने के लिए पैनसीके और एफएपी का उपयोग किया गया था। एंटीबॉडी एक्स एक स्ट्रोमल प्रोटीन है जो अक्सर ट्यूमर में सामने आता है, लेकिन इसकी जीव विज्ञान और एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर प्रभाव पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एंटीबॉडी एक्स में समृद्ध क्षेत्रों में प्रतिरक्षा संदर्भ को चिह्नित करने से एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा और चिकित्सीय प्रतिक्रिया में इसकी भूमिका को स्पष्ट किया जा सकता है, साथ ही साथ दवा लक्ष्य के रूप में इसकी क्षमता भी स्पष्ट हो सकती है।

जबकि अनुकूलित स्वचालित टीएसए विज़ुअलाइज़ेशन पैनल स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए सफल साबित हुए, स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए इन परखों के आवेदन की पुष्टि नहीं की जा सकी। यह अभिकर्मकों और स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो आरएनए अखंडता से समझौता करते हैं। यह स्वीकार करते हुए कि विज़ुअलाइज़ेशन मार्करों के लिए एक स्वचालित लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए किया जा सकता है, लेकिन स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए नहीं, स्थानिक ओमिक्स प्रौद्योगिकी परख डिजाइनों पर महत्वपूर्ण मार्गदर्शन प्रदान करता है।

इसके अतिरिक्त, अध्ययन दर्शाता है कि स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख का उपयोग 50 μm व्यास या लगभग 15 कोशिकाओं जैसे छोटे क्षेत्रों में लक्ष्यों को प्रोफाइल करने के लिए किया जा सकता है। छोटे आरओआई में प्रतिलेख का पता लगाने के लिए परख की क्षमता का परीक्षण करने के लिए दो अलग-अलग आकार के आरओआई का चयन किया गया था। रुचि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए, 1,800 एमआरएनए लक्ष्यों के अनुरूप ऑलिगोस एकत्र किए गए थे और स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म प्रोटोकॉल के अनुसार पुस्तकालयों में बनाए गए थे। पुस्तकालयों को व्यक्तिगत रूप से अनुक्रमित किया गया, बाद में पूल किया गया, और अनुक्रमित किया गया। इसने पूलिंग दक्षता और छोटे आरओआई में विशिष्ट सेल आबादी की पहचान करने की क्षमता दोनों के मूल्यांकन की अनुमति दी।

इस पेपर से पता चलता है कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए, रुचि के विशिष्ट मार्करों पर आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए एक स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग प्रासंगिक ऊतक क्षेत्रों की पूछताछ को चुनिंदा रूप से लक्षित करने और ऊतक के स्थानिक वातावरण को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि विशिष्ट सेल आबादी का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक परख के लिए छोटे आरओआई का उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी मानव ऊतकों को वाणिज्यिक बायोबैंक या मान्यता प्राप्त ऊतक बैंकों से वारंटी के तहत अधिग्रहित किया गया था कि उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी और सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

नोट: प्रोटोकॉल डिस्कवरी अल्ट्रा और जियोएमएक्स डिजिटल स्थानिक प्रोफाइलर का उपयोग कर के किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल

  1. फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन एंटीबॉडी लागू करने के लिए प्रोग्राम ऑटोस्टेनर
    1. ऑटोस्टेनर सॉफ्टवेयर में, होम बटन पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल चुनें। फिर, प्रोटोकॉल बनाएँ/संपादित करें पर क्लिक करें और प्रक्रिया के रूप में RUO Discovery Universal का चयन करें।
    2. डेपर v2 > डेपारफिनाइजेशन > प्रथम अनुक्रम पर क्लिक करें। मध्यम तापमान के लिए, 72 डिग्री सेल्सियस चुनें, फिर प्रथागत पर क्लिक करें और सेल कंडीशनिंग और सीसी 1 जलाशय का चयन करें। बहुत उच्च तापमान के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस चुनें, फिर CC1 8 मिनट पर क्लिक करें और CC1 64 Min का चयन होने तक क्लिक करना जारी रखें।
    3. इनहिबिटर > डिस्कवरी इनहिबिटर पर क्लिक करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 8 मिनट चुनें। फिर, एंटीबॉडी > हाई टेम्प एबी इनक्यूबेशन पर क्लिक करें; कम तापमान के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस चुनें; एंटीबॉडी के लिए, डिस्पेंसर लेबल से एंटीबॉडी संख्या चुनें (इस उदाहरण में एंटीबॉडी 6); प्लस इनक्यूबेशन समय के लिए, 32 मिनट का चयन करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में तीन अलग-अलग एंटीबॉडी नंबर हैं। पहला एंटीबॉडी एफएपी है, दूसरा पैन-साइटोकेराटिन है, और तीसरा एंटीबॉडी एक्स है।
    4. मल्टीमर एचआरपी > मल्टीमर एचआरपी ब्लॉकर पर क्लिक करें, फिर एंटीबॉडी ब्लॉकिंग के लिए, जीटी आईजी ब्लॉक चुनें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 4 मिनट चुनें। इसके बाद, मल्टीमर एचआरपी अभिकर्मक पर, ओमैप एंटी-आरबी एचआरपी का चयन करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 16 मिनट चुनें। फिर, Cy5 पर क्लिक करें, और लंबे समय इनक्यूबेशन समय के लिए, 0 hr 8 मिनट चुनें।
    5. दोहरे अनुक्रम पर क्लिक करें और एंटीबॉडी विकृतीकरण चुनें, फिर एंटीबॉडी डिनेचर सीसी 2-1 का चयन करें, और बहुत अधिक तापमान के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस चुनें। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेशन समय 8 मिनट है। इसके बाद, डीएस इनहिबिटर पर क्लिक करें और न्यूट्रलाइज का चयन करें।
    6. डीएस एंटीबॉडी पर क्लिक करें, और बहुत कम तापमान के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस चुनें। फिर, एंटीबॉडी में, डिस्पेंसर लेबल (इस उदाहरण में एंटीबॉडी 3) से एंटीबॉडी संख्या चुनें, और प्लस इनक्यूबेशन टाइम के लिए, 32 मिनट का चयन करें।
    7. डीएस मल्टीमर एचआरपी पर क्लिक करें और डीएस मल्टीमर एचआरपी ब्लॉकर चुनें। फिर, एंटीबॉडी ब्लॉकिंग के लिए, जीटी आईजी ब्लॉक का चयन करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 4 मिनट चुनें। इसके बाद, मल्टीमर एचआरपी अभिकर्मक पर, ओमैप एंटी-एमएस एचआरपी का चयन करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 16 मिनट चुनें। फिर, डीएस रोडामाइन 6 जी पर क्लिक करें, और लंबे इनक्यूबेशन समय के लिए, 0 घंटे 8 मिनट चुनें।
    8. ट्रिपल स्टेन पर क्लिक करें और टीएस एंटीबॉडी विकृतीकरण का चयन करें, फिर एंटीबॉडी डिनेचर सीसी 2-2 का चयन करें, और बहुत उच्च तापमान के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस का चयन करें। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेशन समय 8 मिनट है। इसके बाद, टीएस इनहिबिटर पर क्लिक करें और टीएस न्यूट्रलाइज का चयन करें।
    9. टीएस एंटीबॉडी पर क्लिक करें, और बहुत कम तापमान के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस का चयन करें। फिर, एंटीबॉडी में, डिस्पेंसर लेबल (इस उदाहरण में एंटीबॉडी 7) से एंटीबॉडी संख्या का चयन करें, और प्लस इनक्यूबेशन टाइम के लिए, 32 मिनट का चयन करें।
    10. टीएस मल्टीमर एचआरपी पर क्लिक करें और टीएस मल्टीमर एचआरपी ब्लॉकर चुनें। फिर, एंटीबॉडी ब्लॉकिंग के लिए, जीटी आईजी ब्लॉक का चयन करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 4 मिनट चुनें। इसके बाद, मल्टीमर एचआरपी अभिकर्मक पर, ओमैप एंटी-आरबी एचआरपी का चयन करें, और इनक्यूबेशन समय के लिए, 16 मिनट चुनें। फिर, टीएस एफएएम पर क्लिक करें, और लंबे समय इनक्यूबेशन समय के लिए, 0 घंटे 8 मिनट चुनें।
    11. प्रोटोकॉल में कोई शीर्षक जोड़ें. प्रोटोकॉल नंबर का चयन करें, एक टिप्पणी जोड़ें, और सहेजें के बाद सक्रिय पर क्लिक करें।
  2. स्लाइड्स तैयार करें, लेबल मुद्रित करें, और ऑटोस्टेनर चलाना प्रारंभ करें
    1. बेक विक्रेता ने 20-60 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेट ओवन में एफएफपीई (फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड) मानव ऊतक वर्गों की खरीद की। जब स्लाइड बेकिंग कर रहे हों, तो ऑटोस्टेनर सॉफ़्टवेयर में लेबल बनाएं पर क्लिक करके लेबल प्रिंट करें। इसके बाद, प्रोटोकॉल पर क्लिक करें, प्रोटोकॉल नंबर का चयन करें, और बंद / प्रिंट पर क्लिक करें। स्लाइड लेबल पर प्रासंगिक जानकारी जोड़ें और प्रिंट पर क्लिक करें.
    2. ओवन से स्लाइड निकालें और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) तक ठंडा होने दें। पहले मुद्रित प्रोटोकॉल लेबल संबंधित स्लाइड्स पर लागू करें।
    3. चरण 1.1 में असाइन किए गए एंटीबॉडी लेबल नंबर के अनुसार एंटीबॉडी के साथ रिफिल करने योग्य एंटीबॉडी डिस्पेंसर लोड करें। इस प्रोटोकॉल में, एफएपी के लिए एंटीबॉडी 6 का उपयोग 1 μg / mL पर करें, पैन-साइटोकेराटिन के लिए एंटीबॉडी 3 का उपयोग 0.1 μg / mL पर करें, और एंटीबॉडी एक्स के लिए एंटीबॉडी 7 का उपयोग 2.5 μg / mL पर करें। निर्दिष्ट डिल्यूएंट में प्रत्येक एंटीबॉडी को पतला करें और रिफिल करने योग्य एंटीबॉडी डिस्पेंसर को प्राइम करें।
    4. ऊपर उल्लिखित ब्लॉकिंग, डिटेक्शन और प्रवर्धन पूर्व-भरे अभिकर्मक डिस्पेंसर इकट्ठा करें और उन्हें एक अभिकर्मक ट्रे पर रखें। स्लाइड ट्रे में स्लाइड लोड करें (प्रति रन 30 स्लाइड तक) और रनिंग पर क्लिक करें और उसके बाद हां करें। ध्यान दें कि DAPI का उपयोग परमाणु काउंटरस्टेनिंग के लिए नहीं किया जाता है।
    5. ऑटोस्टेनर सॉफ़्टवेयर पर रन अवधि की जाँच करके रन की शुरुआत की पुष्टि करें। प्रोटोकॉल को पूरा होने में ~ 11 घंटे लगते हैं और रात भर चल सकते हैं।
    6. अगले दिन, स्लाइड ट्रे स्लॉट पर हरी चमकती रोशनी देखकर रन पूरा करना सुनिश्चित करें। फिर, उपकरण से स्लाइड लें और स्लाइड्स को 1x रिएक्शन बफर में सख्ती से धोएं जब तक कि तरल कवरस्लिप समाधान पूरी तरह से हटा न जाए।
  3. प्रोटिओमिक्स परख के लिए स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म प्रोटोकॉल
    1. नीचे दिए गए नोट में इंगित स्थानिक प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल का पालन करें। 3-plex स्वचालित लेबलिंग प्रक्रिया को सक्षम करने के लिए प्रोटोकॉल में निम्न परिवर्तन शामिल करें।
    2. स्थानिक प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल शुरू करने से एक दिन पहले चरण 1.2.1-1.2.6 का प्रदर्शन करें और चरण 1.2.6 करने के बाद सीधे स्थानिक प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल के एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण पर जाएं। स्थानिक प्रोफाइलिंग प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल में उल्लिखित विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया को छोड़ दें।
    3. फ्लोरोफोर एकीकरण को सक्षम करने के लिए 5000 एनएम पर एसवाईटीओ 13 को एसवाईटीओ 64 के साथ प्रतिस्थापित करें। 1x TBS में SYTO 64 को पतला करें और 15 मिनट के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    4. स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म में स्कैन पैरामीटर सेट करते समय, 3-प्लेक्स एकीकरण की अनुमति देने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन पैनल में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरेस के अनुसार फिल्टर और फोकसिंग चैनलों का चयन करें। डिस्कवरी FAM के लिए FITC का उपयोग करें और एक्सपोज़र को 200 ms पर सेट करें, Discovery Rhodamine 6G के लिए Cy3 का उपयोग करें और एक्सपोज़र को 200 ms पर सेट करें, SYTO 64 के लिए टेक्सास रेड का उपयोग करें और एक्सपोज़र को 50 ms पर सेट करें (इसे फ़ोकस चैनल के रूप में निर्दिष्ट करें), और अंत में, डिस्कवरी Cy5 के लिए Cy5 का उपयोग करें, एक्सपोज़र को 200 ms पर सेट करें, और परिवर्तन सहेजें.
      नोट: स्थानिक प्रोफाइलिंग प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल के विस्तृत निर्देश आधिकारिक वेबसाइट समर्थन टैब पर प्रलेखन > उपयोगकर्ता मैनुअल का चयन करके पाए जाते हैं। यहां, बॉन्ड आरएक्स का उपयोग करके एनकाउंटर के लिए प्रोटीन प्रोटोकॉल देखें।

2. स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए आरओआई चयन

  1. 20-60 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेट ओवन में एफएफपीई सेल पेलेट सेक्शन बेक करें। नीचे दिए गए नोट में इंगित स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म एनजीएस प्रोटोकॉल का पालन करें और स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर स्लाइड स्कैन करें, 50 μm और 300 μm के आकार का चयन करें। स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए निम्नलिखित सिफारिश पर प्रकाश डाला गया है:
    1. पुस्तकालय तैयार करते समय, यदि आरओआई के विभिन्न आकारों का चयन किया गया था, तो प्रति आकार एक पुस्तकालय बनाने के लिए समान आकार के आरओआई को एक साथ पूल करें। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि आकार से पूर्वाग्रह के बिना सभी आरओआई के लिए पर्याप्त अनुक्रमण गहराई प्राप्त की जाती है।
      नोट: स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म के विस्तृत निर्देश आधिकारिक वेबसाइट समर्थन टैब पर प्रलेखन > उपयोगकर्ता मैनुअल का चयन करके पाए जाते हैं। यहां, बॉन्ड आरएक्स का उपयोग करके एनजीएस अनुप्रयोगों के लिए आरएनए प्रोटोकॉल देखें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ROI चयन का मार्गदर्शन करने के लिए स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल
इस पेपर में, हम ऊतक की कल्पना करने और विशिष्ट आरओआई का चयन करने के लिए एक स्वचालित, कस्टम टीएसए-आधारित आईएफ प्रोटोकॉल का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। नियंत्रण ऊतकों के रूप में मेलेनोमा और मानव सामान्य त्वचा का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन पैनल विकास में एपिटोप स्थिरता परीक्षण, मार्कर तीव्रता की बारीक ट्यूनिंग और एक नियंत्रण छोड़ने के माध्यम से मूल्यांकन के माध्यम से रक्तस्राव शामिल था। यह जांचने के लिए कि क्या एंटीबॉडी की एपिटोप स्थिरता दोहराए जाने वाले क्षालन चरणों से प्रभावित होती है, एफएपी और एंटीबॉडी एक्स संकेतों को 3-प्लेक्स की प्रत्येक स्थिति में लेबलिंग के बाद गुणात्मक रूप से मूल्यांकन किया गया था। एंटीबॉडी एक्स सिग्नल सभी स्थितियों में सुसंगत रहा, जबकि एफएपी सिग्नल की तीव्रता एक क्षालन के बाद कम हो गई (चित्रा 2)। पिछले आंतरिक अध्ययनों से पता चला है कि पैनसीके एपिटोप पूरे 3-प्लेक्स परख में स्थिर है। इसलिए, एफएपी को 3-प्लेक्स मेंपहले स्थान पर चुना गया था, पैनसीके को 2वें स्थान पर रखा गया था, और एंटीबॉडी एक्स कोतीसरे स्थान पर रखा गया था। चूंकि एफएपी सिग्नल एंटीबॉडी एक्स और पैनसीके की तुलना में कमजोर था, इसलिए एफएपी को उज्जवल फ्लोरोफोरे, साइ 5 के साथ जोड़ा गया था।

स्वचालित 3-प्लेक्स को एक नियंत्रण छोड़ने के साथ अनुकूलित किया गया था, जहां प्रत्येक मार्कर को 3-प्लेक्स प्रोटोकॉल से एक बार छोड़ दिया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि पड़ोसी चैनलों में कोई रक्तस्राव नहीं हुआ था (चित्रा 3)।

स्वचालित धुंधला मंच पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर का परीक्षण स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि फिल्टर 3-प्लेक्स विज़ुअलाइज़ेशन पैनल में टीएसए फ्लोरोफोरेस के साथ संगत हैं। चूंकि 3-प्लेक्स प्रोटोकॉल एफआईटीसी, साइ 3 और साइ 5 का उपयोग करता है, और डीएपीआई चैनल का उपयोग स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर यूवी दरार के लिए किया जाता है, टेक्सास रेड चैनल में एक परमाणु काउंटरस्टेन का उपयोग किया जाना था। दो अलग-अलग परमाणु रंगों, SYTO 59 और SYTO 64 का परीक्षण किया गया था, और रंगों ने बृहदान्त्र ऊतकों में एक अलग परमाणु संकेत दिखाया। हालांकि, SYTO 59 ने Cy5 चैनल में कुछ रक्तस्राव संकेत भी प्रदर्शित किए, जबकि SYTO 64 (चित्रा 4) का उपयोग करते समय Cy5 चैनल साफ था। इसलिए, SYTO 64 परमाणु पहचान के लिए पसंदीदा विकल्प था।

एसवाईटीओ 64 के आगे के परीक्षण से पता चला कि यह डाई फोटोटेबल नहीं थी और इमेजिंग के दौरान जल्दी से फोटोब्लीच की गई थी। एक बार सिग्नल ब्लीच हो जाने के बाद, इमेजिंग सिस्टम पृष्ठभूमि पर केंद्रित है, जिसे गैर-विशिष्ट संकेत (चित्रा 5) के रूप में व्याख्या किया जा सकता है। सिग्नल तीव्रता बढ़ाने के लिए परमाणु डाई की एकाग्रता बढ़ाने से इस मुद्दे को कम करने में मदद मिली।

सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ लेबल किए गए ऊतक, जो सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, की तुलना पैनसीके / एफएपी / एंटीबॉडी एक्स स्वचालित कस्टम विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ लेबल किए गए ऊतकों से की गई थी। दोनों प्रोटोकॉल एक सामान्य मार्कर के रूप में पैनसीके साझा करते हैं, और सिग्नल दो प्रोटोकॉल (चित्रा 6) के बीच तुलनीय था।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक संशोधित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का अपस्ट्रीम स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, हमने पैनसीके / सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफ़ॉर्म संग्रह और गिनती प्लेटफ़ॉर्म प्रोसेसिंग के बाद प्राप्त गणना मूल्यों की तुलना की। यह सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी या 3-प्लेक्स स्वचालित कस्टम विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जो टीएसए का उपयोग करता है। चार कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) ऊतकों को स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के साथ संयोजन में पैनसीके / सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल या 3-प्लेक्स स्वचालित कस्टम विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ लेबल किया गया था। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए समान आरओआई चुने गए थे, और संबंधित आरओआई के गणना डेटा की तुलना एस 6 और हिस्टोन के लिए हाउसकीपिंग सामान्यीकरण का उपयोग करके की गई थी। इन आरओआई के बीच समान रुझान देखे गए जैसा कि लॉग 2 हीटमैप (चित्रा 7 ए) में दिखाया गया है, जिसमें स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख (चित्रा 7 बी) में शामिल सभी मार्करों के लिए 0.88 का स्पीयरमैन आर मान है। परख में उपयोग किए गए 31 एंटीबॉडी में से, 23 एंटीबॉडी में स्पीयरमैन आर मान 0.5 से अधिक या उसके बराबर था।

चूंकि स्थानिक प्रोटिओमिक्स और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोटोकॉल भिन्न होते हैं, इसलिए हमने मूल्यांकन किया कि क्या स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख पर भी लागू किया जा सकता है। स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को आरएनए का पता लगाने से पहले आईएचसी परख करने की आवश्यकता होती है, जबकि मूल मैनुअल प्रोटोकॉल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को लागू करने से पहले आरएनए का पता लगाता है। 3-प्लेक्स स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के साथ संयोजन में सीके / सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ-साथ परीक्षण किया गया था। स्थानिक प्रोफाइलिंग सॉफ्टवेयर पर सामान्यीकृत 3-प्लेक्स स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल चतुर्थक 3 गिनती (Q3) के लिए अनुक्रमण डेटा ने सीके / सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल (चित्रा 8 ए) की तुलना में कम मूल्य प्रस्तुत किए, जो 0.15 (चित्रा 8 बी) के कम स्पीयरमैन आर मानों द्वारा भी परिलक्षित होता है। इसके अलावा, 3-प्लेक्स विज़ुअलाइज़ेशन स्वचालित प्रोटोकॉल (चित्रा 8 सी) का उपयोग करते समय गतिशील सीमा का नुकसान देखा गया था।

स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ गिनती का यह नुकसान इंगित करता है कि यह प्रोटोकॉल आरएनए अखंडता से समझौता करता है, और यह कि विज़ुअलाइज़ेशन परख करने से पहले आरएनए का पता लगाना आरएनए गुणवत्ता के संरक्षण के लिए आवश्यक है। चूंकि इस स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन पैनल को आरएनए का पता लगाने से पहले प्रोटीन भाग करने की आवश्यकता होती है, इसलिए यह प्रोटोकॉल आरएनए परख के लिए उपयुक्त नहीं है।

स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख में आरओआई चयन का आकार
आरएनए डेटा आउटपुट पर आरओआई आकार के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए, विभिन्न आकार के आरओआई की आरएनए गणना की तुलना की गई थी। ऊतकों में निहित अंतर को कम करने के लिए स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख को सुधल 1 और JURKAT सेल लाइनों पर किया गया था। स्थानिक प्रोफाइलिंग सॉफ्टवेयर पर क्यू 3 सामान्यीकरण का उपयोग करके 50 μm और 300 μm व्यास के परिपत्र ROIs का चयन किया गया और एक दूसरे से तुलना की गई। विभिन्न सेल लाइनों पर चयनित लक्ष्यों के लिए आरएनए गणना सामान्यीकरण के बाद दो आरओआई आकारों के बीच तुलनीय थी (चित्रा 9 ए, बी)।

Figure 1
चित्रा 1: डिजिटल स्थानिक प्रोफाइलिंग वर्कफ़्लो। (ए) स्लाइड्स को एंटीबॉडी (स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख) या जांच (स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख) के साथ-साथ विज़ुअलाइज़ेशन मार्करों के साथ लेबल किया जाता है। (बी) आरओआई को चित्रित करने और चुनने के लिए स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर स्लाइड ्स रखी जाती हैं। (सी) ओलिगो को यूवी प्रकाश द्वारा छोड़ दिया जाता है और 96-वेल प्लेट में एकत्र किया जाता है। यह प्रक्रिया चयनित प्रत्येक ROI के लिए दोहराई जाती है। (डी) नमूने संसाधित किए जाते हैं, और डेटा गिनती मंच या अनुक्रमक का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है। इस आंकड़े को नैनोस्ट्रिंग टेक्नोलॉजीज वेबसाइट 4,5 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एपिटोप स्थिरता। (ए-सी) एंटीबॉडी एक्स और (डी-एफ) एफएपी क्रमशः मानव सामान्य त्वचा और मेलेनोमा पर परीक्षण किया गया। (A, D) 1, (B, E) nd, और (C, F) 3-plex केतीसरे स्थान में प्रत्येक मार्कर। एंटीबॉडी एक्स सभी पदों में स्थिर है, जबकि (डी) एफएपी क्रमशः (ई-एफ) एक और दो एल्यूटियन के बाद सिग्नलिंग तीव्रता में कमी दिखाता है। हरे रंग में एंटीबॉडी एक्स, लाल रंग में एफएपी, ग्रे में डीएपीआई। स्केल पट्टियाँ 200 μm पर हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मानव अग्न्याशय ऊतकों पर 3-प्लेक्स स्वचालित कस्टम विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के लिए एक नियंत्रण छोड़ दें। सभी छवियों के लिए, एंटीबॉडी एक्स को हरे रंग में, पैनसीके को सियान में और एफएपी को लाल रंग में चित्रित किया गया है। पहली पंक्ति (ए) 3-प्लेक्स और एफआईटीसी में (बी) एंटीबॉडी एक्स के लिए एकल चैनल दिखाती है, (सी) Cy3 में PANCK, और Cy5 में (D) FAP। दूसरी पंक्ति प्रत्येक मार्कर के लिए एकल चैनल (ई) एंटीबॉडी एक्स और (एफ-एच) के लिए एक नियंत्रण 3-प्लेक्स को छोड़ती है। तीसरी पंक्ति प्रत्येक मार्कर के लिए (I) panCK और (J-L) एकल चैनलों के लिए एक नियंत्रण 3-plex छोड़ने को दर्शाती है। चौथी पंक्ति प्रत्येक मार्कर के लिए एकल चैनल (एम) एफएपी और (एन-पी) के लिए एक नियंत्रण 3-प्लेक्स को छोड़ती है। किसी भी लीव वन आउट कंट्रोल में कोई रक्तस्राव नहीं देखा गया, जैसा कि एफएपी के बिना परीक्षण किए जाने पर संबंधित चैनलों में सिग्नल की कमी से संकेत मिलता है ( एफ) बिना एफएपी के, (के) पैनसीके के बिना, और (पी) एंटीबॉडी एक्स के बिना। स्केल बार 500 μm पर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एसवाईटीओ डाई परीक्षण। टेक्सास रेड चैनल (ए) एसवाईटीओ 59 के लिए बृहदान्त्र में परमाणु संकेत प्रदर्शित करता है, जिसमें (बी) साइ 5 चैनल (लाल) में खून बहता है। टेक्सास रेड चैनल (डी) एसवाईटीओ 64 के लिए कोलन में परमाणु संकेत दिखाता है, जिसमें (ई) साइ 5 चैनल के माध्यम से खून बहता है। कोलोन में टेक्सास रेड और Cy5 चैनलों ने एसवाईटीओ 59 के माध्यम से (सी) खून बहने और (एफ) एसवाईटीओ 64 के माध्यम से कोई खून नहीं दिखाने के लिए एक साथ प्रदर्शित किया। स्केल पट्टियाँ 50 μm पर हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: SYTO 64 फोटोस्टेबिलिटी। कोलन नमूने फोटोब्लीचिंग से पहले और (बी) के बाद एसवाईटीओ 64 (ए) के साथ लेबल किए गए हैं। छवि बी गैर-विशिष्ट संकेत दिखाता है जो परमाणु संकेत हानि के बाद अधिक दृश्यमान हो जाता है। स्केल पट्टियाँ 50 μm पर हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) नमूनों पर पैनसीके सिग्नल की तुलना (ए) पैनसीके / सीडी 45 मैनुअल विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल और (बी) पैनसीके / एफएपी / एंटीबॉडी एक्स स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के साथ। दोनों प्रोटोकॉल के बीच पैनसीके सिग्नल में कोई अंतर नहीं देखा गया। स्केल पट्टियाँ 200 μm पर हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: चार सीआरसी ऊतकों के समान आरओआई पर दो अलग-अलग विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए गणना मूल्यों की तुलना। (A) स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख में शामिल सभी मार्करों का लॉग 2 हीटमैप मैनुअल पैनसीके / सीडी 45 प्रोटोकॉल (ब्लैक) की तुलना स्वचालित 3-प्लेक्स प्रोटोकॉल (ग्रे) से करता है। (बी) सभी मार्करों के लिए लॉग 2 स्पीयरमैन सहसंबंध 0.88 का आर मान प्रस्तुत करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 7 सॉफ्टवेयर या पायथन प्रोग्रामिंग भाषा के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: दो अलग-अलग विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए गणना मूल्यों की तुलना। (A) स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख में शामिल चयनित लक्ष्यों का लॉग 2 हीटमैप मैनुअल PANCK/ CD45 प्रोटोकॉल (ब्लैक) की तुलना 3-plex स्वचालित प्रोटोकॉल (ग्रे) से करता है। (बी) सभी मार्करों के लिए लॉग 2 स्पीयरमैन सहसंबंध 0.15 का आर मान प्रस्तुत करता है। (सी) माध्य (नीला) और मानक विचलन जहां गतिशील सीमा 3-प्लेक्स स्वचालित प्रोटोकॉल में खो जाती है। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 7 सॉफ्टवेयर या पायथन प्रोग्रामिंग भाषा के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: सेल छर्रों पर स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए आरएनए गणना मूल्यों की तुलना। (ए) सुधल 1 और (बी) जुरकैट सेल लाइनों पर चयनित लक्ष्यों के लिए 50 μm (काला) और 300 μm (ग्रे) व्यास आरओआई के लिए तुलनीय परिणाम देखे गए। टी-टेस्ट का उपयोग करके कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। एन = 3 आरओआई प्रति आकार के लिए दिखाया गया औसत और मानक विचलन। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 7 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आज तक, एक मैनुअल प्रोटोकॉल में सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग आमतौर पर स्थानिक प्रोटिओमिक्स या स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्सपरख 9,10 के लिए विज़ुअलाइज़ेशन पैनलों के रूप में किया जाता है। हालांकि, सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग कम प्रचुर मात्रा में मार्करों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिससे उपयुक्त एंटीबॉडी का चयन सीमित हो जाता है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख का समर्थन करने के लिए टीएसए प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन मार्करों की लेबलिंग को स्वचालित स्टेनिंग प्लेटफॉर्म पर स्वचालित किया जा सकता है। यह विज़ुअलाइज़ेशन पैनलों के अनुकूलन में अधिक लचीलेपन की अनुमति देता है, जो ऊतक के विशिष्ट क्षेत्रों से प्रासंगिक जैविक डेटा के अधिक लक्षित आरओआई चयन और अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। टीएसए तकनीक कम बहुतायत मार्करों के विज़ुअलाइज़ेशन की भी अनुमति देती है, और इस तरह संभावित उपयुक्त एंटीबॉडी की संख्या बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल का स्वचालन लेबलिंग प्रक्रिया की प्रजनन क्षमता और गुणवत्ता सुनिश्चित करता है।

3-प्लेक्स आईएफ परख विकसित करने के लिए उचित नियंत्रण ऊतकों पर मार्कर / फ्लोरोफोर सिग्नल तीव्रता के सावधानीपूर्वक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी सांद्रता को टाइट करने की सिफारिश की जाती है, जो आसन्न चैनलों में रक्तस्राव को कम करने में मदद करेगा। इसके अलावा, रुचि के प्रत्येक मार्कर के लिए एपिटोप स्थिरता का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि एपिटोप बार-बार क्षालन चरणों से प्रभावित नहीं है। एक बार पैनल में एंटीबॉडी के क्रम की पुष्टि हो जाने के बाद, परख को लीव वन आउट कंट्रोल का उपयोग करके ठीक करने की आवश्यकता होती है। यहां, पैनल में एक विशिष्ट मार्कर छोड़ दिया जाता है, और अधिग्रहित छवि में संबंधित चैनल की समीक्षा रक्तस्राव और क्रॉस-टॉक के लिए की जाती है।

यहां यह दिखाया गया था कि टीएसए-आधारित परख को स्थानिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म पर चित्रित किया जा सकता है, और परमाणु धुंधला करने के लिए डीएपीआई विकल्पों का उपयोग करने की आवश्यकता है। हमने एसवाईटीओ रंगों का परीक्षण किया और निर्धारित किया कि यह तय करते समय कि किस एसवाईटीओ डाई का उपयोग करना है, आसन्न चैनलों में रक्तस्राव से बचने के लिए सिग्नल का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है। एसवाईटीओ रंगों के उपयोग की एक और सीमा यह है कि कुछ एसवाईटीओ डाई फोटोब्लीच को तेजी से रंगते हैं, जैसे कि एसवाईटीओ 64 और एसवाईटीओ 83 (आंतरिक डेटा), जो परमाणु परिमाणीकरण को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, दाग वाली स्लाइड्स के हल्के संपर्क से जितना संभव हो उतना बचना चाहिए। अन्य समूहों ने SYTO 1311,12 का उपयोग दिखाया है, जो अधिक फोटोटेबल (आंतरिक डेटा) है और इसका उपयोग एक पैनल में तब तक किया जा सकता है जब तक कि रुचि के मार्कर फ्लोरोफोर को सौंपे जाते हैं जो पसंद के परमाणु डाई के साथ संगत होते हैं।

जबकि स्वचालित टीएसए आधारित फ्लोरोसेंट परख ने स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के साथ संयोजन में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अच्छी तरह से काम किया, यह यहां निर्धारित किया गया था कि स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स प्रोटोकॉल के साथ 3-प्लेक्स स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल के संयोजन से गतिशील सीमा का नुकसान हुआ, जो अतिरिक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति / क्षालन चरणों को जोड़ने की कठोर प्रोटोकॉल स्थितियों के कारण हो सकता है जो आरएनए अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, 3-प्लेक्स स्वचालित विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल को केवल प्रोटिओमिक्स परख के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जो एक सीमा है और आरएनए-आधारित परख के लिए वैकल्पिक विज़ुअलाइज़ेशन दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। समान-स्लाइड विज़ुअलाइज़ेशन के विकल्प के रूप में, आरओआई चयन13 को सुविधाजनक बनाने के लिए रुचि के मार्करों से सना सीरियल सेक्शन तैयार किया जा सकता है। इसके अलावा, साहित्य आरओआई चयन14 का मार्गदर्शन करने के लिए आसन्न स्लाइडों पर सीटू संकरण के उपयोग का वर्णन करता है। हालांकि, ये दृष्टिकोण ऊतक उपलब्धता, अनुभाग-से-अनुभाग परिवर्तनशीलता और सेल-टू-सेल पंजीकरण द्वारा सीमित हो सकते हैं।

हमने स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए विभिन्न आरओआई आकारों की प्रयोज्यता का भी परीक्षण किया। 50 μm के छोटे ROIs का उपयोग करने से शोधकर्ता को विशिष्ट क्षेत्रों के डेटा प्राप्त करने में सक्षम बनाता है जिससे चयनित कोशिकाओं या रुचि के क्षेत्रों का अधिक विस्तृत रीडआउट हो सकता है। छोटे आरओआई का चयन करने की सीमाएं यह हैं कि मौजूद कोशिकाओं की संख्या गिनती मूल्यों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त मात्रा में नहीं हो सकती है जिन्हें पृष्ठभूमि से अलग किया जा सकता है। एक विकल्प कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों को पकड़ने के लिए शुद्ध सेल आबादी का चयन करना है। हालांकि, एकल कोशिकाओं के लिए आरओआई चयन उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात15 द्वारा सीमित है। इसके अलावा, पुस्तकालय की तैयारी के लिए आरओआई आकारों पर विचार करना महत्वपूर्ण है यदि एक ही प्रयोग में विभिन्न आकार के आरओआई एकत्र किए जाते हैं। यदि आरओआई आकार काफी भिन्न होते हैं, तो उनके आकार के अनुसार आरओआई को पूल करना और एक पुस्तकालय में बड़े आरओआई को अधिक प्रतिनिधित्व करने से रोकने के लिए अलग-अलग पुस्तकालयों का निर्माण करना फायदेमंद हो सकता है। यह भी सुनिश्चित करेगा कि प्रत्येक आरओआई को उसके आकार के अनुसार पर्याप्त अनुक्रमण कवरेज मिलेगा।

स्थानिक ओमिक्स प्रयोगों को करते समय विचार करने वाले अन्य कारक यह हैं कि डेटा स्लाइड-टू-स्लाइड परिवर्तनशीलता के कारण भिन्नता दिखा सकता है, और कुछ लक्ष्यों की कम अभिव्यक्ति पृष्ठभूमि और सहसंबंध मूल्यों में अंतर ला सकती है। प्रयोगों की योजना बनाते समय और डेटा का मूल्यांकन करते समय पर्याप्त नियंत्रण और सामान्यीकरण दृष्टिकोण पर विचार करने की आवश्यकता होती है। एनकाउंटर पर स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए, हाउसकीपिंग लक्ष्यों या नकारात्मक नियंत्रण आईजीजी को सामान्य करना आंतरिक अनुभव और विक्रेता सिफारिशों के अनुसार पसंदीदा तरीके हैं जहां हाउसकीपिंग लक्ष्यों या नकारात्मक नियंत्रण आईजीजी के बीच सहसंबंध का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होतीहै। हालांकि, उपयोग किए गए ऊतकों के आधार पर, प्रत्येक अध्ययन17,18 के लिए सबसे अच्छा सामान्यीकरण परिभाषित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, साहित्य बताता है कि स्तन कैंसर स्थानिक ओमिक्स अध्ययनों के लिए, जीएपीडीएच, जो आमतौर पर हाउसकीपिंग लक्ष्यों को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है, एस 6 और हिस्टोन19 की तुलना में कम सुसंगत रहा है। इसलिए, एस 6 और हिस्टोन स्तन कैंसर के ऊतकों में सामान्यीकरण के लिए अनुशंसित हाउसकीपिंग लक्ष्य रहेहैं।

स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए, अध्ययन डिजाइन (जैसे, ऊतक प्रकार और आरओआई चयन) के आधार पर सामान्यीकरण रणनीतियों को परिभाषित करने की आवश्यकता है। आरएनए-सेक में उपयोग की जाने वाली कुछ रणनीतियों, जैसे कि एम मानों (टीएमएम) सामान्यीकरण के ऊपरी चतुर्थक या छंटनी माध्य, अनुक्रमित डेटा19,20 को सामान्य करने के लिए लागू किया जा सकता है।

स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख हजारों लक्ष्यों पर जानकारी प्रदान करते हैं और पूरे ट्रांसस्क्रिप्टम का पता लगाने के लिए अधिक सामान्यतः उपयोग किए जा रहे हैं, जहां विशिष्ट टीएमई डिब्बों का चयन किया जाता है और एकल-नाभिक आरएनए-सेक20 या एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण21 के संयोजन में विश्लेषण किया जाता है। हमने प्रदर्शित किया कि लक्ष्यों के स्थानिक वितरण का आकलन करने के लिए आरओआई चयन का मार्गदर्शन करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन प्रोटोकॉल स्थानिक प्रोटिओमिक्स परख के लिए स्वचालित हो सकते हैं लेकिन स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख के लिए नहीं। इसके अतिरिक्त, हम प्रस्तुत करते हैं कि किसी विशेष ऊतक क्षेत्र की अधिक गहराई से जांच की अनुमति देने के लिए 50 μm जितने छोटे ROIs का चयन किया जा सकता है। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की समझ में सुधार करेंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

वेरोनिका इबारा-लोपेज़, संगीता जयकर, येकिंग एंजेला यांग, ज़ोरा मोडरुसन और सैंड्रा रोस्ट रोश समूह के सदस्य जेनेन्टेक के कर्मचारी और स्टॉकहोल्डर हैं। अन्य कंपनियां जो रोश का हिस्सा हैं, इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन करती हैं। सियारा मार्टिन नैनोस्ट्रिंग टेक्नोलॉजीज इंक का एक पूर्णकालिक कर्मचारी है, जो इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन करता है।

Acknowledgments

लेखक एनजीएस फाइलों को संसाधित करने के लिए थॉमस वू को स्वीकार करते हैं। हम परिणाम चर्चाओं और पांडुलिपि समीक्षा के लिए जेम्स ज़ियाई और आंतरिक पांडुलिपि संशोधन के लिए मेरेडिथ ट्रिपल और राहेल टेलर को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris buffered saline (TBS) Cell Signaling Technologies 12498S Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed) antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water ThermoFisher AM9922 Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) Ventana 950-500
DISCOVERY Cy5 Kit Ventana 760-238 Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit Ventana 760-243 Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block Ventana 760-6008 Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP Ventana 760-4310 Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP Ventana 760-4311 Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit Ventana 760-244 Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System Ventana 05 987 750 001 / N750-DISU-FS Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler NanoString GMX-DSP-1Y Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber Simport M920-2 Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody Abcam Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Python Python Statistical analysis
Reaction Buffer (10x) Ventana 950-300
Statistical analysis software GraphPad Prism 7 Statistical analysis
SYTO 64 ThermoFisher S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana 950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein Ventana 760-219 Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser Ventana Catalog number depends on dispenser number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 185 मल्टीप्लेक्सिंग आरएनए प्रोटीन लक्ष्य स्वचालन आरओआई विज़ुअलाइज़ेशन एंटीबॉडी जांच प्रोटिओमिक्स ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स
ऊतक में प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति की स्थानिक प्रोफाइलिंग: वर्चुअल माइक्रोडिसेक्शन को ठीक करने के लिए एक दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, … More

Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, Y. A., Martin, C., Modrusan, Z., Rost, S. Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection. J. Vis. Exp. (185), e62651, doi:10.3791/62651 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter