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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/62651
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Summary

Aquí, describimos un protocolo para ajustar las regiones de interés (ROI) para las tecnologías de Spatial Omics para caracterizar mejor el microambiente tumoral e identificar poblaciones celulares específicas. Para los ensayos proteómicos, los protocolos personalizados automatizados pueden guiar la selección del ROI, mientras que los ensayos transcriptómicos se pueden ajustar utilizando ROI tan pequeños como 50 μm.

Abstract

La multiplexación permite la evaluación de varios marcadores en el mismo tejido al tiempo que proporciona un contexto espacial. Las tecnologías de Spatial Omics permiten la multiplexación de proteínas y ARN mediante el aprovechamiento de anticuerpos y sondas oligomarcados foto-divisorias, respectivamente. Los oligos se escinden y cuantifican a partir de regiones específicas a través del tejido para dilucidar la biología subyacente. Aquí, el estudio demuestra que los protocolos automatizados de visualización de anticuerpos personalizados se pueden utilizar para guiar la selección del ROI junto con los ensayos de proteómica espacial. Este método específico no mostró un rendimiento aceptable con los ensayos de transcriptómica espacial. El protocolo describe el desarrollo de un ensayo inmunofluorescente (IF) 3-plex para la visualización de marcadores en una plataforma automatizada, utilizando amplificación de señal de tiramida (TSA) para amplificar la señal fluorescente de un objetivo de proteína dado y aumentar el grupo de anticuerpos para elegir. El protocolo de visualización se automatizó utilizando un ensayo 3-plex completamente validado para garantizar la calidad y la reproducibilidad. Además, se evaluó el intercambio de DAPI por colorantes SYTO para permitir la obtención de imágenes de ensayos de FI basados en TSA en la plataforma de perfiles espaciales. Además, probamos la capacidad de seleccionar pequeños ROI utilizando el ensayo de transcriptómica espacial para permitir la investigación de áreas de interés altamente específicas (por ejemplo, áreas enriquecidas para un tipo de célula determinado). Se recolectaron ROI de 50 μm y 300 μm de diámetro, lo que corresponde a aproximadamente 15 células y 100 células, respectivamente. Las muestras se hicieron en bibliotecas y se secuenciaron para investigar la capacidad de detectar señales de pequeños ROI y regiones específicas del perfil del tejido. Determinamos que las tecnologías de proteómica espacial se benefician enormemente de los protocolos automatizados y estandarizados para guiar la selección del ROI. Si bien este protocolo de visualización automatizada no era compatible con los ensayos de transcriptómica espacial, pudimos probar y confirmar que poblaciones celulares específicas pueden detectarse con éxito incluso en pequeños ROI con el protocolo de visualización manual estándar.

Introduction

Los avances en las técnicas de multiplexación continúan proporcionando mejores herramientas de caracterización para los objetivos presentes en los tumores. El microambiente tumoral (EMT) es un sistema complejo de células tumorales, células inmunes infiltrantes y estroma, donde la información espacial es crítica para comprender e interpretar mejor los mecanismos de interacción entre biomarcadores de interés1. Con técnicas emergentes como GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) y 10x Visium, se pueden detectar y cuantificar múltiples objetivos simultáneamente dentro de su contexto espacial. El uso de protocolos de inmunofluorescencia que facilitan la visualización del tejido puede mejorar aún más las capacidades de perfil espacial de estas tecnologías.

La tecnología de Spatial Omics en la que nos centramos para el desarrollo de este método consiste en ensayos de proteómica espacial y transcriptómica donde los oligonucleótidos se unen a anticuerpos o sondas de ARN a través de un enlace fotodivisible sensible a los rayos UV. Los portaobjetos histológicos se etiquetan con estos anticuerpos o sondas oligoconjugados y luego se obtienen imágenes en la plataforma de perfiles espaciales. A continuación, se seleccionan ROI de diferentes tamaños y formas para la iluminación, y los oligonucleótidos fotohendidos se aspiran y se recogen en una placa de 96 pocillos. Los oligonucleótidos fotohendidos están preparados para ser cuantificados con el sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.

Las distribuciones celulares varían dentro de los tejidos, y la capacidad de caracterizar ubicaciones específicas de células utilizando marcadores seleccionados y diferentes tamaños de ROI es de gran importancia para comprender completamente el entorno del tejido e identificar características específicas. En la tecnología Spatial Omics mencionada aquí, el protocolo de visualización estándar utiliza anticuerpos directamente conjugados y es un protocolo manual. Los marcadores estándar para distinguir entre tumor y estroma son pancitoqueratina (panCK) y CD456,7, pero se necesitan marcadores adicionales para dirigirse a poblaciones celulares específicas de interés. Además, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados carece de amplificación, lo que limita la selección de anticuerpos a marcadores abundantes. Además, los ensayos manuales están sujetos a una mayor variabilidad que los flujos de trabajo automatizados8. Por lo tanto, es deseable tener un protocolo de visualización personalizable, automatizado y amplificado para la selección del ROI.

Aquí, el estudio demuestra que, para los ensayos de proteómica espacial, la tecnología TSA se puede utilizar para protocolos de visualización en una plataforma automatizada, lo que resulta en un ensayo más específico y estandarizado. Además, los ensayos basados en TSA permiten el uso de marcadores de baja expresión, lo que aumenta el rango de objetivos que se pueden seleccionar para la visualización. Se desarrolló un ensayo 3-plex para panCK, FAP y Antibody X utilizando una plataforma automatizada donde se usaron panCK y FAP para diferenciar entre tumor y estroma, respectivamente. El anticuerpo X es una proteína estromal que se encuentra con frecuencia en los tumores, pero su biología y su impacto en la inmunidad antitumoral no se comprenden completamente. La caracterización de la textura inmune en áreas ricas en anticuerpos X puede dilucidar su papel en la inmunidad antitumoral y la respuesta terapéutica, así como su potencial como diana farmacológica.

Si bien los paneles de visualización TSA automatizados personalizados demostraron ser exitosos para los ensayos de proteómica espacial, no se pudo confirmar la aplicación de estos ensayos para ensayos de transcriptómica espacial. Esto se debe probablemente a los reactivos y al protocolo utilizado para los protocolos de visualización automatizada, que parecen comprometer la integridad del ARN. Reconocer que un protocolo de etiquetado automatizado para marcadores de visualización se puede utilizar para ensayos de proteómica espacial, pero no para ensayos de transcriptómica espacial, proporciona una guía importante sobre los diseños de ensayos de tecnología Spatial Omics.

Además, el estudio demuestra que el ensayo de transcriptómica espacial se puede utilizar para perfilar objetivos en regiones tan pequeñas como 50 μm de diámetro, o aproximadamente 15 células. Se seleccionaron dos ROI de diferentes tamaños para probar la capacidad del ensayo para detectar también transcripciones en ROI pequeños. Para cada región de interés, se recolectaron oligos correspondientes a 1.800 objetivos de ARNm y se convirtieron en bibliotecas de acuerdo con el protocolo de la plataforma de perfiles espaciales. Las bibliotecas se indexaron individualmente, posteriormente se agruparon y secuenciaron. Esto permitió evaluar tanto la eficiencia de la agrupación como la capacidad de identificar poblaciones celulares específicas en pequeños ROI.

Este documento muestra que para los ensayos de proteómica espacial, se puede utilizar un protocolo automatizado para guiar la selección del ROI en marcadores específicos de interés para dirigirse selectivamente a la interrogación de áreas de tejido relevantes y caracterizar el entorno espacial del tejido. Además, demostramos que se pueden usar ROI más pequeños para ensayos transcriptómicos espaciales para detectar y caracterizar poblaciones celulares específicas.

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Protocol

Todos los tejidos humanos se adquirieron de biobancos comerciales o bancos de tejidos acreditados bajo la garantía de que se obtuvo la aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado.

NOTA: El protocolo se realiza utilizando Discovery Ultra y GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos, el equipo y el software utilizados en este protocolo.

1. Protocolo de visualización automatizado para ensayos de proteómica espacial

  1. Programa autotinción para aplicar anticuerpos de visualización fluorescente
    1. En el software autostainer, haga clic en el botón de inicio y elija Protocolos. Luego, haga clic en Crear / Editar protocolos y seleccione RUO DISCOVERY Universal como procedimiento.
    2. Haga clic en Primera secuencia > Deparafinización > Depar v2. Para Temperatura media, elija 72 grados C, luego haga clic en Pretratamiento y seleccione Acondicionamiento celular y depósito CC1. Para Temperatura muy alta, elija 100 grados C, luego haga clic en CC1 8 Min y continúe haciendo clic hasta que se seleccione CC1 64 Min .
    3. Haga clic en Inhibidor > Inhibidor DISCOVERY y, para Tiempo de incubación, elija 8 minutos. Luego, haga clic en Incubación de anticuerpos > Ab de alta temperatura; para baja temperatura, elija 37 grados C; en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 6 en este ejemplo); en Plus Incubation Time (Tiempo de incubación Plus), seleccione 32 Minutes.
      NOTA: Este protocolo tiene tres números de anticuerpos diferentes. El primer anticuerpo es FAP, el segundo es Pan-citoqueratina y el tercero es el Anticuerpo X.
    4. Haga clic en Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, luego en Antibody Blocking, elija Gt Ig Block, y para Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en Cy5, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    5. Haga clic en Secuencia dual y elija Desnaturalización de anticuerpos, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-1, y para Temperatura muy alta, elija 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en DS Inhibitor y seleccione Neutralizar.
    6. Haga clic en DS Antibody, y para Very Low Temperature, elija 37 Deg C. A continuación, en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 3 en este ejemplo) y, en Tiempo de incubación Plus, seleccione 32 minutos.
    7. Haga clic en DS Multimer HRP y elija DS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Ms HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en DS Rhodamine 6G, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    8. Haga clic en Triple tinción y seleccione Desnaturalización de anticuerpos TS, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-2, y para Temperatura muy alta, seleccione 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en Inhibidor de TS y seleccione TS Neutralize.
    9. Haga clic en Cuerpo TS y, para Temperatura muy baja, seleccione 37 grados C. A continuación, en Anticuerpo, seleccione el número de anticuerpos de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 7 en este ejemplo) y, en Plus Incubation Time, seleccione 32 Minutes.
    10. Haga clic en TS Multimer HRP y elija TS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en TS FAM y, para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    11. Agregue un título al protocolo. Seleccione un número de protocolo, agregue un comentario y haga clic en Activo seguido de Guardar.
  2. Preparar diapositivas, imprimir etiquetas e iniciar la ejecución del autostainer
    1. El vendedor de panadería adquirió secciones de tejido humano FFPE (fijadas en formalina, incrustadas en parafina) en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Mientras se hornean las diapositivas, imprima etiquetas haciendo clic en Crear etiqueta en el software de tinción automática. A continuación, haga clic en Protocolos, seleccione el número de protocolo y haga clic en Cerrar / Imprimir. Agregue información relevante en la etiqueta de la diapositiva y haga clic en Imprimir.
    2. Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente (RT). Aplique las etiquetas de protocolo previamente impresas a las diapositivas correspondientes.
    3. Cargue los dispensadores de anticuerpos recargables con anticuerpos de acuerdo con el número de etiqueta de anticuerpos asignado en el paso 1.1. En este protocolo, use el anticuerpo 6 para FAP a 1 μg/ml, use el anticuerpo 3 para la pancitoqueratina a 0,1 μg/ml y el anticuerpo 7 para el anticuerpo X a 2,5 μg/ml. Diluir cada anticuerpo en el diluyente especificado y preparar los dispensadores de anticuerpos recargables.
    4. Reúna los dispensadores de reactivos precargados de bloqueo, detección y amplificación mencionados anteriormente y colóquelos en una bandeja de reactivos. Cargue diapositivas en las bandejas de diapositivas (hasta 30 diapositivas por ejecución) y haga clic en En ejecución seguido de Sí. Tenga en cuenta que DAPI no se utiliza para la contratinción nuclear.
    5. Confirme el inicio de la ejecución comprobando la duración de la ejecución en el software autostainer. El protocolo tarda ~ 11 h en completarse y puede ejecutarse durante la noche.
    6. Al día siguiente, asegúrese de completar la carrera observando las luces verdes intermitentes en las ranuras de la bandeja deslizante. Luego, retire los portaobjetos del instrumento y enjuáguelos vigorosamente en 1x Tampón de reacción hasta que la solución líquida de cubreobjetos se elimine por completo.
  3. Protocolo de plataforma de perfilado espacial para ensayos proteómicos
    1. Siga el protocolo de proteómica espacial indicado en la nota a continuación. Incluya los siguientes cambios en el protocolo para habilitar el procedimiento de etiquetado automatizado 3-plex.
    2. Realice los pasos 1.2.1-1.2.6 el día antes de iniciar el protocolo de proteómica espacial y vaya directamente al paso de recuperación de antígenos del protocolo de proteómica espacial después de realizar el paso 1.2.6. Omita el procedimiento de visualización descrito en el protocolo de proteómica de perfiles espaciales.
    3. Reemplace SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM para permitir la integración de fluoróforos. Diluir SYTO 64 en 1x TBS e incubar en una cámara de humedad durante 15 min.
    4. Al configurar los parámetros de escaneo en la plataforma de perfilado espacial, seleccione los filtros y los canales de enfoque de acuerdo con los fluoróforos utilizados en el panel de visualización para permitir la integración 3-plex. Use FITC para DISCOVERY FAM y establezca la exposición en 200 ms, use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G y establezca la exposición en 200 ms, use Texas Red para SYTO 64 y establezca la exposición en 50 ms (especifique esto como el canal de enfoque) y, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5, establezca la exposición en 200 ms, y guardar cambios.
      NOTA: Las instrucciones detalladas del protocolo de proteómica de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de proteínas para nCounter usando Bond RX.

2. Selección del ROI para ensayos de transcriptómica espacial

  1. Hornear las secciones de pellets de células FFPE en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Siga el protocolo NGS de la plataforma de perfilado espacial indicado en la nota a continuación y escanee diapositivas en la plataforma de perfilado espacial, seleccionando tamaños de 50 μm y 300 μm. Se destaca la siguiente recomendación para el ensayo de transcriptómica espacial:
    1. Al preparar la biblioteca, si se seleccionaron varios tamaños de ROI, agrupe los ROI de tamaños similares para crear una biblioteca por tamaño. Esto es para garantizar que se logren suficientes profundidades de secuenciación para todos los ROI sin sesgo de tamaño.
      NOTA: Las instrucciones detalladas de la plataforma de creación de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de ARN para aplicaciones NGS que usan Bond RX.

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Representative Results

Protocolo de visualización automatizado para guiar la selección del ROI
En este documento, presentamos el uso de un protocolo IF automatizado y personalizado basado en TSA para visualizar el tejido y seleccionar ROI específicos. El desarrollo del panel de visualización utilizando melanoma y piel humana normal como tejidos de control consistió en pruebas de estabilidad de epítopos, ajuste fino de las intensidades de los marcadores y evaluación de sangrado a través de controles de dejar uno fuera. Para probar si la estabilidad del epítopo de los anticuerpos se ve afectada por pasos repetitivos de elución, las señales FAP y de anticuerpos X se evaluaron cualitativamente después del etiquetado en cada posición del 3-plex. La señal del anticuerpo X se mantuvo constante en todas las posiciones, mientras que la intensidad de la señal FAP disminuyó después de una elución (Figura 2). Estudios internos previos mostraron que el epítopo panCK es estable a lo largo de un ensayo 3-plex. Por lo tanto, FAP fue elegido para estar en la 1ª posición en el 3-plex, panCK se colocó en la 2ª y el Anticuerpo X en la3ª posición. Dado que la señal FAP fue más débil en general en comparación con el anticuerpo X y panCK, FAP se emparejó con el fluoróforo más brillante, Cy5.

El 3-plex automatizado se optimizó con controles de dejar uno fuera, donde cada marcador se omitió del protocolo 3-plex una vez para confirmar que no había sangrado en los canales vecinos (Figura 3).

Los fluoróforos utilizados en la plataforma de tinción automatizada se probaron en la plataforma de perfilado espacial para confirmar que los filtros son compatibles con los fluoróforos TSA en el panel de visualización 3-plex. Dado que el protocolo 3-plex utiliza FITC, Cy3 y Cy5, y el canal DAPI se utiliza para la escisión UV en la plataforma de perfiles espaciales, se tuvo que usar una contratinción nuclear en el canal rojo de Texas. Se probaron dos colorantes nucleares diferentes, SYTO 59 y SYTO 64, y los tintes mostraron una señal nuclear distinta en los tejidos del colon. Sin embargo, SYTO 59 también mostró alguna señal de sangrado en el canal Cy5, mientras que el canal Cy5 estaba limpio cuando se usó SYTO 64 (Figura 4). Por lo tanto, SYTO 64 fue la opción preferida para la detección nuclear.

Pruebas adicionales de SYTO 64 mostraron que este tinte no era fotoestable y fotoblanqueado rápidamente durante la obtención de imágenes. Una vez que la señal se blanquea, el sistema de imágenes se centra en el fondo, lo que podría interpretarse como una señal no específica (Figura 5). Aumentar la concentración del tinte nuclear para aumentar la intensidad de la señal ayudó a minimizar este problema.

Los tejidos marcados con el protocolo de visualización manual panCK/CD45, que utiliza anticuerpos conjugados directamente, se compararon con los tejidos marcados con el protocolo de visualización personalizada automatizada panCK/FAP/Antibody X. Ambos protocolos comparten panCK como marcador común, y la señal fue comparable entre los dos protocolos (Figura 6).

Para garantizar que un protocolo de visualización modificado no tenga impacto en el ensayo de proteómica espacial ascendente, comparamos los valores de recuento obtenidos después de la recopilación de la plataforma de perfiles espaciales y el procesamiento de la plataforma de recuento cuando se utilizó el protocolo de visualización manual panCK / CD45. Esto utiliza anticuerpos conjugados directamente o el protocolo de visualización personalizada automatizada 3-plex, que utiliza TSA. Cuatro tejidos de cáncer colorrectal (CCR) se marcaron con el protocolo de visualización manual panCK/CD45 o el protocolo de visualización personalizada automatizada 3-plex en combinación con el ensayo de proteómica espacial. Se eligieron ROI similares para cada protocolo, y los datos de recuento de los ROI correspondientes se compararon utilizando la normalización de limpieza para S6 e Histone. Se observaron tendencias similares entre estos ROI como se muestra en el mapa de calor log2 (Figura 7A), con un valor R de Spearman de 0.88 para todos los marcadores incluidos en el ensayo de proteómica espacial (Figura 7B). De los 31 anticuerpos utilizados en los ensayos, 23 anticuerpos tenían un valor R de Spearman mayor o igual a 0,5.

Como la proteómica espacial y los protocolos transcriptómicos difieren, evaluamos si el protocolo de visualización automatizada también podría aplicarse a los ensayos de transcriptómica espacial. El protocolo de visualización automatizada requiere que el ensayo IHQ se realice antes de la detección de ARN, mientras que el protocolo manual original detecta el ARN primero antes de aplicar el protocolo de visualización. El protocolo de visualización automatizada 3-plex se probó junto con el protocolo de visualización manual CK/CD45 en combinación con el ensayo de transcriptómica espacial. Los datos de secuenciación para el conteo del cuartil 3 (Q3) del protocolo de visualización automatizada 3-plex, normalizados en el software de perfilado espacial, presentaron valores más bajos en comparación con el protocolo de visualización manual CK/CD45 (Figura 8A), lo que también se refleja en los bajos valores R de Spearman de 0,15 (Figura 8B). Además, se observó una pérdida de rango dinámico al utilizar el protocolo automatizado de visualización 3-plex (Figura 8C).

Esta pérdida de recuentos con el protocolo de visualización automatizada indica que este protocolo compromete la integridad del ARN y que la detección del ARN antes de realizar el ensayo de visualización es necesaria para conservar la calidad del ARN. Dado que este panel de visualización automatizado requiere que la parte de la proteína se realice antes de la detección de ARN, este protocolo no es adecuado para ensayos de ARN.

Tamaño de la selección de ROI en ensayos de transcriptómica espacial
Para comprender mejor el impacto del tamaño del ROI en la salida de datos de ARN, se compararon los recuentos de ARN de diferentes tamaños de ROI. El ensayo de transcriptómica espacial se realizó en líneas celulares SUDHL1 y JURKAT para minimizar las diferencias inherentes a los tejidos. Se seleccionaron ROI circulares de 50 μm y 300 μm de diámetro y se compararon entre sí utilizando la normalización Q3 en el software de creación de perfiles espaciales. Los recuentos de ARN para objetivos seleccionados en diferentes líneas celulares fueron comparables entre los dos tamaños de ROI después de la normalización (Figura 9A, B).

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de perfiles espaciales digitales. (A) Las diapositivas están marcadas con anticuerpos (ensayo de proteómica espacial) o sondas (ensayo de transcriptómica espacial), así como marcadores de visualización. (B) Las diapositivas se colocan en la plataforma de perfiles espaciales para obtener imágenes y seleccionar ROI. (C) Los oligos se escinden con luz UV y se recogen en una placa de 96 pocillos. Este proceso se repite para cada ROI seleccionado. (D) Las muestras se procesan y los datos se generan utilizando la plataforma de conteo o un secuenciador. Esta cifra ha sido modificadadel sitio web 4,5 de Nanostring technologies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Estabilidad del epítopo. (A-C) Anticuerpo X y (D-F) FAP probados en piel humana normal y melanoma, respectivamente. Cada marcador en la (A,D) 1ª, (B,E) 2ª y (C,F) 3ª posición de un 3-plex. El anticuerpo X es estable en todas las posiciones, mientras que (D) FAP muestra una intensidad de señalización decreciente después de (E-F) una y dos eluciones, respectivamente. Anticuerpo X en verde, FAP en rojo, DAPI en gris. Las barras de escala están en 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Deje uno de los controles para el protocolo de visualización personalizado automatizado 3-plex en tejidos del páncreas humano. Para todas las imágenes, el anticuerpo X se representa en verde, panCK en cian y FAP en rojo. La primera fila muestra el (A) 3-plex y los canales simples para (B) Anticuerpo X en FITC, (C) panCK en Cy3 y (D) FAP en Cy5. La segunda fila muestra el control de dejar fuera 3-plex para (E) Anticuerpo X y (F-H) los canales individuales para cada marcador. La tercera fila muestra el control leave one out 3-plex para (I) panCK y (J-L) los canales individuales para cada marcador. La cuarta fila muestra el control de dejar uno fuera 3-plex para (M) FAP y (N-P) los canales individuales para cada marcador. No se observó sangrado en ninguno de los controles de dejar fuera como lo indica la falta de señal en los canales correspondientes cuando se probó (F) sin FAP, (K) sin panCK y (P) sin anticuerpo X. Las barras de escala están en 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Prueba de colorante SYTO. El canal rojo de Texas muestra la señal nuclear en Colón para (A) SYTO 59 con sangrado en (B) canal Cy5 (rojo). El canal rojo de Texas muestra la señal nuclear en Colón para (D) SYTO 64 sin sangrado en el canal (E) Cy5. Los canales Texas Red y Cy5 en Colon se muestran juntos para mostrar (C) sangrado de SYTO 59 y (F) ningún sangrado para SYTO 64. Las barras de escala están en 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Fotoestabilidad SYTO 64. Muestras de colon etiquetadas con SYTO 64 (A) antes y (B) después del fotoblanqueo. La imagen B muestra la señal no específica que se hace más visible después de la pérdida de señal nuclear. Las barras de escala están en 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Comparación del etiquetado panCK . señal panCK en muestras de cáncer colorrectal (CCR) con (A) protocolo de visualización manual panCK/CD45 y (B) protocolo de visualización automatizada panCK/FAP/Anticuerpo X. No se observaron diferencias en la señal panCK entre los dos protocolos. Las barras de escala están en 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Comparación de los valores de recuento para el ensayo de proteómica espacial utilizando dos protocolos de visualización diferentes en ROI similares de cuatro tejidos CRC. (A) Log 2 Mapa de calor de todos los marcadores incluidos en el ensayo de proteómica espacial que compara el protocolo manual panCK/CD45 (negro) con el protocolo automatizado 3-plex (gris). (B) La correlación de Spearman logarítmica 2 para todos los marcadores presenta un valor R de 0,88. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 7 o con el lenguaje de programación Python. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Comparación de los valores de recuento para el ensayo de transcriptómica espacial utilizando dos protocolos de visualización diferentes. (A) Log 2 Mapa de calor de objetivos seleccionados incluidos en el ensayo de transcriptómica espacial que compara el protocolo manual panCK/CD45 (negro) con el protocolo automatizado 3-plex (gris). (B) La correlación de Spearman logarítmica 2 para todos los marcadores presenta un valor R de 0,15. (C) La media (azul) y la desviación estándar donde se pierde el rango dinámico en el protocolo automatizado 3-plex. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 7 o con el lenguaje de programación Python. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Comparación de los valores de recuento de ARN para el ensayo de transcriptómica espacial en pellets celulares. Se observaron resultados comparables para ROI de 50 μm (negro) y 300 μm (gris) de diámetro para objetivos seleccionados en (A) SUDHL1 y (B) líneas celulares JURKAT. No se observaron diferencias significativas con la prueba t. Media y desviación estándar mostradas para n = 3 ROI por tamaño. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hasta la fecha, los anticuerpos fluorescentes directamente conjugados en un protocolo manual se utilizan más comúnmente como paneles de visualización para ensayos de proteómica espacial o transcriptómica espacial 9,10. Sin embargo, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados puede ser un desafío para los marcadores menos abundantes, lo que limita la selección de anticuerpos adecuados. Este protocolo muestra que el etiquetado de marcadores de visualización se puede automatizar en una plataforma de tinción automatizada utilizando tecnologías TSA para admitir ensayos de proteómica espacial. Esto permite una mayor flexibilidad en la personalización de los paneles de visualización, lo que permite una selección de ROI más específica y la adquisición de datos biológicos relevantes de áreas específicas de un tejido. La tecnología TSA también permite la visualización de marcadores de baja abundancia y, por lo tanto, aumenta el número de anticuerpos adecuados potenciales. Además, la automatización del protocolo de visualización garantiza la reproducibilidad y la calidad del procedimiento de etiquetado.

El desarrollo de un ensayo IF 3-plex requiere una evaluación cuidadosa de las intensidades de señal de marcador/fluoróforo en los tejidos de control apropiados. Se recomienda valorar las concentraciones de anticuerpos para obtener la mejor relación señal-ruido, lo que ayudará a minimizar el sangrado en canales adyacentes. Además, se debe probar la estabilidad del epítopo para cada marcador de interés para garantizar que el epítopo no se vea afectado por pasos repetidos de elución. Una vez que se confirma el orden de anticuerpos en el panel, el ensayo debe ajustarse utilizando controles de dejar uno fuera. Aquí, se omite un marcador específico en el panel, y el canal correspondiente en la imagen adquirida se revisa para el sangrado y la diafonía.

Aquí se demostró que los ensayos basados en TSA se pueden visualizar en la plataforma de perfiles espaciales, y que las alternativas DAPI deben usarse para la tinción nuclear. Probamos los colorantes SYTO y determinamos que al decidir qué tinte SYTO usar, la señal debe evaluarse cuidadosamente para evitar el sangrado en los canales adyacentes. Otra limitación del uso de colorantes SYTO es que algunos tintes SYTO fotoblanquean más rápido, como SYTO 64 y SYTO 83 (datos internos), lo que podría afectar la cuantificación nuclear. Por lo tanto, la exposición a la luz de los portaobjetos manchados debe evitarse tanto como sea posible. Otros grupos han demostrado el uso de SYTO 1311,12, que es más fotoestable (datos internos) y podría usarse en un panel siempre que los marcadores de interés se asignen a fluoróforos que sean compatibles con el colorante nuclear de elección.

Si bien los ensayos fluorescentes automatizados basados en TSA funcionaron bien para la visualización en combinación con los ensayos de proteómica espacial, aquí se determinó que la combinación de un protocolo de visualización automatizada 3-plex con un protocolo de transcriptómica espacial resultó en la pérdida de rango dinámico, lo que podría deberse a las condiciones más duras del protocolo de agregar pasos adicionales de recuperación / elución de antígenos que podrían afectar la integridad del ARN. Por lo tanto, el protocolo de visualización automatizada 3-plex solo debe adaptarse para ensayos de proteómica, lo cual es una limitación y requiere enfoques de visualización alternativos para ensayos basados en ARN. Como alternativa a la visualización en la misma diapositiva, las secciones seriadas teñidas con marcadores de interés podrían superponerse para facilitar la selección del ROI13. Además, la literatura describe el uso de la hibridación in situ en portaobjetos adyacentes para guiar la selección del ROI14. Sin embargo, estos enfoques podrían estar limitados por la disponibilidad de tejido, la variabilidad de sección a sección y los registros de célula a célula.

También probamos la usabilidad de diferentes tamaños de ROI para ensayos de transcriptómica espacial. El uso de pequeños ROI de 50 μm permite al investigador adquirir datos de regiones específicas, lo que permite una lectura más detallada de las células seleccionadas o áreas de interés. Las limitaciones de seleccionar pequeños ROI son que el número de células presentes puede no ser lo suficientemente abundante como para obtener valores de recuento que se pueden distinguir del fondo. Una opción es seleccionar poblaciones de células puras para capturar objetivos menos abundantes. Sin embargo, la selección del ROI para celdas individuales está limitada por la alta relación señal-ruido15. Además, es importante considerar los tamaños de ROI para la preparación de la biblioteca si se recopilan ROI de diferentes tamaños en un solo experimento. Si los tamaños de ROI difieren significativamente, puede ser beneficioso agrupar los ROI de acuerdo con sus tamaños y construir bibliotecas separadas para evitar que los ROI grandes estén sobrerrepresentados en una biblioteca. Esto también asegurará que cada ROI obtenga suficiente cobertura de secuenciación de acuerdo con su tamaño.

Otros factores a considerar al realizar experimentos de ómica espacial son que los datos podrían mostrar variaciones debido a la variabilidad de diapositiva a diapositiva, y una menor expresión de ciertos objetivos puede generar antecedentes y diferencias en los valores de correlación. Es necesario considerar controles adecuados y enfoques de normalización al planificar experimentos y evaluar datos. Para los ensayos de proteómica espacial en nCounter, la normalización a los objetivos de mantenimiento o a las IgG de control negativo son los métodos preferidos de acuerdo con la experiencia interna y las recomendaciones del proveedor donde la correlación entre los objetivos de mantenimiento o con las IgG de control negativo debe ser evaluada16. Sin embargo, dependiendo de los tejidos utilizados, la mejor normalización necesita ser definida para cada estudio17,18. Por ejemplo, la literatura indica que para los estudios de ómicas espaciales sobre el cáncer de mama, GAPDH, que se usa comúnmente para normalizar los objetivos de limpieza, ha sido menos concordante que S6 y la histona19. Por lo tanto, S6 e histona han sido los objetivos de limpieza recomendados para la normalización en los tejidos del cáncer de mama19.

Para los ensayos de transcriptómica espacial, las estrategias de normalización deben definirse según el diseño del estudio (p. ej., tipos de tejido y selección de ROI). Algunas estrategias que se utilizan en RNA-Seq, como el cuartil superior o la normalización de la media recortada de los valores M (TMM), podrían aplicarse para normalizar los datos secuenciados19,20.

Los ensayos de transcriptómica espacial proporcionan información sobre miles de objetivos y se están utilizando cada vez más comúnmente para explorar todo el transcriptoma, donde se seleccionan y analizan compartimentos específicos de TME junto con RNA-seq20 de núcleo único o secuenciación de ARN de una sola célula21. Demostramos que los protocolos de visualización para guiar la selección del ROI para evaluar la distribución espacial de los objetivos podrían automatizarse para los ensayos de proteómica espacial, pero no para los ensayos de transcriptómica espacial. Además, presentamos que se pueden seleccionar ROI tan pequeños como 50 μm para permitir una investigación más profunda de una región de tejido en particular. Las aplicaciones futuras de esta tecnología mejorarán la comprensión del microambiente tumoral.

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Disclosures

Verónica Ibarra-López, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modriestán y Sandra Rost son empleadas y accionistas de Genentech, miembro del Grupo Roche. Otras empresas que forman parte de Roche producen reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito. Ciara Martin es empleada a tiempo completo de NanoString Technologies Inc, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito.

Acknowledgments

Los autores reconocen a Thomas Wu por procesar archivos NGS. Agradecemos a James Ziai por las discusiones de resultados y la revisión del manuscrito y a Meredith Triplet y Rachel Taylor por la revisión interna del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris buffered saline (TBS) Cell Signaling Technologies 12498S Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed) antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water ThermoFisher AM9922 Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) Ventana 950-500
DISCOVERY Cy5 Kit Ventana 760-238 Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit Ventana 760-243 Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block Ventana 760-6008 Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP Ventana 760-4310 Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP Ventana 760-4311 Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit Ventana 760-244 Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System Ventana 05 987 750 001 / N750-DISU-FS Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler NanoString GMX-DSP-1Y Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber Simport M920-2 Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody Abcam Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Python Python Statistical analysis
Reaction Buffer (10x) Ventana 950-300
Statistical analysis software GraphPad Prism 7 Statistical analysis
SYTO 64 ThermoFisher S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana 950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein Ventana 760-219 Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser Ventana Catalog number depends on dispenser number

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References

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Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual
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Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, Y. A., Martin, C., Modrusan, Z., Rost, S. Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection. J. Vis. Exp. (185), e62651, doi:10.3791/62651 (2022).

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