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Neuroscience

केनोरहाब्डिस एलिगेंस में इमेजिंग डेंड्राइटिक स्पाइन

Published: September 27, 2021 doi: 10.3791/62676
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 2Program of Neuroscience, Vanderbilt University

Summary

डेंड्राइटिक स्पाइन तंत्रिका तंत्र की महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताएं हैं। यहां सी एलिगेंस में डेंड्राइटिक स्पाइन की संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए लाइव इमेजिंग विधियों का वर्णन किया गया है। ये दृष्टिकोण जीन के लिए उत्परिवर्ती स्क्रीन के विकास का समर्थन करते हैं जो डेंड्राइटिक रीढ़ के आकार या कार्य को परिभाषित करते हैं।

Abstract

डेंड्राइटिक स्पाइन गतिविधि द्वारा नियंत्रित सिनैप्टिक संक्रमण की विशेष साइटें हैं और सीखने और स्मृति के लिए सब्सट्रेट के रूप में कार्य करती हैं। हाल ही में, डीडी जीएबीएर्जिक न्यूरॉन्स के लिए डेंड्राइटिक स्पाइन को केनोरहाब्डिस एलिगेंस के मोटर सर्किट में प्रीसिनेप्टिक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स से इनपुट साइटों के रूप में वर्णित किया गया है। यह सिनैप्टिक सर्किट अब स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विवो मॉडल में एक शक्तिशाली नए के रूप में काम कर सकता है जो आसान आनुवंशिकी और सी की तैयार पहुंच का फायदा उठाता है । लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एलिगेंस।

यह प्रोटोकॉल डीडी रीढ़ संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीतियों का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण में, एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग रणनीति का उपयोग एक्टिन-समृद्ध डेंड्राइटिक स्पाइन के जटिल आकार की कल्पना करने के लिए किया जाता है। डीडी स्पाइन फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए, प्रकाश-सक्रिय ऑप्सिन, क्रिमसन, प्रीसिनेप्टिक कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है, और कैल्शियम संकेतक, जीसीएएमपी, पोस्टसिनेप्टिक डीडी स्पाइन में उत्पन्न कैल्शियम क्षणिकता की रिपोर्ट करता है। साथ में, इन विधियों में सी एलिगेंस में डेंड्राइटिक स्पाइन के आनुवंशिक निर्धारकों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण शामिल हैं जो मस्तिष्क में स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और कार्य को भी निर्देशित कर सकते हैं।

Introduction

डेंड्राइटिक स्पाइन विशेष सेलुलर संरचनाएं हैं जो सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के लिए पड़ोसी न्यूरॉन्स से इनपुट प्राप्त करती हैं। न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स का सक्रियण इन विशिष्ट न्यूरोनल प्रोट्रूशियंस में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों को बढ़ाता है। न्यूरोट्रांसमिशन के लिए डेंड्राइटिक स्पाइन के मौलिक महत्व और न्यूरोडेवलपमेंटल रोगों में उनके गलत विनियमनके कारण, डेंड्राइटिक स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और फ़ंक्शन को संशोधित करने वाले कारकों की खोज तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में उच्च रुचि है।

हाल ही में, स्तनधारी रीढ़ 2 के साथ साझा की गई प्रमुख विशेषताओं के आधार पर सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में डेंड्राइटिक स्पाइनकी पहचान की गई है। यह निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि यह रीढ़ जीव विज्ञान की जांच के लिए सी एलिगेंस के फायदों का फायदा उठाने की संभावना खोलता है। पृष्ठीय डी (डीडी) मोटर न्यूरॉन्स पर डेंड्राइटिक स्पाइन वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (चित्रा 1 ए) 2,3,4 में कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (वीए और वीबी) से इनपुट प्राप्त करते हैं। यहां, डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन की संरचना और एक बरकरार तंत्रिका तंत्र में विवो में उनके कार्य का पता लगाने के लिए इमेजिंग विधियां प्रस्तुत की जाती हैं जो लाइव इमेजिंग और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए आसानी से सुलभ है। डेंड्राइटिक स्पाइन के आकार की निगरानी के लिए, (1) साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जो डेंड्राइटिक प्रक्रिया और रीढ़ को भरते हैं; (2) झिल्ली-बाध्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जो डेंड्राइटिक स्पाइन और डेंड्राइट की सीमा को सजाते हैं; या (3) एक्टिन मार्कर, लाइफएक्ट5 या यूट्रोफिन6, जो डेंड्राइटिक स्पाइन में समृद्ध होते हैं, का उपयोग किया जाता है, इस प्रकार उनके आकार का खुलासा होता है। डीडी स्पाइन की कार्यक्षमता की निगरानी करने के लिए, जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस का उपयोग प्रीसिनेप्टिक कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स 7 में लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन, क्रिमसन के सक्रियण से उत्पन्न सीए ++ क्षणिकता का पता लगाने के लिए किया जाताहै। दोनों रणनीतियों से जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती जानवरों में डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन के अध्ययन की सुविधा मिलने की उम्मीद है।

Protocol

1. डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन की संरचना का निर्धारण

  1. डीडी स्पाइन को लेबल करने के लिए ट्रांसजेनिक कीड़े बनाएं
    1. रुचि के लेबल के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर बनाने के लिए एफएलपी -13 प्रमोटर का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्मिक एमचेरी, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::uट्रोफिन) (चित्रा 1)। पूरक फ़ाइल 1 में प्लास्मिड की पूरी सूची देखें।
    2. डीडी स्पाइन 8,9 ट्रांसजेनिक लाइन लेबलिंग उत्पन्न करने के लिए स्थापित तरीकों का उपयोग करें।
  2. सीलेंट तैयार करें
    1. पैराफिन-आधारित एम्बेडिंग माध्यम10 का 1: 1 मिश्रण बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. पिघलने तक माध्यम को 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, फिर 1.5 एमएल कैप्ड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एलिकोट करें और 60-70 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक बनाए रखें।
      नोट: सीलेंट हीटिंग ब्लॉक में 4 सप्ताह तक रह सकता है।
  3. एनेस्थेटिक तैयार करें।
    1. 1% ट्राइकेन और 1 एम लेवैमिसोल के आसुत एच2ओ में स्टॉक समाधान बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. चरण 1.3.3-1.3.5 11 में वर्णित 0.05% ट्राइकेन और15 एमएम लेविसोल एनेस्थेटिक का एक कामकाजी समाधान तैयार करें।
    3. 1% ट्राइकेन स्टॉक के 75 μL और 1 M levamisole के 22.5 μL मिलाएं।
    4. 1.5 एमएल की अंतिम मात्रा में एम 9 बफर जोड़ें।
    5. 0.05% ट्राइकेन का एलिकोट 10 μL, 15 mM levamisole 0.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और -20 °C पर स्टोर करता है।
      नोट: एनेस्थेटिक मिश्रण तापमान के प्रति संवेदनशील है, और प्रत्येक प्रयोग के लिए पिघलने के बाद काम करने वाले समाधान के अलग-अलग एलिकोट को फिर से नहीं बनाया जाना चाहिए। एम 9 बफर के लिए एक नुस्खा के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें।
  4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करें
    1. 10% अगारोस तैयार करें और इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में बनाए रखें।
      नोट: वर्मबुक12 में मोनिका ड्रिस्कॉल की रिपोर्ट देखें।
    2. 15-20 युवा वयस्कों को 10% अगारोस पैड पर माउंट करें और 3 μL एनेस्थेटिक जोड़ें (चरण 3 देखें)।
    3. कवरस्लिप लागू करें (कीड़े 5 मिनट के भीतर स्थिर हो जाते हैं)।
    4. पिघले हुए चिपकने वाले सीलेंट मिश्रण के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. छवियाँ प्राप्त करें
      1. सुपर-रिज़ॉल्यूशन अधिग्रहण
        1. एक छोटे पिक्सेल आकार (जैसे, < 50 एनएम) प्राप्त करने के लिए 63x/1.40 प्लान-एपोक्रोमैट ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए सुसज्जित लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। निर्माता के सॉफ़्टवेयर द्वारा अनुशंसित चरण आकार का उपयोग करके जेड-स्टैक्स प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
        2. ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला एकत्र करें जो डीडी वेंट्रल प्रक्रिया की कुल मात्रा को फैलाते हैं (उदाहरण के लिए, 0.19 μm चरण आकार या 2- 3μm मोटी पर 15-20 स्लाइस)। निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण के लिए जेड-स्टैक्स जमा करें और 7 से अधिक स्कोर के साथ छवियों का विश्लेषण करें (चित्रा 1 बी, चित्रा 2 और चित्रा 3)।
      2. Nyquist अधिग्रहण
        1. उपयोग में प्रकाश की तरंग दैर्ध्य और उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर के लिए इष्टतम पिक्सेल आकार का चयन करने के लिए लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, 40x / 1.4 प्लान फ्लोर ऑयल ऑब्जेक्टिव)।
          नोट: छोटे पिक्सेल आकार डीडी रीढ़ की ठीक संरचना को प्रकट करेगा।
        2. स्वचालित एल्गोरिथ्म का उपयोग करके 3 डी डीकन्वोल्यूशन के लिए स्टैक सबमिट करें ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 3)।
      3. सबसे छोटे जेड-चरण संभव का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, पीजो चरण द्वारा निर्धारित) क्योंकि जेड में ओवरसैंपलिंग 3 डी डीकन्वोल्यूशन13 के बाद तेज छवियां उत्पन्न कर सकती है।
  5. छवि विश्लेषण
    1. जेड-स्टैक्स14 के अधिकतम तीव्रता अनुमान बनाने के लिए उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    2. डीडी डेंड्राइट पर प्रोट्रूशियंस को मैन्युअल रूप से गिनती करें।
      नोट: प्रोट्रूशियंस मुख्य शाफ्ट (चित्रा 1 बी, एरोहेड) से लंबवत विस्तार हैं।
    3. डीडी डेंड्राइट के प्रति 10 μm रीढ़ के घनत्व की गणना करने के लिए प्राप्त डीडी डेंड्राइट की लंबाई निर्धारित करें (चित्रा 1 सी)।
    4. रीढ़ को पतले/मशरूम, फिलोपोडियाल, स्टब्बी या ब्रांकेड के रूप में वर्गीकृत करें (चित्र 2ए)।
      मशरूम रीढ़ एक संकीर्ण आधार (गर्दन) और एक व्यापक नोक (सिर) प्रदर्शित करती है। फिलोपोडियाल रीढ़ एक संकुचित आधार (कोई गर्दन नहीं) प्रदर्शित नहीं करती है, लेकिन एक निरंतर चौड़ाई होती है। स्टब्बी स्पाइन में एक विस्तृत आधार और नोक होती है। शाखित रीढ़ एक से अधिक नोक के साथ प्रोट्रूशियंस हैं।

2. प्रीसिनेप्टिक कोलीनर्जिक सिग्नलिंग द्वारा डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन के सक्रियण का आकलन करना

  1. पारंपरिक तकनीकों का उपयोग करके ट्रांसजेनिक कीड़े बनाएं (उदाहरण के लिए, माइक्रोइंजेक्शन) 8,9
    1. प्रीसिनेप्टिक वीए न्यूरॉन्स (चित्रा 4 ए) में एक लाल-स्थानांतरित चैनलरोडोप्सिन, क्रिमसन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए डीडी न्यूरॉन्स में सीए ++ सेंसर, जीसीएएमपी 6 एस और अनसी -4 प्रमोटर की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एफएलपी -13 प्रमोटर का उपयोग करें। पूरक फ़ाइल 1 में प्लास्मिड की सूची देखें।
  2. ऑल-ट्रांस रेटिना (एटीआर) और नियंत्रण प्लेटें तैयार करें।
    नोट: एटीआर एक ऑप्टोजेनेटिक रूप से सक्रिय आयन चैनल के रूप में कार्य करने के लिए क्रिमसन के लिए एक आवश्यक कोफ़ेक्टर है।
    1. इथेनॉल (100%) में 100 एमएम एटीआर स्टॉक समाधान तैयार करें। 1 mL एलिकोट में -20 °C पर स्टोर करें।
    2. एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत, प्रत्येक 60 मिमी एनजीएम (नेमाटोड ग्रोथ मीडियम) पोषक तत्व एगर प्लेट में रात भर ओपी 50 बैक्टीरियल कल्चर के 300 μL और 0.25 μL एटीआर जोड़ें और बाँझ ग्लास रॉड के साथ फैलाएं।
    3. नियंत्रण के लिए, एनजीएम प्लेटों के एक अलग समूह में ओपी 50 बैक्टीरिया के 300 μL और इथेनॉल के 0.25 μL (100%) जोड़ें।
    4. बैक्टीरिया के विकास की अनुमति देने के लिए प्लेटों को कमरे के तापमान पर 24 घंटे (परिवेश प्रकाश से संरक्षित) पर हुड में बैठने दें।
      नोट: प्लेटों का उपयोग प्रारंभिक 24 घंटे के बाद किया जा सकता है इनक्यूबेशन या 5 दिनों के भीतर उपयोग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है।
  3. प्रयोग सेट-अप करना
    1. ओपी 50-बीज वाले एटीआर या नियंत्रण प्लेटों पर पांच एनसी 3569 एल 4-चरण लार्वा रखें जिनमें एटीआर की कमी होती है और 23 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बढ़ते हैं।
    2. तीन दिन बाद, एटीआर से एल 4 चरण संतान चुनने के लिए वल्वा विकास की पुष्टि करने के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और चरण 2.4.1-2.4.3 में वर्णित इमेजिंग के लिए प्लेटों को नियंत्रित करें।
    3. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर, 0.05 μm पॉलीबीड्स (2.5% ठोस w /v) का 2 μL रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. घोल में सुपर गोंद का एक छोटा ग्लोब्यूल जोड़ने के लिए प्लैटिनम तार ("वर्म पिक") का उपयोग करें और गोंद के फिलामेंटस "स्ट्रैंड" उत्पन्न करने के लिए धीरे से घुमाएं। फिर M9 बफर (चित्रा 4B) के 3 μL जोड़ें।
    5. घोल में लगभग दस एल 4 लार्वा रखें और एक कवरस्लिप लागू करें।
      नोट: गोंद फाइबर यादृच्छिक रूप से कीड़े से संपर्क करेंगे और कवरस्लिप लागू होने के बाद उन्हें गतिहीन कर देंगे। गोंद के बड़े ग्लोब्यूल्स में एम्बेडेड कीड़े विकृत दिखाई देते हैं और उन्हें चित्रित नहीं किया जाना चाहिए।
    6. चरण 1.4.4 में उल्लिखित कवरस्लिप के सील किनारे।
  4. डेंड्राइटिक रीढ़ में उत्पन्न सीए ++ क्षणिकों की रिकॉर्डिंग।
    1. एक संवेदनशील सीसीडी कैमरा, 100x TIRF तेल उद्देश्य लेंस, और 488 nm और 561 nm लेजर लाइनों से लैस एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. फोकल प्लेन में डीडी स्पाइन को स्थिति देने के लिए माइक्रोस्कोप चरण समायोजित करें।
    3. नमूना को 488 एनएम लेजर लाइन प्रत्येक फ्रेम (जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए) और आवधिक अंतराल पर 561 एनएम लेजर लाइन (क्रिमसन उत्तेजना के लिए) के साथ रोशन करने के लिए टाइम-लैप्स अधिग्रहण सेट-अप करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, जीसीएएमपी 6 सिग्नल के लगातार स्नैपशॉट (200 एमएस) को कैप्चर करने के लिए 488 एनएम प्रकाश का उपयोग करें, जो हर 5 वें फ्रेम में 561 एनएम प्रकाश के 200 एमएस पल्स के साथ युग्मित है (चित्रा 4 सी-ई)। इस विन्यास के साथ, प्रत्येक 561 एनएम पल्स से पहले और बाद में जीसीएएमपी स्तर ~ 1 एस अलग (वीए सक्रियण से पहले जीसीएएमपी का पता लगाने के लिए 488 एनएम लेजर के 200 एमएस, वीए को सक्रिय करने के लिए 561 एनएम पल्स के 200 एमएस और लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर के बीच स्विच करने के लिए ~ 600 एमएस) का पता लगाया जाता है। इस सेट-अप के साथ, वीए न्यूरॉन्स हर 2.5 सेकंड में सक्रिय होते हैं।
  5. विवो सीए ++ इमेजिंग में विश्लेषण
    1. अधिग्रहण के दौरान कृमि आंदोलन से उत्पन्न होने वाले मामूली विचलन को ठीक करने के लिए 2 डी-डीकन्वोल्यूशन और छवि संरेखण का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन को रुचि के क्षेत्र (आंकड़े 4 सी-डी में आरओआई) के रूप में परिभाषित करें।
    3. आरओआई को डुप्लिकेट करें और पृष्ठभूमि संकेत (यानी, शोर) एकत्र करने के लिए कीड़े के अंदर एक पड़ोसी क्षेत्र में स्थानांतरित करें।
    4. प्रत्येक समय बिंदु के लिए उत्कृष्टता प्राप्त करने के लिए GCaMP6s तीव्रता निर्यात करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। रीढ़ आरओआई प्रतिदीप्ति से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएं।
    5. उत्तेजना के तुरंत बाद प्रत्येक समय-बिंदु से 561 एनएम उत्तेजना (एफ 0) से ठीक पहले फ्रेम में जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस को घटाकर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन निर्धारित करें, फिर एएफ / एफ 0 निर्धारित करने के लिए एफ 0 से विभाजित करें (चित्रा 4 ई)।
    6. सामान्यीकृत निशान ग्राफ़ करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. 561 एनएम प्रकाश की प्रत्येक पल्स से पहले और बाद में जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस के प्रत्येक माप के लिए एक युग्मित सांख्यिकीय परीक्षण करें।
      नोट: यह दृष्टिकोण प्रभावी रूप से GCaMP6s प्रतिदीप्ति में यादृच्छिक उतार-चढ़ाव को शामिल नहीं करता है जो अन्यथा 561 nm उत्तेजना से पहले और बाद में सभी मापों से औसत GCaMP6s सिग्नल की तुलना करने की सांख्यिकीय शक्ति को कम करता है (चित्रा 4 एफ)।
    8. सामान्य या गॉसियन वितरण दिखाने वाले मापों के लिए, एक युग्मित पैरामीट्रिक एनोवा परीक्षण का उपयोग करें और दो समूहों में से प्रत्येक के लिए कई तुलनाओं के लिए सही करें (एटीआर पहले बनाम बाद में, कोई एटीआर पहले बनाम बाद में नहीं)। वैकल्पिक रूप से, उन डेटा के लिए जो सामान्य रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, कई परीक्षणों के लिए पोस्टहॉक सुधार के साथ एक गैर-पैरामीट्रिक एनोवा का उपयोग करें।
      नोट: एटीआर ("कोई एटीआर") की कमी वाली प्लेटों पर उगाए गए कीड़े आवश्यक नियंत्रण हैं और उन्हें 561 एनएम-सक्रिय सीए ++ ट्रांसिएंट्स नहीं दिखाना चाहिए क्योंकि एटीआर को क्रिमसन फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है।

Representative Results

तीन स्वतंत्र मार्करों (साइटोसोलिक एमचेरी, लाइफ एक्ट:: जीएफपी, एमवाईआर:: एमरूबी) के साथ माप ने जंगली प्रकार के युवा वयस्कों में डीडी डेंड्राइट के प्रति 10 μm डीडी डेंड्राइट ± 3.4 ± 1.03 डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन का औसत घनत्व प्राप्त किया (चित्रा 1 बी, सी)। इस विश्लेषण के लिए, जीएफपी के साथ प्राप्त माप:: यूट्रोफिन मार्कर जो काफी कम रीढ़ घनत्व उत्पन्न करते थे, को एक्टिन साइटोस्केलेटन6 के साथ यूट्रोफिन की बातचीत के कारण बाहर रखा गया था (2.4 ± 0.74, चित्रा 1) जो संभावित रूप से रीढ़ मोर्फोजेनेसिस15 को चलाता है। प्रकाश माइक्रोस्कोप में रीढ़ घनत्व के माप डीडी1 न्यूरॉन 2 के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से 12 रीढ़ के पुनर्निर्माण से प्राप्त 4.2 रीढ़ / 10 μm डेंड्राइट के मूल्य के बराबर हैं। लाइव-सेल इमेजिंग दृष्टिकोण ने पुष्टि की कि डीडी रीढ़ की पतली / मशरूम के आकार की आकृति विज्ञान वयस्क बनाम वैकल्पिक रीढ़ के आकार (जैसे, फिलोपोडियाल, स्टब्बी, ब्रांकेड) (चित्रा 2 बी) में प्रबल है, जो परिपक्व स्तनधारी तंत्रिका तंत्र16 में रीढ़ के लिए भी विशिष्ट है।

एक ऑप्टोजेनेटिक रणनीति का उपयोग यह पूछने के लिए किया गया था कि क्या उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 और चित्रा 2) द्वारा पता लगाए गए अनुमानित डेंड्राइटिक स्पाइन प्रीसिनेप्टिक साइटों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए उत्तरदायी हैं, जो स्तनधारी न्यूरॉन्स में डेंड्राइटिक स्पाइन की एक विशिष्ट पहचान है। ग्रीन लाइट (561 एनएम) का उपयोग प्रीसिनेप्टिक कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स और ब्लू लाइट (488 एनएम) में एक चैनलरोडोप्सिन संस्करण, क्रिमसन को सक्रिय करने के लिए किया गया था ताकि पोस्टसिनेप्टिक डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन में साइटोप्लाज्मिक जीसीएएमपी जांच द्वारा उत्सर्जित सीए ++ -निर्भर प्रतिदीप्ति का पता लगाया जा सके। इस प्रयोग ने प्रीसिनेप्टिक वीए न्यूरॉन्स (चित्रा 3) में क्रिमसन के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण के तुरंत बाद डीडी स्पाइन में जीसीएएमपी सिग्नल के क्षणिक विस्फोट का पता लगाया। इस प्रयोग की सफलता सभी प्रीसिनेप्टिक वीए न्यूरॉन्स में क्रिमसन की विश्वसनीय अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है। इस मामले में, लगातार वीए अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए पीअनसी -4: क्रिमसन मार्कर के क्रोमोसोमल इंटीग्रेंट17 का उपयोग किया गया था। यह प्रयोग एक एक्स्ट्राक्रोमोसोमल सरणी के साथ भी आयोजित किया जा सकता है। एक विशिष्ट वीए न्यूरॉन में क्रिमसन अभिव्यक्ति की स्वतंत्र रूप से पुष्टि की जा सकती है, उदाहरण के लिए, क्रेमसन ट्रांसजेन को एक डाउनस्ट्रीम परमाणु-स्थानीयकृत जीएफपी के साथ एसएल 2 ट्रांसप्लिस्ड लीडर अनुक्रम में सह-अभिव्यक्ति मार्कर2 के रूप में जोड़कर। एटीआर की अनुपस्थिति में एक नियंत्रण प्रयोग करना आवश्यक है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि मापा गया जीसीएएमपी सिग्नल क्रिमसन के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण पर निर्भर करता है, जो सख्ती से एटीआर-निर्भर है (चित्रा 4 डी)। अंत में, क्योंकि उत्पन्न सीए ++ सिग्नल क्षणिक हैं, इसलिए एक इमेजिंग प्रोटोकॉल को अपनाना महत्वपूर्ण है जो 561 एनएम उत्तेजना और 488 एनएम लेजर (चित्रा 4) के साथ जीसीएएमपी सिग्नल अधिग्रहण के बीच तेजी से स्विचिंग (<1 एस) की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्र 1: डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन की लेबलिंग। (ए) (शीर्ष) सी एलिगेंस के उदर तंत्रिका कॉर्ड में छह पृष्ठीय डी (डीडी 1-डीडी 6) न्यूरॉन्स। (नीचे) वयस्कों में, वेंट्रल निर्देशित डीडी स्पाइन (एरोहेड) वेंट्रल ए (वीए) और वेंट्रल बी (वीबी) मोटर न्यूरॉन्स (मैजेंटा) के प्रीसिनेप्टिक टर्मिनलों से संपर्क करते हैं, और डीडी कमिसर्स शरीर की मांसपेशियों (तीर) 18 को जीबीएर्जिक आउटपुट प्रदान करने के लिए पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड तक विस्तारित होते हैं। इस आंकड़े को संदर्भ2 से संशोधित किया गया है। (बी) साइटोसोलिक एमचेरी, माइरिस्टोयलेटेड एमरूबी (एमवाईआर:: एमरूबी), लाइफ एक्ट:: जीएफपी और जीएफपी:: युवा वयस्क कीड़े में यूट्रोफिन के साथ लेबल किए गए डीडी स्पाइन के फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ (एयरिस्कैन)। ग्रे एरोहेड रीढ़ की ओर इशारा करते हैं। (सी) साइटोसोलिक एमचेरी (3.77 ± 0.9), एमवाईआर:: एमरूबी (3.09 ± 0.8), लाइफएक्ट:: जीएफपी (3.44 ± 1.1) या जीएफपी: यूट्रोफिन (2.41 ± 0.8) के साथ लेबल किए गए डीडी न्यूरॉन डेंड्राइटिक स्पाइन का घनत्व (स्पाइन / सभी नमूने सामान्य रूप से वितरित किए जाते हैं। वन-वे एनोवा से पता चलता है कि साइटोसोलिक एमचेरी के लिए रीढ़ घनत्व, MYR::mRuby, और LifeAct:: GFP काफी अलग नहीं हैं (NS), जबकि जीएफपी के लिए रीढ़ घनत्व कम हो जाता है:: यूट्रोफिन बनाम। साइटोसोलिक रूप से लेबल एमचेरी (पी = 0.0016) और लाइफएक्ट:: जीएफपी (पी = 0.0082)। डैश्ड लाल रेखा 3 डी ईएम पुनर्निर्माण (4.2 रीढ़ / 10 μm) से मूल्यांकन किए गए डीडी न्यूरॉन्स के रीढ़ घनत्व का प्रतिनिधित्व करती है। इस आंकड़े को संदर्भ2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन। (ए) (शीर्ष) रीढ़ के आकार का योजनाबद्ध। (नीचे) प्रत्येक प्रकार की रीढ़ की एयरिस्कैन छवियां (स्केल बार = 500 एनएम) लाइफएक्ट के साथ लेबल की गई हैं: जीएफपी (हरा) और उच्च दबाव जमे हुए वयस्क (नीले) के सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ द्वारा 3 डी-पुनर्निर्माण। (ख) प्रकार के अनुसार रीढ़ की आवृत्ति, जीवन अधिनियम के साथ कल्पना की गई: जीएफपी: पतला/मशरूम (555 ± 145%), फिलोपोडियाल (103 ± 870%), स्टबी (188 ± 107%), शाखित (1542 ± 601%)। मशरूम (52.2 ± 16.5%), फिलोपोडियाल (5.68 ± 7.0%), स्टबी (33.1 ± 14.8%), शाखित (9.02 ± 9.6%)। अप्रकाशित टी-टेस्ट, फिलोपोडियाल (पी = 0.0339); स्टब्बी (पी = 0.0009) और शाखित (पी = 0.011) रीढ़ MYR::mRuby मार्कर के साथ लेबल किए गए जीवन अधिनियम:: GFP से काफी भिन्न हैं। इस आंकड़े को संदर्भ2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए-बी) (शीर्ष) डीडी 1 डेंड्राइट की फ्लोरोसेंट छवियों को (ए) एयरिस्कैन डिटेक्टर और (बी) निक्विस्ट अधिग्रहण द्वारा साइटोसोलिक मार्कर (एमचेरी) के साथ लेबल किया गया है। (नीचे) डीडी डेंड्राइट (लाल) को एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (फिलामेंट ट्रेसर का ऑटो-पथ विकल्प) के साथ चित्रित किया गया है, और डीडी स्पाइन (नीला) को अर्ध-स्वचालित स्पाइन डिटेक्शन मॉड्यूल का उपयोग करके ग्राफिक रूप से चित्रित किया गया है। तीर C और D में बढ़ी हुई शाखित रीढ़ को इंगित करता है। एरोहेड C और D में बढ़े हुए पड़ोसी पतले/मशरूम रीढ़ को दर्शाते हैं। स्केल बार = 2 μm. (C-D) (C-D) (शीर्ष) शाखित रीढ़ (तीर) और (नीचे) दो पड़ोसी पतली/मशरूम रीढ़ (तीर) के बढ़े हुए उदाहरण (C) ऐरिस्कैन डिटेक्टर या (D) Nyquist अधिग्रहण के साथ प्राप्त होते हैं। स्केल बार = 500 एनएम। डेटा 2 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डीडी स्पाइन के कार्य का आकलन करना। (ए) डीडी मोटर न्यूरॉन्स सीए ++ संकेतक जीसीएएमपी 6 एस (हरा) व्यक्त करते हैं, और वीए मोटर न्यूरॉन्स चैनलरोडोप्सिन-संस्करण, क्रिमसन (मैजेंटा) 7 को व्यक्त करते हैं। (बी) सीए ++ माप के लिए कीड़े को बढ़ाने के लिए योजनाबद्ध चित्रण विधि। (1) एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर, (2) 0.05 μm पॉली बीड्स का 2 μL रखें, (3) सुपर गोंद के एक छोटे ग्लोब्यूल को जोड़ने के लिए प्लैटिनम तार ("वर्म पिक") का उपयोग करें और (4) गोंद के फिलामेंटस स्ट्रैंड उत्पन्न करने के लिए घोल में घूमें। (5) एम 9 बफर का 3 μL जोड़ें। (6) घोल में लगभग दस एल 4 लार्वा रखें, (7) वैसलीन / मोम के साथ कवरस्लिप और सील किनारों को लागू करें। (सी-डी) वीए न्यूरॉन्स का सक्रियण डीडी 1 रीढ़ में सीए ++ क्षणिक के साथ संबंधित है। जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस इमेज्ड (0.5 सेकंड अंतराल पर) क्रिमसन (2.5 एस अंतराल) के आवधिक प्रकाश सक्रियण के साथ (सी) + एटीआर (एन = 12) के साथ सीए ++ क्षणिक ों को जन्म देता है, लेकिन (डी) नियंत्रण (-एटीआर, एन = 12) में नहीं। पैनल समय (ओं), 561 एनएम प्रकाश (ऊर्ध्वाधर गुलाबी रेखा) की पल्स से पहले और बाद में स्नैपशॉट हैं। GCaMP6s सिग्नल प्रत्येक रीढ़ की नोक पर ROI (रुचि के क्षेत्र) से प्राप्त किया जाता है। (ई) 10 सेकंड की रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस + एटीआर (हरा) बनाम -एटीआर (नियंत्रण, ग्रे) (एन = 12 वीडियो) के लिए प्लॉट किया गया था। ऊर्ध्वाधर गुलाबी सलाखों 561 एनएम रोशनी को दर्शाता है (उदाहरण के लिए, क्रिमसन सक्रियण)। प्रत्येक जानवर को 561 एनएम प्रकाश के साथ 4 बार उत्तेजित किया गया था। माप 561 एनएम प्रकाश की प्रत्येक पल्स से पहले और बाद में एकत्र किए गए थे। (एफ) 561 एनएम प्रकाश की प्रत्येक पल्स से पहले और बाद में जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस का प्लॉट। जीसीएएमपी 6 एस प्रतिदीप्ति को 561 एनएम प्रकाश की प्रत्येक पल्स के बाद 1 एस मापा गया था। चूंकि नमूने सामान्य रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, इसलिए जीसीएएमपी 6 एस फ्लोरेसेंस की कई तुलनाओं को सही करने के लिए एक युग्मित गैर-पैरामीट्रिक फ्रीडमैन परीक्षण लागू किया गया था। एटीआर (+एटीआर, हरा) (*** पी = 0.0004, एन = 48 माप) या एटीआर (-एटीआर, ग्रे) (एनएस, महत्वपूर्ण नहीं, पी = 0.0962, एन = 48 माप) की अनुपस्थिति में उगाए गए कीड़े के लिए 561 एनएम प्रकाश उत्तेजना के बाद। इस आंकड़े को संदर्भ2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फाइल 2: एम 9 बफर की संरचना और तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एयरिस्कैन डिटेक्टर को डीडी स्पाइन के स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए चुना गया था क्योंकि यह पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप19,20 की तुलना में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। एयरीस्कैन इमेजिंग पारंपरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, जीएफपी, एमचेरी, आदि) के उपयोग की भी अनुमति देता है, जो अब सी एलिगेंस के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध है। यद्यपि उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों (जैसे, स्टॉर्म, एसटीईडी, पाम) के साथ प्राप्त किया जा सकता है, इन विधियों को फोटो-एक्टिवेबल या फोटो-स्विचेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन21 की आवश्यकता होती है। एयरिस्कैन के विकल्प के रूप में, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, Nyquist अधिग्रहण (चित्रा 3) के साथ इमेजिंग 123.9 nm के 40x/ 1.3 उद्देश्य का उपयोग करके पिक्सेल आकार प्राप्त करती है, जो रीढ़ की रूपात्मक प्रकारों को अलग करने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 2)।

रीढ़ की हड्डी के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, एक साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे (1) एमचेरी या जीएफपी, (2) लाइफएक्ट का उपयोग करके एक्टिन साइटोस्केलेटन को लेबल किया जाता है, या (3) प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 1 बी) को लेबल करने के लिए एक मायरिस्टोइलेटेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, एमवाईआर:: एमरूबी) की सिफारिश की जाती है। इसकी तुलना में, एफ-एक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन यूट्रोफिन रीढ़ घनत्व को कम करता है (चित्रा 1 सी), यूट्रोफिन को अधिक व्यक्त किए जाने पर स्पाइन मोर्फोजेनेसिस पर नकारात्मक प्रभाव का संकेत देता है।

वर्तमान इमेजिंग विधियों को आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान करने में मदद करनी चाहिए जो रीढ़ की आकृति विज्ञान 1,16 को नियंत्रित करते हैं। डीडी रीढ़ आकृति विज्ञान (यानी, पतली / मशरूम, फिलोपोडियाल, स्टब्बी, ब्रांकेड, चित्रा 2 देखें) का मूल्यांकन उदर तंत्रिका कॉर्ड पार्श्व छवियों के एकल 2 डी-अनुमानों से किया जा सकता है क्योंकि अधिकांश डीडी रीढ़ एक विशिष्ट रूप से उदर-निर्देशित अभिविन्यास को अपनाते हैं। इन तुलनाओं में, प्रत्येक स्थिति के लिए एक ही फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करना आवश्यक है क्योंकि स्पष्ट रीढ़ रूपात्मक प्रकार लेबलिंग विधि से प्रभावित होते हैं (उदाहरण के लिए, MYR:: mRuby vs। लाइफ एक्ट:: जीएफपी)। इसके अलावा, यह ध्यान दिया गया कि रीढ़ की हड्डी के आकार गतिशील हैं और बाहरी संकेतों 2,16 के जवाब में आकार बदलने की संभावना है। इस प्रकार, समान विकास चरणों में और समान परिस्थितियों में जीनोटाइप के बीच रीढ़ की हड्डी के आकार की तुलना करना भी आवश्यक है।

एलिगेंस वेंट्रल कॉर्ड का अभिविन्यास सटीक छवि अधिग्रहण के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। जानवर के विपरीत किनारों पर उदर और पृष्ठीय डोरियों दोनों को एक ही जेड-प्लेन में दिखाई देना चाहिए, यह दर्शाता है कि कीड़ा इसकी तरफ उन्मुख है (चित्रा 1 बी)। उदर कॉर्ड के पास अन्य कीड़े या बुलबुले के संपर्क में आने वाले कीड़े की छवियों को इकट्ठा करना सबसे अच्छा नहीं है, क्योंकि यह रीढ़ की छवियों को नीचा दिखा सकता है।

विवो कैल्शियम इमेजिंग में , प्रत्येक अधिग्रहण से तुरंत पहले ताजा स्लाइड तैयार करने की आवश्यकता होती है। केवल पतले गोंद फाइबर बनाम के संपर्क में कीड़े की छवि बनाना सबसे अच्छा है। गोंद के "ग्लब्स" जो कीड़े को विकृत करते हैं और छवि को नीचा दिखाते हैं (चित्रा 4 बी)। चित्रा 4 में दिखाए गए प्रयोग में, 561 एनएम प्रकाश की पल्स पूरे दृश्य क्षेत्र को सक्रिय करती है। स्थानीय सीए ++ ट्रांसिएंट्स का पता लगाने के लिए अस्थायी और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए, उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत डीडी स्पाइन के भीतर, 561 एनएम लेजर लाइन के लिए स्थापित एक गैल्वो मिनी स्कैनर का उपयोग रुचि के एक छोटे क्षेत्र को उत्तेजित करने के लिए किया जा सकताहै।

Disclosures

हम हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इमारिस पर इमेजिंग और विश्लेषण एनआईएच (सीए 68485, डीके 20593, डीके 58404, डीके 59637 और ईवाई08126) द्वारा समर्थित वेंडरबिल्ट सेल इमेजिंग शेयर्ड रिसोर्स (सीआईआरएस) में किया गया था। LSM 880 अनुदान 1S10OD201630 द्वारा समर्थित है। एक निकॉन स्पिनिंग डिस्क पर इमेजिंग निकोन सेंटर ऑफ एक्सीलेंस में किया गया था। हम प्रशिक्षण और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए जेनी शेफर, सीआईएसआर निदेशक और ब्रायन मिलिस और बर्नेट प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं: डायलन बर्नेट, एडन फेनिक्स और निलय तनेजा सलाह के लिए। इस काम को डीएमएम (R01NS081259 और R01NS106951) के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान और एसीसी (18PRE33960581) के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinal (ATR) Sigma-Aldrich R2500-100MG Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson
diH2O MilliQ To prepare M9 buffer
Ethanol 100% Sigma 64-17-5 To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) To immobilize animals for imaging dendritic spines
ImageJ NIH (Schindelin J et al., 2012) Open source image processing software
KH2PO4 Fisher Bioreagents 7758-11-4 To prepare M9 buffer
Levamisole hydrochloride Sigma 16595-80-5 To immobilize animals for imaging dendritic spines
MgSO4 Fisher Chemical M63-500 To prepare M9 buffer
Microscope cover glass Fisherbrand 12542B To mount animals for microscopy acquisition
Na2HPO4 Fisher Scientific S369-500 To prepare M9 buffer
NaCl Fisher Chemical S671-3 To prepare M9 buffer
NIS Elements version 05.21 Nikon To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment)
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres Polysciences, Inc 15913-10 To immobilize animals for imaging Ca++ transients
Prism For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients
SeaKen ME agarose Lonza 50014 To make agarose pads to mount animals for imaging
Super Glue The gorilla company To immobilize animals for imaging Ca++ transients
Superfrost microscope slides Fisherbrand 22-034-980 To mount animals for microscopy acquisition
vaseline Covidien 8884430300 To seal sample for confocal snapshots
Wax Fisherbrand 23-021-399 Paraplast tissue embedding medium
Microscope for super-resolution imaging
LSM880 Zeiss
AiryScan detector Zeiss
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm
Laser lines
Stage controller
Microscope for Nyquist image acquisition
A1R Confocal Nikon
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm
488 nm, 16mW
561 nm, 17mW
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines
Spinning Disk Confocal Nikon
Andor DU-897 EMCCD camera
Spinning disk Head CSU-X1 Yokogawa
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm
488 nm, 65mW
561 nm, 86mW
525 nm (+/- 18 nm)
605 nm (+/- 35 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 175
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> में इमेजिंग डेंड्राइटिक स्पाइन
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Cuentas-Condori, A., Miller III, D.… More

Cuentas-Condori, A., Miller III, D. M. Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e62676, doi:10.3791/62676 (2021).

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